яворская
реклама
На правах рукописи ЯВОРСКАЯ Наталья Викторовна КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЛИЯНИЯ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ МЕМБРАНЫ ДЕТЕЙ С ПОРАЖЕНИЕМ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ 14.00.51. – восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия 14.00.16. – патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Томск – 2006. 2 Работа выполнена в Российской академии наук СО ГУ НИИ медицинских проблем Севера (г. Красноярск), на кафедре «Восстановительной медицины и курортологии с курсом ФПК и ППС» Государственной Медицинской Академии Росздрава (г. Красноярск). Научные руководители: заслуженный деятель науки России, заслуженный врач России, доктор медицинских наук, профессор Клеменков Сергей Вениаминович доктор медицинских наук, профессор Терещенко Вероника Петровна Официальные оппоненты: заслуженный врач РФ; доктор медицинских наук, профессор Заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Матвеева Людмила Александровна Удут Владимир Васильевич Ведущая организация: Российский Научный центр Восстановительной медицины и курортологии МЗ и СР РФ. Защита состоится «_____» _____________2006 года в_____часов на заседании специализированного ученого совета (Д. 208. 100. 01.) в Томском ГУ НИИ Курортологии и Физиотерапии Росздрава 634050, г. Томск, ул. Розы Люксембург, 1. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ Курортологии и Физиотерапии Росздрава, г. Томска. Автореферат разослан «_____» _________________2006 года Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук старший научный сотрудник Решетова Г.Г. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Распространенность заболеваний ЦНС в детском возрасте не только значительна, но и постоянно увеличивается [Алатырцев В.В.. Баканов М.И., 1990; Базилевская Т.Н., 2000; Боброва Л.В., 2000; Барашнев Ю.А., 2001]. По данным статистических исследований [Стат. Анализ показателей общей заболеваемости детского населения в г. Красноярске, Министерство городского здравоохранения, 2004] за 2002-2004 годы в Сибири отмечен рост неврологических поражений ЦНС с 63,4 до 87,8 на 1000 детского населения, а среди причин детской инвалидности патология нервной системы занимает первое место и составляет 30% [Боброва Л.В., 2000; Базилевская Т.Н., 2000]. Проблема реабилитации таких детей в настоящее время приобретает особенно важное значение [Незговорова И.В., 1994; Боброва Л.В., 2000; Петроченко И.А., 2000; Скворцов И.А., 2000; Науменко Л.Л., 2001]. Поражения ЦНС различного характера сопровождаются расстройством гемодинамики и метаболизма: угнетением синтеза белков нейронов, разрежением клеточных слоев нервной ткани, нарушением дифференцировки нейронов, причем имеются данные о наличие тесной взаимосвязи между указанными метаболическими нарушениями в нервных клетках и состоянием структуры клеточных мембран [Вайнер Г.Б., 1991; Сулейманова Ф.К., Баликин В.Ф., 1998; Петрушина А.Д., Левитина Е.В., 2000; Васильева Е.М., Баканов М.И., 2001]. Это согласуется с современными представлениями о большом значении в развитии патологического процесса биомембран, участвующих в большинстве регуляторных и метаболических реакций [Владимиров Ю.А., 2000; Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., 2004; Sten-Knudsen, 2002]. Отечественными и зарубежными исследователями найдены изменения структуры мембран эритроцитов при таких неврологических нарушениях, как детский церебральный паралич, органическое поражение ЦНС, перинатальная энцефалопатия, вегетативная дисфункция [Вайнер Г. Б., 1991, Агеева Т.С., Захарова Н.Б., Рассомахин А.А., 1994; Бондаренко Е.С., Зыков В.П., 1998; Баканов М.И., Васильева В.М., Гордеева Г.Ф., 2004]. Установлено, что в зависимости от формы заболевания у больных детей изменяется фосфолипидный состав эритроцитов, что связано с тяжестью клинического состояния и коррелирует с умственным 4 развитием детей [Гурина О.И., 1996; Горошинская И.А., Голотина Л.Ю., 1998; Mamontova M., Slobozhanina E., 1990; Dijkhuizen R.M., Knollema S., 2001]. Весьма актуальным представляется поиск методов коррекции нарушений на клеточном и субклеточном (мембранном) уровне, обнаруженных у детей с поражением ЦНС различного характера. В настоящее время лазерное облучение крови находит широкое применение в педиатрической практике [Пагава К.И., 1990; Курочкин А.А., Москвин С.В., Аникин В.В., 2000; Хан М.А, Чернышова Л.А., Конова О.М., 2003; Berlien H. P., 1990; Volotovskaya A. V., Kozlova N. M., Antonovich A. N., 2001]. Однако, остается неясным влияние лазеротерапии при поражении у детей центральной нервной системы, особенно на субклеточные структуры, в первую очередь реагирующих на лазерное облучение, что затрудняет патогенетическое обоснование применяемых методик и контроль за эффективностью лечения. В свете всего вышесказанного, изучение тонких механизмов патогенеза неврологических заболеваний на уровне плазматической мембраны, как возможной мишени для корригирующего воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на мембраны детей различного возраста при различных формах поражения ЦНС, является актуальным и предопределяет цель настоящего исследования. Цель исследования: изучить in vitro влияние гелий – неонового лазера на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов у детей с поражениями центральной нервной системы функционального и органического характера и выявить биофизические критерии реакции мембран на лазерное излучение. Задачи: 1. Изучить показатели молекулярной структуры и физико-химических свойств мембран эритроцитов у здоровых детей дошкольного и школьного возраста. 