Микро-РНК мозга при острых нарушениях мозгового

Союз педиатров России
Научный центр
здоровья детей РАМН
НИИ детской неотложной
хирургии и травматологии
ДЗ г. Москвы
Микро-РНК мозга при острых нарушениях
мозгового кровообращения и черепно-мозговой
травме у детей
Пинелис В.Г., Кузенкова Л.М., Рошаль Л.М.
Москва
2013 г.
Клеточные и биохимические изменения
Нарушения мозгового
кровообращения
(инсульт).
Черепно-мозговая травма
(ЧМТ)
Cниженное обеспечение мозга кислородом и глюкозой ведет к
аноксической деполяризации, во время которой происходит
повышение внеклеточного К+, Na+ и [Ca2+]
Увеличение концентрации глутамата в
синаптической щели в десятки раз
16
14
Yamamoto:
Acta
Neurochir
S75: 31-34
12
10
8
6
4
2
0
Day 1
Day 2
Day 3
Day 4
Глутамат – двуликий Янус :
нейромедиатор - нейротоксин
Glu
4.0
C
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
F
[Ca2+]i (Fluo-5N, F/Fo)
[Na+]i (SBFI, F340/F380)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
- Ca
1.0
0
1000 Time (s) 2000
Стойкое повышение [Na+]
i
ROI 8
1.6
Glu
28
1.4
24
1.2
FAD
20
1.0
16
NAD(P)H
0.8
12
0.6
8
0.4
4
NAD(P)H & FAD Fluorescence
[Ca2+]i (Rhod-FF Fluorescence)
ROI 7
ROI 7
- Ca
Rhod-FF
0
0.2
0
Развитие отсроченной
кальциевой дизрегуляции
(ОКД)
500
1000
1500
Time (s)
2000
2500
3000
Развитие второй фазы ОКД сопряжено с
вторичным падением [NADH] до
критического уровня и увеличением [FADН].
Использование флуоресцентных белков, экспрессирующих АТФ в
отдельном нейроне, позволило обнаружить значительное снижение
АТФ при действии глутамата
Ion
[ATP]i
ROI 1
ROI 1
FCCP
[Ca2+]i (X-rhod-FF, F/Fo)
5
0.9
0.8
4
0.7
3
0.6
2
0.5
[Ca2+]i
1
Glu
-Ca
0
0.4
0
20
40
Time (s)
60
[ATP]i (AT1.03, Ex440/Ex480; Em525)
6
МикроРНК
• МикроРНК – молекула из
семейства малых
некодирующих РНК,
контролирующая
большинство функций клеток
в норме и патологии.
• Размер – 20-29 нуклеотидов
• 2000 микроРНК у человека
1. МикроРНК являются незаменимыми образованиями для клеток, т.к. они являются
регуляторами многих биологических процессов, таких как, например, развитие и
клеточная дифферециация. Животные, у которых не образуются микроРНК , или
погибают, или не дают потомства (Klosterman WP and Plasterk RH, 2006) .
2. Идентифицированы органные и клеточно-специфические микроРНК.
3. МикроРНК широко распространены в организме эукариот и у некоторых вирусов. Они
регулируют экспрессию более 30% генов, кодирующих информацию о структуре белков,
что делает их одними из наиболее важных генных регуляторов.
5. Роль микроРНК заключается не только в определении судьбы клеток и тканей, но и в
дифференциации и поддержании тканевой специфичности. Так, мозг-специфическая
микроРНК miR-134 контролирует образование шипиков в процессах. MiR-132 , присутствуя
в больших количествах в нейронах мозга, регулирует рост нейритов, ингибирование ее
уменьшает этот показатель; mir-223 отвечает за работу глутаматного рецептора.
Биогенез и механизм действия микроРНК
* Старокадомский П. Общий механизм процессинга микроРНК и реализации её активности., 2012. URL:
http://bio.fizteh.ru/student/biotech/2012/all_rna_29092012/p05-arph7oer046.jpg (дата обращения: 14.05.2013).
