Восстановление экспрессии дистрофина в клетках mdx мышей при помощи
advertisement
Восстановление экспрессии дистрофина в клетках mdx мышей при помощи химеропласт-опосредованного пропуска экзона. Carmen Bertoni1, Catherine Lau1 and Thomas A. Rando1,2,* Author Affiliations 1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA and 2GRECC, VA Palo Alto Health Care System, Palo Alto, CA, USA Введение Миодистрофия Дюшенна и Беккера Х-сцепленные мышечные заболевания, вызванные дефектами в гене кодирующем дистрофин. Более 80% пациентов с МДД и МДБ имеют большие делеции в гене дистрофина с дупликациями, малыми делециями, включениями и точечними мутациями в остальных случаях. В общем, серьезный фенотип МДД вызван мутациями, такими как делеции нарушаюшие рамку считывания и точечными нонсенс мутациями, которые приводят к полному дефициту дистрофина. Более умеренный фенотип МДБ обычно коррелирует с делециями сохраняющими рамку считывания и с сохранением продукции усеченного, но функционального дистрофина. Это может быть использовано для терапии: переведение мутаций с нарушением рамки считывания в мутации без нарушения рамки считывания. Наиболее широко изучаемая стратегия по восстановлению экспрессии дистрофина в мышцах предполагает использование вирус опосредованной передачи ДНК. Этот метод эффективен у животных и дает надежду для использования у людей. Кроме того этот подход лечения применим при различных мутация при МДД, не только делециях. Однако, системы вирусной поставки столкнулись с проблемой иммунного ответа против векторов, проблемами связанными с интеграцией вирусного генома и регулированием экспрессии гена. Некоторые исследователи изучают возможность использования антисмысловых олигонуклеатидов для изменения транскриптов дистрофина для коррекции рамки считывания. Данная технология избегает некоторых трудностей вирусной поставки. Однако, этот метод требует повторной частой поставки олигонуклеатидов для достижения экспрессии дистрофина и длительной экспрессии транскриптов, как при использовании вирусных систем доставки. Привлекательный альтернативный пропуск экзона антисмысловыми олигонуклеатидами по восстановлению рамки считывания может быть стратегией модификации гена. Текушие стратегии восстановления гена могут быть применены к дистрофину, включая стратегии синтеза химерные олигомеры, простые переплетенные ДНК олигонуклеатиды и короткие фрагменты рекомбинантных гомологов. Восстановление гена химерными РНК/ДНК олигонуклеатидами базируется на активности таких векторов по преобразованию комплементарных пар оснований на геномном уровне. Механизм их действия основан на естественном механизме утилизации ошибочно соединенных пар оснований в клетке и направлен на замену одного основания в последовательности ДНК. Химеропласт-опосредованное восстановление гена успешно опробовано на различных типах клеток как in vitro, так и in vivo. Несмотря на то, что метод изучался по применению к точечным мутациям, химеропласт-опосредованное изменение соединения сайтов сплайсинга последовательности также имеет потенциал для изменения сплайсинга и восстановления рамки считывания в гене при других типах мутаций. В этой статье мы расскажем об исследовании возможности использования химеропласта по изменению сплайсинга гена дистрофина. Модель болезни, mdx мыши, имеют нонсенс мутацию в 23 экзоне гена дистрофина, что приводит к отсутствию белка дистрофина. Прежде мы показали, что химеропласт способен коррегировать точечные мутации как in vitro, так и in vivo. Мы протестировали изменение сплайсинга после пропуска экзона 23 при мутации одного основания в месте соединения интрона 22 и экзона 23. Соответствующий продукт, в котором экзон 22 соединен с экзоном 24, мог быть без смещения рамки считывания и синтезировать дистрофин почти во всю длину. Несмотря на то, что mdx мыши не имеют мутаций изменяющих рамку считывания, есть возможность исследовать насколько стабильно изменение одного основания в геномной ДНК может быть использовано для периориентирования сплайсинга для применения при мутациях со сдвигом рамки считывания в гене