2. Определить характер и степень вовлеченности мембранных структур в патологический процесс при последствиях органического поражения центральной нервной системы (перинатальное поражение ЦНС, нейроинфекции) и выявить наиболее характерные признаки нарушения структуры мембран эритроцитов у детей различного возраста. 3. Изучить показатели молекулярной структуры и физико-химических свойств мембран эритроцитов у детей с функциональным нарушением 5 деятельности центральной нервной системы (синдромом вегетативной дисфункции). 4. Провести анализ воздействия НИЛИ на показатели структурнофункционального состояния мембран эритроцитов детей при различных формах поражения ЦНС. 5. Изучить дозозависимую инверсию фотомодифицирующего эффекта НИЛИ у детей с поражениями ЦНС и выявить биофизические критерии реакции мембран на лазерное излучение. Научная новизна результатов исследования. Впервые у больных детей дошкольного и школьного возраста с неврологическими заболеваниями различного характера (последствиями перинатального поражения ЦНС, перенесенными нейроинфекциями и синдромом вегетативной дисфункции) установлены признаки дезорганизации структуры мембран эритроцитов в виде обеднения мембран белковыми компонентами, что имеет огромную значимость в развитии недостаточности трофического обеспечения клеток крови и отражает процесс дизрегуляции обмена веществ. Наряду с этим обнаружено изменение подвижности и плотности упаковки мембранных липидов, выраженное в разной степени и направленности при отдельных нозологических формах поражения ЦНС. В целом мембраны эритроцитов детей с неврологическими нарушениями характеризуются дестабилизацией структуры белково-липидной матрицы мембраны и отличаются изменением физико-химического состояния мембраносвязанной воды. Впервые показано биостимулирующее действие гелий-неонового лазерного излучения на мембраны эритроцитов in vitro у детей разного возраста с различными нозологическими формами поражения центральной нервной системы. Выявлено наличие фотомодификации молекулярной структуры мембран в зависимости от характера патологического процесса и дозы воздействующего фактора. При этом выделены как универсальные (общие для всех форм поражения ЦНС) признаки воздействия НИЛИ, так и нозоспецифические реакции мембран эритроцитов, характерные для отдельных заболеваний. Практическая значимость работы. Установленные биофизические критерии дозозависимой реакции мембран эритроцитов на воздействие лазерного излучения позволяют на клеточном уровне индивидуально оценивать эффективность проведения 6 лазеротерапии у детей с перенесенными поражениями центральной нервной системы в дополнение к неврологическому обследованию, что повышает информативность такой оценки и качество лечения. Установленные корреляционные взаимосвязи между выраженностью клинических нарушений и структурой мембраны эритроцита при поражении ЦНС различного характера расширяют также диагностические возможности оценки характера и тяжести неврологического заболевания у детей различного возраста. Это даёт основание применять комплекс биофизических исследований мембран эритроцитов для уточнения вариантов динамики заболевания в процессе лазеротерапии и коррекции проводимого лечения. Внедрение результатов исследования. Разработанные методические рекомендации «Критерии оценки корригирующего действия лазерного излучения на структуру мембран эритроцитов» используются в практике врачами детского неврологического отделения МУЗ Городской детской больницы № 1 при проведении лазеротерапии у детей с последствиями поражения центральной нервной системы для более информативной оценки эффективности проводимого лечения на основе новых технологий, а также в работе неврологического отделения Городской больницы скорой помощи им. Н.С. Карповича г. Красноярска. Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре Восстановительной медицины и курортологии КрасГМА для обучения студентов основам клеточных механизмов действия лазерного излучения у детей разного возраста при заболеваниях центральной нервной системы. Апробация материалов диссертации. Материалы работы были представлены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний» (Москва, 2003); на итоговой научной конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2003); на Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004); на 3–й Республиканской научно-практической конференции «Вопросы профилактической медицины в регионах Крайнего Севера» (Надым, 2004); на итоговой научной конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2004); на «IV Всероссийской университетской научно - практической 7 конференции молодых ученых и студентов по медицине» (Тула, 2005); на итоговой научной конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2005). Публикации. По основным результатам исследования опубликовано 15 печатных работ, из них 2 в центральной печати. Личный вклад автора. Автором лично был собран материал исследования, проведено формирование групп больных, самостоятельно проведена биохимическая, статистическая обработка материала, написание статей и внедрение полученных данных в практику. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 184 страницах машинописного текста, содержит 47 таблиц и 39 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, двух глав с результатами собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография включает 374 литературных источника, в том числе 266 отечественных и 108 зарубежных. Положения, выносимые на защиту: 1. Структурно-функциональная организация и физико-химические свойства мембран эритроцитов имеют возрастную динамику, которая отражает процесс онтогенетического созревания и совершенствования клеточных структур и является исходным статусом мембраны у конкретных индивидуумов для проявления заболеваний ЦНС и корригирующего влияния НИЛИ. 2. Изменения структуры мембран эритроцитов в виде дестабилизации белково-липидных надмолекулярных комплексов, определяются как нозологической формой заболевания, так и возрастными особенностями детского организма, что создает различный исходный фон для воздействия НИЛИ. 3. Имеется качественно и количественно различная реакция мембран эритроцитов на воздействие НИЛИ у детей с функциональными и органическими формами поражения ЦНС. При этом реакция клеточных мембран носит как универсальный, общий для всех форм заболевания, так и нозоспецифический характер и зависит от дозы лазерного излучения. 8 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Наблюдались пациенты с поражением центральной нервной системы, поступавшие в детское неврологическое отделение городской больницы скорой медицинской помощи им. Н.С.Карповича города Красноярска. Поскольку различные формы поражения ЦНС имеют этиологическую, патогенетическую, клинико-морфологическую специфику, нами изучены эритроцитарные мембраны 3-х групп детей с заболеваниями ЦНС различного этиопатогенетического характера: 1-я группа – дети с последствиями перенесенного перинатального поражения ЦНС (ППЦНС). Это дети с указанием в анамнезе на ППЦНС без других каких либо выявленных этиологических факторов для имеющихся у них в настоящее время неврологических синдромов минимальной мозговой дисфункции. 2-я группа – дети с указанием в анамнезе на перенесенные инфекционные заболевания центральной нервной системы и имеющие в настоящее время проявления неврологической микросимптоматики. 3-я группа – дети с сидромом вегетативной дисфункции (СВД). Контрольная группа включала практически здоровых детей с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту. Всего под нашим наблюдением находилось 198 детей, из них 59 - здоровых (контрольная группа), 34 - с последствиями ППЦНС, 77 - с перенесенными нейроинфекциями и 28 детей с синдромом вегетативной дисфункции. Диагнозы последствий перинатального поражения ЦНС, перенесенных нейроинфекций и синдрома вегетативной дисфункции нервной системы устанавливались и формулировались совместно с врачами отделения с учетом классификации, изложенной в современной номенклатуре неврологических заболеваний (МКБ – 10) и подтверждались заведующим отделением. При верификации диагнозов последствий перинатального поражения ЦНС, перенесенных нейроинфекций и синдрома вегетативной дисфункции, учитывали результаты общеклинического, лабораторного и инструментального методов исследования. Для учета возрастных различий в показателях все обследованные дети были разделены на две возрастные группы – дети дошкольного возраста от 3 до 7 лет (30 здоровых, 18 с последствиями перинатального поражения ЦНС, 20 с 9 перенесенными нейроинфекциями) и дети школьного возраста от 8 до 15 лет (29 здоровых, 16 с последствиями перинатального поражения ЦНС, 57 с перенесенными нейроинфекциями и 28 с синдромом вегетативной дисфункции). Физико-химические характеристики эритроцитарных мембран исследованы методами флуоресцентной спектроскопии на основании рекомендаций Ю.А. Владимирова и Г.