6
Хронология исследований
микроРНК
2001
1993
Описана первая
микроРНК, Lin-4
1998
Показано явление
РНКинтерференции
у C. elegans
Появление
термина микроРНК
(Science)
2006
Нобелевская
премия за
открытие РНКинтерференции
(Fire A. и Mello)
300
Всего 22 925 публикаций
по тематике микро РНК
Из них 796 статей об
исследованиях микроРНК
в нейронах в норме и
патологиии
число публикаций
250
200
150
100
50
0
2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Материалы и подходы для исследования мкРНК
Материал для исследования:
биоптаты ишемизированных участков мозга экспериментальных животных;
образцы первичных клеточных культур нейронов;
плазма крови.
Подходы:
Технология MicroRNA microarray platform для детекции
экспрессии мкРНК.
Технология количественной ОТ-ПЦР в реальном
времени для анализа профиля экспрессии мкРНК и
генов-мишеней
Технология глубокого секвенирования мкРНК
http://www.lcsciences.com/
http://www.thermoscientificbio.com
Технология трансфекции для
функционального анализа мкРНК
Профили экспрессии микроРНК при повреждении мозга
Повреждение мозга miRNA: upregulated miRNA:
downregulated
Ишемия/гипоксия
miR-10a, mir-182
miR-200b, miR-298,
miR-290, miR-145,
miR-206, miR-497,
miR-424, miR-223,
miR-132, mir-155
miR-362-3p, miR-223,
miR-210, miR-137,
miR-27a, miR-218,
Черепно-мозговая
травма
miR-223, miR-451,
,
miR-711, miR-292
miR-21
miR-107, miR-130a
miR-433-3p, miR-541,
Функциональная
значимость:
сигнальные пути
регуляции
Транскрипционная
регуляция
Апоптоз, воспаление
Ионный гоместаз,
клеточный цикл
Нейропротекция,
опухоли
нейрогенез
Глуутаматная
нейротоксичность,
Клеточная
дифференциация
Глиоз
Внутриклеточные
сигнальные пути
Madathil S, et al. (2011)
Повреждение мозга приводит к изменению профиля экспрссии микроРНК.
Приведены данные только значимых микроРНК (высокая степень валидизации),
определенных с помощью количественной ПЦР в реальном времени или
трансфекции с последующим иммуноблотингом
Иерархическое двумерное кластерирование данных экспрессии
микроРНК в ткани мозга и крови крыс при ишемии,вызванной
транзиторной окклюзией средней мозговой артерии.
Анализ профилей
экспрессии
микроРНК через 24
и 48 час после
ишемии выявил
специфичные для
ткани мозга и крови
микроРНК с
измененным
уровнем
экспрессии, среди
которых 10
являются общими
для всех
исследованных
образцов
Jeyaseelan K., et al, 2013
Фокальная ишемия мозга, вызываемая
фотохимически индуцируемым тромбозом
мозговых сосудов сенсомоторной области
коры.
Ишемия сенсоромот орной
област и коры мозга
МРТ мозга крысы через 24ч
после операции
Материалы и подходы для исследования мкРНК
Материал для исследования:
биоптаты ишемизированных участков мозга экспериментальных животных;
образцы первичных клеточных культур нейронов;
плазма крови.
Подходы:
Технология MicroRNA microarray platform для детекции
экспрессии мкРНК.
Технология количественной ОТ-ПЦР в реальном
времени для анализа профиля экспрессии мкРНК и
генов-мишеней
Технология глубокого секвенирования мкРНК
http://www.lcsciences.com/
http://www.thermoscientificbio.com
Технология трансфекции для
функционального анализа мкРНК
Двумерное кластерирование данных уровня экспрессии микроРНК в
мозге крыс через 24 и 48 часов после фототромбоза мозговых
сосудов сенсомоторной области коры.
Красный цвет соответствует увеличенной экспрессии мкРНК, синий соответствует
сниженной
экспрессии.
Овалами
показаны
выделяющиеся кластеры образцов ткани мозга крыс.
Усредненный уровень экспрессии микроРНК для двух кластеров
образцов коры мозга крыс через 24 часа после фототромбоза
мозговых сосудов сенсомоторной области коры.
Двумерное кластерирование данных уровня экспрессии мРНК в
мозге крыс через 24 и 48 часов после одностороннего
фототромбоза мозговых сосудов сенсомоторной области коры.
Красный цвет соответствует гиперэкспрессии мРНК, синий соответствует гипоэкспрессии мРНК
Гистограмма усредненного уровня экспрессии генов-мишеней
исследованных микроРНК в коре мозга крыс через 24 и 48 часов после
фототромбоза мозговых сосудов сенсомоторной области коры.
stat3
tp53
NEUROG3
Sox2
nfkb2
Notch3
Atoh
NEUROG2
neurod1
-3
-2
-1
0
1
2
ось Х - логарифм нормированного профиля экспрессии по основанию 2.