дистрофина. Мы установили, что изменение соединения интрона22 и экзона 23 производит транскрипты без сдвига рамки считывания, что приводит к образованию коротких форм дистрофина. Эти исследования расширяют возможность терапевтического примения химеропласт-опосредованного одноосновного исправления делеций со сдвигом рамки считывания. Результаты. Нацеленный химеропласт, названный MDX3 (Рис. 1 а), сконструирован заменой основания Г на Т в акцепторе сплайсинга экзона 23 в мышином гене дистрофина. Изменение основания при помощи MDX3 приводило к возникновению сайта рестрикции в этом положении. ( Рис. 1В)Предшествующая последовательность транскрипта, получившаяся в результате сплайсинга экзона 22 к экзону 24, не содержала сдвига рамки считывания приводила к синтезу протеина на 71 аминокислоту короче, чем нормальный дистрофин. Как контроль мы использовали химерный олигонуклеатид MDX4 (Рис. 1 А) синтезированный из оснований, комплементарных к последовательности интрон 22/экзон 23, и не имеющий активности в отношении геномной последовательности. Рисунок 1. Свидетельство химеропласт опосредованной замены одного основания на геномном уровне. Специфичность MDX3 к замене Г на Т в сайте сплайсинга интрона22/экзона23 была оценена используя ARMS анализ геномной ДНК. Культура клеток культивировалась в течение 15 дней после трансфекции химеропласта. Используя ПЦР праймеры, синтезированные специально для измененной последовательности, мы наблюдали специфическую амплификацию продуктов только в клетках, где проведена трансфекция химеропласта. В клетках контроля не было отмечено амплификации каких-либо продуктов. Рисунок 2. Изменение Г на Т при помощи нацеленного химеропласта также подтверждено прямой ПЦР. (Рис. 2В) Клетки после трансфекции культивированы 45 дней, а затем извлечена геномная ДНК. Для амплификации продуктов, содержащих интрон22/экзон23 точку сплайсинга, использованы специальные праймеры. После очистки, продукты ПЦР обработанныы с использованием Hinf I рестриктазы. Полученные продукты размером ∼50 и 100 bp показали, что нацеленный химеропласт вызывал замену одной пары оснований. Для дальнейшего анализа генной модификации мы использовали ПЦР амплификацию продуктов из инфецированных и контрольных клеток. Замена оснований обнаруживалась после одного раунда ПЦР и подтверждена после второго раунда амплификации только в клетках, обработанных MDX3 (Рис. 2С) Такие результаты подтверждены в 10 независимых эксперементах и подтверждены анализом последовательности. Экспрессия дистрофина в мышечных клетках mdx мышей, леченных химеропластом. Восстановление экспрессии дистрофина было оценено спустя 3 недели после трансфекции и 24–96 ч после индукции дифференцирования, как ранее описано. Вестерн-блоттинг с использованием антител к области прута дистрофина продемонстрировал по крайней мере два различных белковых продукта, молекулярные массы которых были меньше, чем дистрофин во всю длину (Рис. 3A). Антитела, направленные к C-терминальной области, подтвердили экспрессию этих двух продуктов, но также показали наличие третьего белкового продукта еще более низкой молекулярной массы (Рис. 3A). Основанные на специфичности антител, большие продукты содержали область экзонов 31/32, в отличии от меньших продуктов. Возможно получить только грубое приближение молекулярных масс этих продуктов, их размер. Все белки передвигались быстрее, чем дистрофин или утрофин, таким образом устанавливая 400 килодальтонов как верхний предел их размеров, и все белки передвигались медленней, чем самый высокий маркер молекулярной массы 200 килодальтонов, таким образом устанавливая более низкий предел. Два более высоких (Рис. 3A) образца молекулярной массы передвигались ближе к концу 400 килодальтонов, и образцы с более низкой молекулярной массой передвигались ближе к концу 200 килодальтонов. Эта структура белков дистрофина была получена в пяти независимых экспериментах и была подтверждена иммунопреципитацией. Кроме того, эта структура экспрессии присутствовала в культурах клеток, полученных из MDX3-инфицированных миобластов, которая поддерживалась в