Е. Добрецова (1981). Исследование периферической крови проводилось при поступлении в стационар и до проведения какого-либо лечения (в том числе и лазеротерапии). Кровь забирали из локтевой вены в утренние часы после 12-часового голодания. В качестве консерванта использовали гепарин из расчета 0,1 мл на 10 мл крови. Затем кровь разделяли на три пробы по 1 мл и облучали гелийнеоновым лазером с =632,8 нм, с мощностью 10мВт, диаметром луча 8 мм в течение 5 минут (6 Дж/см2) и 15 минут (18 Дж/см2) на аппарате ASA BRAVO . Третья, контрольная проба оставалась необлученной. Мембраны выделялись по методу J.T. Dodge. Для исследования на спектрофлуориметре “Hitachi-МPF4” (Япония) использовали 50 мкл суспензии теней эритроцитов. Флуоресценцию триптофановых групп белков оценивали по свечению суспензии мембран эритроцитов при длине волны возбуждения 284 нм и длине волны флуоресценции 300 нм. Оценка содержания восстановленных пиридиннуклеотидов (НАДН2) была основана на характерных спектрах их флуоресценции при длине волны 460-480 нм. Результат выражали в единицах флуоресценции (ед. фл.). Измерение микровязкости и обратной ей величины – текучести проводили двумя методами: по степени эксимеризации пирена и по оценке анизотропии флуоресценции зонда 1-анилино-нафталин-8-сульфоната (АНС). Результат выражали в отн. ед. Исследование мембраносвязанной воды проводилось с помощью зонда диметиламинохалкона (ДМХ). Оценку степени дестабилизации плазматической мембраны проводили по методике Р.Р. Якубовой и А.В. Мурина (1990). Рассчитывали степень поляризации (P) и фоновой деполяризации мембраны (dP). Вычисляли коэффициент оптической лабильности: P/dP. Результаты выражали в отн.ед. Возможность связывания эритроцитарной мембраной положительно заряженных ионов кальция исследована с помощью 1 Мм водного раствора флуоресцентного зонда хлортетрациклина. Амплитуда флуоресцентного ответа использована как мера Ca2+- аккумулирующей способности клетки. Результаты выражали в отн. ед. 10 Математическая обработка. Статистическая обработка материала выполнялась на ПЭВМ. По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel 2000 была сформирована база данных, на основе которой с помощью пакета прикладных программ SPSS 10.0 и «STASTISTICА 6.0» производился статистический анализ c использованием методов параметрической статистики. Для всех данных определяли среднее арифметическое значение (М), среднее квадратичное отклонение (s), ошибку средней арифметической (m). Для исследования силы взаимосвязей показателей вычисляли коэффициент корреляции. Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенного исследования установлено, что показатели структурно-функционального состояния мембран эритроцитов здоровых детей изменялись в зависимости от возраста ребенка. В целом, мембраны детей старшего возраста были более гидратированы и проницаемы, меньше аккумулировали кальций, но больше содержали белковых молекул. Степень их текучести изменялась разнонаправлено в разных слоях мембраны, создавая с возрастом присущий мембране взрослого человека градиент текучести липидных макромолекул. Полученная динамика структуры и функции мембран эритроцитов у детей различных возрастных групп отражает процесс созревания и совершенствования мембраны, что обеспечивает высокий уровень метаболизма и энергетических процессов в клетках. Анализ показателей состояния эритроцитарных мембран детей при заболеваниях ЦНС установил структурно-функциональный дисбаланс в организации мембран эритроцитов у детей с поражением нервной системы функциональной и органической природы (синдром вегетативной дисфункции, последствия ППЦНС, перенесенные нейроинфекции) вследствие развития основного заболевания. Установлено, что характер и степень вовлеченности мембранных структур в патологический процесс при различных формах поражения ЦНС был различен, но имелись и общие признаки неспецифического характера: все дети с поражением ЦНС теряли белки мембран, независимо от возраста и характера заболевания и, таким образом, свойственная здоровым детям динамика в сторону обогащения биомембран белком, у больных детей стирается, что является признаком нарушения процесса созревания мембранных структур и структурнофункциональной незрелости плазматической мембраны. Обеднение мембран эритроцитов белковыми компонентами выявляет признаки недостаточности 11 трофического обеспечения клеток крови и отражает процесс дизрегуляции обмена веществ, вследствие нарушения функции ЦНС. Универсальным признаком поражения ЦНС оказалось также изменение топографии белковых групп биомембран в виде большей их погруженности в липидный бислой. Этот признак, отражающий серьезные структурные перестройки липопротеидных макромолекулярных комплексов мембран, встречался во всех изучаемых нами группах больных детей. Наряду с этим мембраны больных детей обогащаются одним из важнейших показателей гомеостатирования внутренней среды - восстановленными формами кофермента дегидрогеназ – НАДН2. За счет такого накопления может изменяться соотношение восстановленных и окисленных форм кофермента (НАДН/НАД+). Увеличение же соотношения НАДН/НАД+, связанное с окислительновосстановительным потенциалом клеток, наблюдается при недостатоке энергопродуцирующих процессов, что лежит в развитии дистрофических процессов в клетке. Текучесть мембранных слоев у больных детей при разной патологии меняется разнонаправлено, но обращает на себя внимание стойкий характер вовлеченности данного показателя в патологический процесс при поражении ЦНС. У школьников при всех заболеваниях также растет уровень мембраносвязанного кальция, а у детей дошкольного возраста этот