гиперэкспрессия - больше 1 (красный цвет), гипоэкспрессия - меньше одного
(синий цвет). Указанны значения - медианы.
1.
Выявлена
дифференциальная
экспрессия
микроРНК и регулируемых ими генов-мишеней в
ткани мозга при фокальной ишемии сенсомоторной
зоны коры головного мозга крыс.
2.
Гены-мишени с измененным уровнем
экспрессии вовлечены в процессы клеточной
гибели, воспаления и нейрогенеза, характерные
для ишемического повреждения ткани мозга.
3.
Планируется разработка диагностической
панели для получения профилей экспрессии
микроРНК в плазме крови у детей с нарушениями
мозгового кровообращения и ЧМТ.
4.
Планируется
исследовать
влияние
нейропротекторов
на
профили
экспрессии
микроРНК и генов-мишеней на клеточных и
животных моделях ишемии/гипоксии. ..
Участники исследования
Научный центр здоровья детей РАМН
Пинелис В.Г., Сурин А.М., Бобров
М.Ю.,. Гусар В.А.,Тимофеева А.В.,
Жанин И.С.
НИИ неотложной детской
хирургии и травматологии
ДЗ г. Москвы
Рошаль Л.М., Семенова Ж.Б.
НИИ молекулярной генетики РАН
акад. Мясоедов Н.Ф., Шрамм С.И.
Благодарю за внимание!
Биогенез микроРНК
Предшественник микроРНК
образуется из геномной ДНК, в
результате чего появляется
промежуточная форма — примикроРНК. В при-мкРНК
образуется петля, которая
подвергается двухстадийной
обработке: вначале эндонуклеаза
Drosha отрезает шпильку- премикроРНК. Она экспортируется в
цитоплазму, где узнается
ферментом Dicer. Он отрезает
петлю от пре-мкРНК и
получается структура зрелой
мкРНК, которая включается в
состав комплекса RISC. При
полной комплементарности
мкРНК происходит деградация
мРНК, а при неполной
ингибирование трансляции.
Профили экспрессии микроРНК и генов-мишеней
(онтология) при ‘экспериментальной ЧМТ
Zhonghua Hu, et al.,
2012
Результаты исследования
указывают на то, что
экспрессия многих
микроРНК зависит от
времени после
возникновения ЧМТ и
имеет место
кооперативная регуляция
внутриклеточных
сигнальных путей,
степень которой зависит
от тяжести повреждения
мозга
Профиль экспрессии мРНК в коре мозга крыс через 24 часа
после фототромбоза мозговых сосудов
МикроРНК – это эндогенные, короткие до 22 нуклеотидов РНК, которые
регулируют экспрессию генов на транскрипционном и трансляционном
уровнях. Они составляют большое семейство генных регуляторов,
контролирующие практически все функции клеток в норме и патологии.
Функции микроРНК
1. МикроРНК являются незаменимыми образованиями для клеток, т.к. они
являются регуляторами многих биологических процессов, таких как,
например, развитие и клеточная дифферециация. Животные, у которых не
образуются микроРНК , или погибают, или не дают потомства (Klosterman WP
and Plasterk RH, 2006) .
2. МикроРНК обязательно участвуют в возникновении определенного
клеточного и тканевого фенотипов как в норме, так и в патологии (Jeyaseelan
R., et al, 2007).
3. Идентифицированы органные и клеточно-специфические микроРНК.
4. МикроРНК широко распространены в организме эукариот и у некоторых
вирусов. Они регулируют экспрессию более 30% генов, кодирующих
информацию о структуре белков, что делает их одними из наиболее важных
генных регуляторов.
5. Роль микроРНК заключается не только в определении судьбы клеток и
тканей, но и в дифференциации и поддержании тканевой специфичности. Так,
в мозгу мозг-специфическая микроРНК miR-134 контролирует образование
шипиков в процессах. MiR-132 , присутствуя в больших количествах в нейронах
мозга, регулирует рост нейритов, ингибирование ее уменьшает этот показатель;
mir-223 отвечает за работу глутаматного рецептора.
Bramlett H and Dietrich WD, 2004