культуре в течение максимум 3 месяцев после трансфекции, подтверждая, что эффект лечения химеропластом был устойчиво унаследован. Рисунок 3. Мы ранее использовали вестерн-блот-анализ, чтобы количественно определить уровень экспрессии дистрофина в культурах mdx клеток, обработанных химеропластом, таким образом обеспечивая меру эффективности конверсии гена. В этом текущем исследовании, однако, наличие многократных полос при вестерн-блотт анализе сделало этот метод более трудным. Как альтернативный подход, мы построили стандартную кривую, используя смесь экстрактов из C57 и mdx миоцитов, чтобы определить предел нашей способности обнаружить белковую экспрессию вестернблот-анализом. Согласно этим исследованиям, дистрофин мог быть обнаружен пока процент дистрофинположительных клеток был больше, чем 1%. Таким образом мы пришли к заключению, что эффективность единственной замены основания, была в диапазоне 1–5%. Этот диапазон подобен тому, о котором ранее сообщали для химеропласта, разработанного, чтобы исправить mdx мутацию. Экспрессия некоторых форм дистрофина в субпопуляции MDX3-инфицированных клеток была также подтверждена иммунным окрашиванием. Согласно результатам вестерн-блоттинга, мы наблюдали группы дистрофинположительных волокон после дифференцирования только в MDX3-инфицированных клетках (Рис. 3B). Иммунное окрашивание леченных клеток с определенными для антителами подтвердило наличие внутренне удаленных форм дистрофина в мышечных клетках, полученных из MDX3-инфицированных- клеток (Рис. 3C), тогда как культуры, полученные из неинфицированных вирусом клеток или из MDX4-инфицированных-вирусом клеток, не окрашивались положительно ни с одним из антител. В культурах мышечных клеток, полученных из MDX3инфицированных клеток, групп мышечных трубочек, окрашенных положительно антителами против Cтерминальной области и области экзона 31/32, но ни одна из мышечных трубочек, окрашенных положительно антителами против экзона 26 (Рис. 3C). Эти данные совместимы с данными вестерн-блоттинга, указывая, что изменение области интрона 22/экзон 23 заканчивается пропуском многократных экзонов, не только экзона 23 (Рис. 3A). Многократный пропуск экзона, как наблюдали другие исследователи, использующие антисмысловые олигонуклеатиды. Восстановление экспрессии α-дистрогликана. Было показано, что экспрессия α-дистрогликана (α-DG), главного компонента комплекса дистрофин-гликопротеида, уменьшена на 80–90% у mdx мышей из-за нехватки дистрофина. Мы поэтому использовали иммунное окрашивание, чтобы определить, могли ли бы белки, произведенные разрушением интрона 22/экзон 23 соединения, восстановить экспрессию α-DG. Иммунное окрашивание MDX3-инфицированных культур, которые дифференцировались в течение 4 дней, подтвердило локализацию α-DG в мембране мышечных трубочек (Рис. 4). Эти результаты ясно демонстрируют, что по крайней мере один из произведенных белков был функционален. Рисунок 4. Установление альтернативных продуктов индуцированных MDX3 Основанный на иммунном окрашивании и иммуноблот-анализе, используя экзон- специфические антитела, мы идентифицировали продукты альтернативного сплайсинга. Мы использовали ПЦР анализ чтобы идентифицировать продукты альтернативного соединения, вызванные разрушением места интрона 22/экзон 23 в клетках, которые были поддержаны в культуре спустя 2 недели после трансфекции химеропласта. Мы проектировали определенные праймеры, охватывающие участок от экзона 22 до экзона 32 гена дистрофина. Продукты, представляющие транскрипты во всю длину, были амплифицированы от необработанных и химеропласт-леченных клеток, используя эти праймеры (Рис. 5). Мы были неспособны обнаружить любые альтернативно соединенные транскрипты в этой области в клетках, трансфектированных химеропластом(Рис. 5). Отсутствие альтернативных продуктов соединения было также подтверждено введением дополнительного шага амплификации. Рисунок 5. Мы расширили наше исследование на большую часть гена дистрофина, используя праймеры, которые охватили участок от экзона 9 до экзона 50 (Рис. 6A), таким образом покрывая почти 50% всей ДНК гена