показатель меняется разнонаправлено при отдельных видах патологии ЦНС. В то же время описанные выше характерные признаки изменения клеточных мембран при рассмотрении отдельно каждой формы поражения ЦНС были выражены в разной степени и в специфическом сочетании. Так, анализируя полученные данные о состоянии биомембран детей с последствиями ППЦНС, можно утверждать, что мембранные структуры эритроцитов крови больных детей обеих возрастных групп, помимо указанных выше общих признаков мембранопатий при всех формах поражения ЦНС, резко обедняются мембраноструктурированной водой (рис. 1), что наряду с потерей белковых молекул (рис. 2) свидетельствует о серьезной дезорганизации клеточных мембран у больных детей. Кальций-связывающая способность мембраны не изменяется у больных дошкольников и резко возрастает у детей школьного возраста с последствиями ППЦНС (с 2,17 ± 0,12 до 6,87 ± 1,79 отн. ед., Р 1-2 < 0,001). Степень текучести нарушается в разных слоях мембраны, причем текучесть глубоких слоев мембран уменьшается у детей всех возрастных групп (с 0,92 ± 0,03 до 0,72 ± 0,03 отн. ед., Р < 0,001), а микровязкость поверхностных слоев 12 1,2 Дети дошкольного возраста Дети школьного возраста 1 *** *** 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1. Дети дошкольного возраста Дети школьного возраста * 20 15 10 5 0 Здоровые дети Рис. Флуоресценция триптофанилов, ед. фл. Показатель подвижности воды, отн. ед. возрастает у детей 8 – 15 лет (с 0,28 ± 0,04 отн. ед. до 0,4 ± 0,01 отн. ед., Р < 0,05). Флуоресценция заряженного отрицательно зонда - АНС возрастает только у детей 3 – 7 лет (с 15,3 ± 0,5 до 22,15 ± 1,56 ед. фл., Р < 0,001). Значит, мембраны больных детей становятся тотально менее текучими и ригидными. Показатели Дети с последствиями ППЦНС гидратированности мембран эритроцитов у детей с ППЦНС, отн. ед. Здоровые дети Рис. 2. Дети с последствиями ППЦНС Флуоресценция триптофа- нилов в мембране эритроцитов, ед. фл. Примечание: *** - уровень значимости р < 0,001 **- уровень значимости р < 0,01, * - уровень значимости р <0,05. Таким образом, процесс нарушения структуры биомембран у больных детей различного возраста, обладающих разным уровнем зрелости метаболических и регуляторных систем, выражен в разной степени, и носит для части показателей разнонаправленный, неустойчивый характер, что соответствует разным проявлениям последствий поражения ЦНС на клеточно-молекулярном уровне в разные периоды развития организма ребенка. Ведущей особенностью мембран эритроцитов детей с перенесенными нейроинфекциями является снижение микровязкости поверхностных слоев мембран (с 0,4 ± 0,02 отн. ед. до 0,1 ± 0,01 отн. ед., Р < 0,001 у дошкольников и с 0,28 ± 0,04 отн. ед. до 0,11 ± 0,73 отн. ед., Р < 0,001 у школьников), то есть их разжижение, что не отмечалось при других формах патологии. Это совпадает с противоположным процессом в глубине липидного бислоя – увеличением ригидности, особенно выраженным у дошкольников (с 0,92 ± 0,03 отн. ед. до 0,72 ± 0,05 отн. ед., Р < 0,001). 13 Таким образом, мембраны эритроцитов детей с перенесенными нейроинфекциями становятся более асимметричными по признаку вязкости, теряя наиболее физиологичное соотношение подвижности и лабильности макромолекул. Все эти данные отражают последствия нарушения структуры мембраны в связи с развитием нейроинфекций у детей обеих возрастных групп. Выявлена большая выраженность изменений в структуре мембран эритроцитов у детей дошкольного возраста по сравнению со школьниками. Ряд показателей у детей школьного возраста практически не изменялись в отличие от показателей у детей дошкольников (флуоресценция АНС, текучесть в области белковолипидных контактов). Следовательно, в клеточных мембранах детей, перенесших нейроинфекции, наблюдается дестабилизация как липидного, так и белкового слоев мембран с признаками нарушения проницаемости и гидрофильности мембран. Такая дезорганизация структуры мембраны наиболее выражена у детей дошкольников, что отражает нарушение жизненно важные для клетки и организма в целом свойств мембран у детей данной группы. В отличие от перечисленных выше особенностей структуры мембраны при органических поражениях ЦНС, нами обнаружено, что характерной особенностью мембран эритроцитов детей с СВД является резкое увеличение кальция (с 2,17 ± 0,12 отн. ед. до 6,87 ± 1,79 отн. ед., Р < 0,01) и разжижение структуры мембраны в областях белково-фосфолипидных контактов (с 0,5 ± 0,03 отн. ед. до 0,6 ± 0,03 отн. ед., Р < 0,05). Они более оптически лабильны по сравнению с мембранами здоровых детей (с 6,95 ± 0,19 до 22,3 ± 1,43 отн. ед, Р < 0,001), что создает большие возможности для активации ферментно-рецепторных единиц мембран, чем в тотально ригидных мембранах детей с последствиями ППЦНС или асимметрично ригидными мембранами детей с перенесенными нейроинфекциями. Следовательно, в структуре мембран детей с СВД обнаруживаются элементы компенсаторного характера в большей степени, чем у детей с перенесенной органической патологией ЦНС. Таким образом, выявлен структурно-функциональный дисбаланс в организации мембран эритроцитов у детей с заболеваниями ЦНС функциональной и органической природы вследствие развития основного заболевания. Дезорганизация структуры мембраны наиболее выражена у детей с органической патологией и затрагивает как белкую часть мембранного комплекса, так и липидные структуры. 14 Рассматривая мембрану эритроцита как модель, отражающую свойства всех биомембран в организме и особенно нейрональную мембрану вследствие сходства их свойств [Вайнер Г. Б., 1991; Сулейманова Ф.К., Баликин В.Ф., 1998; Петрушина А.Д., Левитина Е.В., 2000; Васильева Е.М., Баканов М.И., 2001], можно полагать, что потеря мембранными структурами функциональных групп белков, либо изменение их топографии по отношению к липидам может создавать биохимическую и физико-химическую основу для нарушения передачи сигналов между нейронами, тесно связанную с фосфорилированием определенных белков [Ткачук В.А., 1998; Morgan C.P. et all., 2004; Troy A. et all., 2005]. Недостаток количества белка, либо недоступность его молекул вследствие повышенной их погруженноти в липидный бислой оказывает влияние и на биохимические процессы в цитоплазме нейронов. Согласно данным литературы, подобными эффектами и обусловлено модулирующее влияние ряда факторов и заболеваний на функции нервных клеток [Петрушина А.Д., Левитина Е.В., Халитов М.Ш. и др., 2000; Christian H. et all., 2005; I. Mader et all., 2005]. Такие изменения могут нарушать жизненно важные для клетки и организма в целом, функции мембран, в том числе нервных клеток, являясь проявлением сложных состояний нервной системы, что обусловливает необходимость применения комплексных коррекционных мероприятий. Анализ корреляционных взаимосвязей показал наличие отрицательной корреляционной зависимости между степенью погруженности белков в липидный бислой и частотой встречаемости менингеальных знаков (r=-0,45; р<0,001), оболочечного (r=-0,44; р<0,001) и судорожного (r=-0,27; р<0,05) синдромов у детей с последствиями нейроинфекций школьного возраста. Обратная корреляционная связь обнаружена между текучестью липидного бислоя в области белково – фосфолипидных контактов (r=-0,48; р<0,05), микровязкостью поверхностных слоев мембраны (r=-0,471; р<0,05), оптической поляризацией мембраны (r=-0,516; р<0,05) и судорожным синдромом у дошкольников с перенесенными нейроинфекциями. Прямая корреляционная связь обнаружена между микровязкостью поверхностных слоев мембраны и головокружениями у детей с СВД (r=0,395; р<0,05). Также прямая корреляционная взаимосвязь выявлена между микровязкостью поверхностных слоев мембраны и гиперкинетическим синдромом у школьников с последствиями ППЦНС (r=0,609; р<0,05). 15 Таким образом, изменение мембранной структуры при различных формах поражения ЦНС определяется как этиопатогенетической формой заболевания, так и возрастными особенностями детского организма, что создает различный исходный фон для воздействия НИЛИ. Этим определяется качественно и количественно различная реакция мембран эритроцитов на воздействие НИЛИ у детей изучаемых групп. При этом реакция клеточных мембран носит как универсальный, общий для всех форм заболевания, так и нозоспецифический характер. Для выявления универсальных признаков воздействия лазерного излучения на структуру мембран эритроцитов у детей с различной патологией ЦНС нами проведен сравнительный анализ отдельных показателей при всех изучаемых заболеваниях. Степень погруженности белков в липидный бислой мембран эритроцитов при всех изучаемых заболеваниях и у детей всех возрастных групп, кроме детей дошкольного возраста с последствиями ППЦНС, увеличивалась через 5 минут воздействия НИЛИ, но в дальнейшем понижалась. Таким образом, данный показатель можно считать универсальным маркером воздействия НИЛИ на структуру мембран эритроцитов. Нозоспецифическим для реакции мембран эритроцитов на воздействие НИЛИ у группы детей с перенесенными нейроинфекциями является особая стойкость изменений липидной матрицы мембраны в ее глубоких углеводородных слоях, что регистрируется по неизменности показателя при любой дозе воздействия НИЛИ и у детей всех возрастных групп. Нозоспецифическим для реакции мембран эритроцитов на воздействие НИЛИ у группы детей с СВД является повышение до контрольного уровня флуоресценции АНС через 15 мин воздействия НИЛИ (рис. 3). Такое нормализующее влияние лазерного излучения на данный показатель обнаружено только у детей с СВД. Остальные показатели у этой группы детей изменялись в том же направлении, как при других заболеваниях. То-есть, при данной форме заболевания обнаружено преимущественное влияние на поверхностные структуры, а именно на электро-химические свойства мембран, учитывая, что АНС является отрицательно заряженным зондом, реагирующим на поверхностный потенциал плазматической мембраны. Флуоресценция АНС, ед. фл. 16 25 * 20 *** 15 10 5 0 ети И ЛИ ые д ия Н в в о т р с ей Здо возд Без ин И5м НИЛ И 15 НИЛ мин Рис. 3. Динамика флуоресценции отрицательно заряженного зонда-АНС у детей с СВД до и после воздействия НИЛИ in vitro. Примечание: - показано достоверное различие между группами после воздействия НИЛИ (р < 0,001, p < 0,01 , p < 0,05 - ). Дети дошкольного возраста Дети школьного возраста Текучесть липидного бислоя мембраны, отн. ед. 1,2 1 *** 0,8 *** * 0,6 0,4 0,2 0 И и дет НИ Л вия вые т о с р й де Здо воз Без НИ Л И5 мин НИ Л И 15 мин Рис. 4. Динамика текучести липидного бислоя мембран эритроцитов у детей с последствиями ППЦНС до и после воздействия НИЛИ in vitro. 