дистрофина. Вторая амплификация была выполнена, используя пары праймеров (см. Материалы и Методы и Рис. 6A), расположенные в области транскрипта, усиленного в первом шаге. Мы наблюдали пять продуктов (маркировал ‘b’, ‘c’, ‘d’, ‘e’ и ‘f’) в MDX3-инфицированных клетках (Рис. 6B и C), и эта структура также наблюдалась в клетках, которые поддерживались в культуре в течение 3 месяцев после трансфекции. Ни один из этих продуктов никогда не обнаруживался в неинфицированных вирусом клетках или клетках, трансфектированных с контрольным химеропластом. Упорядочивание этих продуктов показало, что они представляли пять различных вариантов сплайсинга, каждый пропуск экзона 23 плюс дополнительные экзоны вверх и вниз от соединения интрона 22/экзон 23, с 26 экзонами (экзоны 12–37) пропущеными в самом маленьком продукте (Рис. 6C и D). Три из пяти вариантов сплайсинга (продукты ‘c’, ‘d’ и ‘f’) не нарушали рамку считывания (Таблица 1). Предсказанные последовательности аминокислот из этих транскриптов включили бы белки с массой между 271 и 350 килодальтонами (Таблица 1), совместимые с диапазоном, предложенным вестерн-блот-анализом (Рис. 3A). Рисунок 6 Праймер Альтернативный Рамка сплайсинг считывания F19–R32 Полная Размер Продукт последовательность альтернативного продукта 2100 bp 600 bp b F9–R32 3410 bp 900 bp с 11/28 F9–R32 3410 bp 1300 bp d 17/31 21/31 С нарушением рамки Без нарушения рамки Без нарушения рамки Размер предшествующего протеина - 331 kDa 346 kDa F9–R35in 3930 bp 700 bp е 12/34 F9–R43in 5100 bp 1100 bp f 11/38 С нарушением рамки Без нарушения рамки - 271 kDa Альтернативный сплайсинг вызванный MDX3 Поскольку меньшие транскрипты избирательно амплифицированны, интенсивность полос на гелях не отражает относительное изобилие транскриптов в клетке (см. Рис. 6B). Нормализация меньших продуктов к полному транскрипту таким образом оценила бы слишком высоко изобилие альтернативно соединенных транскриптов. Это выдвинуто на первый план фактом, что продукт во всю длину всегда одинаково амплифицируется, когда используются внутренние праймеры в пределах 1-2 КБ друг от друга (например. F19/R32 в Рис. 6B), использовались в ПЦР. С внутренними праймерами, все более и более отдаленными от друг друга (например. F9/R43in или F9/R50in), только альтернативно соединенные транскрипты амплифицированы. Это не происходило из-за неполной ретротранскрипции, так как транскрипт во всю длину всегда одинаково амплифицировался, когда мы использовали пары праймеров F22/R32 (данные, не показаны). Поэтому, этот тип анализа не обеспечивает данные, которые точно отражают уровни альтернативно соединенных транскриптов относительно транскрипта во всю длину. Неожиданное обнаружение многократных вариантов соединения, вызванных единственной заменой основания, принудило нас исследовать другие сайты сплайсинга, специфичные сайты донора и акцептора для экзонов, которые заключали пропущенные экзоны для мутаций. Мы не ожидали это по двум главным причинам. Во-первых, не было никакого соответствия между последовательностями других сайтов сплайсинга и тем из соединения интрона 22/экзон 23. Таким образом не было бы никакого гомологичного соединения между MDX3 и любым из тех сайтов сплайсинга, которые могли бы вести к основным изменениям. Во-вторых, MDX4 почти идентичен MDX3 и все же не вызывал дополнительного соединения. Таким образом это было бы необычно, если бы MDX3 был способен к стимулированию мутаций многократных, негомологичных сайтов сплайсинга вдоль гена дистрофина, тогда как у MDX4, отличающегося только единственным основанием от MDX3, не было активности вообще в стимулировании мутаций. Однако, основанный на структуре альтернативного соединения, идентифицированного в MDX3инфицированных клетках (Таблица 1), мы исследовали другие сайты сплайсинга на мутации. Мы амплифицировали донорские сайты сплайсинга 5 ′ экзонов и акцепторов для 3 ′ экзонов для каждого нового соединения отдаленных экзонов друг к другу. Кроме того, мы упорядочивали и сайты сплайсинга донора и акцептора для первого 'пропущенного' экзона или от 5 ′ или от 3 ′ области (см. Рис. 7 для