17 Для детей же с последствиями ППЦНС наиболее характерным признаком влияния НИЛИ оказалась реакция более глубоко расположенных участков мембран в глубине липидного бислоя, где выявлено достоверное повышение сниженной первоначально текучести (рис. 4) через 15 мин лазерного воздействия. Восстанавление структурной организации мембран эритроцитов было более выражено у детей школьного возраста и при функциональных формах поражения ЦНС. В отношении влияния дозы воздействия НИЛИ на мембраны эритроцитов нужно отметить, что наиболее выражено и достоверно дозозависимое действие НИЛИ [=632,8 нм в при t = 18 ± 2°C при 5минутах (6 Дж/см 2) и 15 минутах (18 Дж/см2) воздействия] обнаружено в отношении двух показателей состояния мембран эритроцитов. Так, у детей с перенесенными нейроинфекциями школьного возраста сниженная проницаемость достоверно изменялась в зависимости от дозы: при воздействии в течение 5 минут она повышалась, но еще не достигала контроля, а через 15 минут достоверно увеличивалась до нормальных значений. В отношении другого показателя – флуоресценции заряженного зонда-АНС – также отмечено достоверное его повышение по сравнению с реакцией мембран на 5-минутное воздействие и нормализация показателя. Таким образом, показатели проницаемости мембран эритроцитов и флуоресценции зонда АНС, (реагирующего на поверхностно расположенные в мембране заряды) можно считать маркерами дозозависимой реакции мембран на воздействие НИЛИ. Выявленные биостимулирующие структурные изменения мембран эритроцитов могут лежать в основе положительных лечебных эффектов НИЛИ при комплексном лечении поражений ЦНС, что согласуется с клиническими исследованиями других ученых, проводивших исследование влияния НИЛИ в той же дозировке, но у взрослого контингента без учета возрастных особенностей ребенка и специфики отдельных нозологических форм поражения центральной нервной системы. 18 ВЫВОДЫ 1. Мембраны эритроцитов здоровых детей 8-15 лет более гидратированы и проницаемы по сравнению с мембранами эритроцитов детей 3-7 лет, меньше аккумулируют кальций и больше содержат белковых молекул, что отражает процесс возрастного созревания организма ребенка и его субклеточных структур. 2. У детей с последствиями ППЦНС и перенесенными нейроинфекциями отмечено уплотнение мембраны эритроцита в разных ее слоях и увеличение ее проницаемости. Мембраны же детей с синдромом вегетативной дисфункции были более жидкие, как в глубоких, так и в поверхностных слоях, и оптически более лабильны на фоне сниженной проницаемости мембранных структур. 3. Характерными признаками воздействия НИЛИ на мембраны эритроцитов, которые наблюдались при всех формах заболеваний ЦНС, было погружение свободно плавающих белков в липидный бислой при кратковременном действии НИЛИ и их перемещение к поверхности мембраны через 15 минут воздействия, что приближает архитектонику мембраны к более физиологическому состоянию. Это сочеталось с нормализующим действием НИЛИ на повышение текучести в глубине липидного бислоя, проницаемость мембран и флуоресценцию заряженных зондов. 4. Восстанавление структурной организации мембран эритроцитов под ввлиянием НИЛИ было более выражено у детей старшей возрастной группы и при функциональных формах поражения ЦНС. 5. Установленная зависимость увеличения показателей проницаемости мембран эритроцитов к каналообразующему зонду нистатину и величины флуоресценции отрицательно заряженного зонда (АНС) от времени воздействия НИЛИ in vitro позволяет расценивать данные показатели как маркеры дозозависимой реакции мембран на лазерное излучение. 19 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. В процессе реабилитации детей с последствиями поражения центральной нервной системы функционального и органического характера воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения, наряду с неврологическим обследованием, рекомендуется проводить оценку корригирующего действия НИЛИ на структуру мембран эритроцитов для установления характера индивидуальной реакции клеточных мембран ребенка, являющихся мишенью для лазерных лучей, и определения эффективности проводимой терапии. 2. Для оценки корригирующего воздействия лазеротерапии у детей с последствиями поражения центральной нервной системы предлагается использовать разработанные биофизические критерии: уровень флуоресценции заряженного зонда-АНС и проницаемость мембран эритроцитов, дозозависимо отражающие изменение молекулярной структуры мембран при воздействии лазерных лучей. Практическому здравоохранению предлагаются методические рекомендации по обоснованию и выполнению спектрофлуориметрических методов определения флуоресценции биофизических маркеров реакции мембран эритроцитов на лазерное излучение, доступные для выполнения в лечебных учреждениях на отечественных спектрофлуориметрах. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Яворская, Н.В. Опыт применения низкоинтенсивной лазеротерапии в педиатрической практике на базе детского неврологического отделения ГБСМП им. Н.С. Карповича / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итог. науч. конф. – Красноярск, 2003. – С. 271 – 273. 2. Яворская, Н.В. Опыт применения полизональной низкоинтенсивной лазеротерапии при лечении заболеваний ЛОР – органов в педиатрической практике / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко // Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний: материалы докладов. – М., 2003. – С. 138 – 139. 3. Яворская, Н.В. Опыт применения низкоинтенсивной лазеротерапии в неврологической практике у детей различного возраста на базе детского 20 неврологического отделения / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко // Вопросы профилактической медицины в регионах крайнего Севера: 3 - я Республик. науч. – практич. конф. – Надым, 2004. – С. 261 – 262. 4. Яворская, Н.В. Определение воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на структуру мембраносвязанной воды у детей с перинатальными поражениями центральной нервной системы / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Вопросы профилактической медицины в регионах крайнего Севера: 3 - я Республик. науч. – практич. конф. – Надым, 2004. – С. 218 – 219. 5. Яворская, Н.В. Применение низкоинтенсивной лазеротерапии в неврологической практике у детей различного возраста / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко // Компенсаторно – приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: материалы всероссийской конф. – Новосибирск, 2004. – С. 322 – 323. 6. Яворская, Н.В. Влияние лазерного излучения на структуру мембраносвязанной воды у детей с перинатальными поражениями центральной нервной системы / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Компенсаторно – приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: материалы всероссийской конф. – Новосибирск, 2004. – С. 411 – 412. 7. Яворская, Н.В. Микровязкость поверхностных слоев липидов в мембранах эритроцитов у детей различного возраста, здоровых и больных перинатальным поражением ЦНС / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итог. науч. конф. – Красноярск, 2004. – С. 142. 8. Яворская, Н.В. Основные изменения мембраны эритроцитов по флуоресценции триптофанилов у детей разного возраста, здоровых и больных перинатальным поражением ЦНС / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итог. науч. конф. – Красноярск, 2004. – С. 142 – 143. 9. Яворская, Н.В. Текучесть глубоких слоев липидов в мембранах эритроцитов у детей различного возраста, здоровых и больных перинатальным поражением ЦНС / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итог. науч. конф.– Красноярск, 2004. – С. 143 – 144. 10. Яворская, Н.В. Флуоресценция триптофаниловых групп белков мембраны эритроцитов у детей с вегетативной дисфункцией / Н.В. Яворская // IV 21 Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов по медицине. – Тула, 2005. – С. 242 – 243. 11. Яворская, Н.В. Характеристика показателей структурно-функционального состояния мембран эритроцитов у здоровых детей разного возраста / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная, О.И. Зайцева // Успехи современного естествознания. - 2005. - № 4. – С. 88 – 89. 12. Яворская, Н.В. Влияние лазерного излучения на некоторые параметры структуры мембран эритроцитов у детей с перинатальными поражениями ЦНС / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Лазерная медицина. – 2005.Т. 9. – Вып. 2. – С. 24 – 26. 13. Яворская, Н.В. Воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения на эритроциты детей с последствиями перенесенных нейроинфекций / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итог. науч. конф. – Красноярск, 2005. – С. 287 – 288. 14. Яворская, Н.В. Текучесть мембранных молекулярных комплексов у детей с вегетативной дисфункцией / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итог. науч. конф. – Красноярск, 2005. – С. 344 – 345. 15. Яворская, Н.В. Структурные изменения белковых компонентов мембраны эритроцитов у детей с вегетативной дисфункцией / Н.В. Яворская, В.П. Терещенко, Т.А. Колодяжная // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: материалы итог. науч. конф. – Красноярск, 2005. – С. 345. Сокращения, встречающиеся в автореферате: АНС – 1-анилино-нафталин-8-сульфонат ГНЛ - гелий-неоновый лазер ДМХ - диметиламинохалкон НИЛИ - низкоинтенсивное лазерное излучение ППЦНС - перинатальное поражение ЦНС СВД - синдром вегетативной дисфункции ЦНС - центральная нервная система 22 Подписано в печать 15.12.2005. Бумага офсетная. Формат 60х84. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л.1,1 Тираж 100 экз. Заказ № 168 – 07 Отпечатано в типографии «Офсет», г. Красноярск, ул. Копылова,1