примера). Амплификация была пройдена в два раунда ПЦР перед определением последовательности, как мы сделали для сайта сплайсинга интрона 22/экзон 23. Рисунок 7 показывает данные о последовательности для случая, в котором было добавочное соединение между экзоном 17 и экзоном 31 (продукт ‘d’ от Рис. 6 и Таблицы 1). Не было никакого признака изменения оснований в последовательности сайта сплайсинга или смежных последовательностях ни для одного места, даже после двух раундов амплификации. Идентичный анализ был сделан для продуктов ‘b’, ‘c’, ‘e’ и ‘f’ (Рис. 6 и Таблица 1), ни один из которых не приводил доказательства мутаций. Поэтому, единственная мутация, идентифицированная в гене дистрофина среди этих 25 сайтов сплайсинга, была единственной, предназначенной основой в интроне 22/экзон 23 границы. Эти данные предполагают, что мутации в единственном сайте сплайсинга могут иметь более широкие располагающиеся эффекты, чем пропуск единственного экзона в соединении сложного гена как дистрофин. Рисунок 7 Дискуссия Мы расширили терапевтический потенциал химеропласт-опосредованной замены одного основания от просто исправления точечных мутаций для восстановления рамки считывания при помощи основной конверсионной способности химерных олигонуклеатидов изменить соединение РНК. Этот подход был бы применим к преобразованию мутаций структуры (включая большие делеции). У людей был бы потенциал для преобразования тяжелого фенотипа МДД в намного более умеренный фенотип МДБ. Подобный результат - цель АО-опосредованного пропуска экзона, который был применен к мутациям и у мыши и у человеческого гена дистрофина. В то время как АО-опосредованный пропуск экзона давал обещание, у использования химеропласта было бы несколько преимуществ. Во-первых, исправления, вызванные химеропластом, встречаются на геномном уровне, таким образом избегая потребности поставить олинонуклеатиды непрерывно или синтезировать антисмысловые конструкции непрерывно в этих клетках, чтобы поддержать экспрессию дистрофина. Во-вторых, генное исправление может встречаться не только в зрелых мышечных волокнах, но также и в клетках предшественников мышц, которые участвуют в обслуживании мышц и репарации. Таким образом терапевтическая выгода была бы устойчива не только с точки зрения исправления на геномном уровне, но также и с точки зрения регенерации ткани, поскольку клетки предшественники мышц соединяются с существующими мышечными волокнами или друг с другом, чтобы сформировать новые мышечные волокна. В настоящее время эффективность преобразования - по крайней мере, на порядок величины ниже, чем было бы необходимо для прикладного терапевтического использования, и это остается одним из главных препятствий для этого типа технологии генотерапии. Наши результаты демонстрируют, что нацеленный химеропласт (MDX3) способен к стимулированию G--T преобразования в сайте сплайсинга интроне 22/экзон 23 гена дистрофина(Рис. 1B), и, таким образом, разрушению соединения экзона 22 к экзону 23. Однако, это геномное преобразование имело более широкие воздействия на сплайсинг пре-мРНК дистрофина и заканчивалось экспрессией многократных форм белка, некоторых с большими внутренними делециями. Анализ мРНК подтвердил наличие альтернативно соединенных транскриптов с числом исключенных экзонов в пределах от 11 - 27 (Рис. 6). Вестерн-блот-анализ с использованием антител к Cтерминальной области дистрофина, показывал наличие по крайней мере трех различных белковых продуктов (Рис. 3A). Иммунное окрашивание с использованием антител к различным частям дистрофина, подтвердило, что у произведенных белков были внутренние делеции (Рис. 3C). Представленные данные привели к неожиданному результату- мутация в единственном основании одного сайта сплайсинга могла изменить соединение более глобально в пределах гена дистрофина. Последовательность химеропласта, выбранная для этого эксперимента, не соответствовала никаким другим геномным последовательностям, проверенно по базе данных BLAST, таким образом гарантируя специфичность выбранного олигонуклеатида. Изменение даже единственного основания в химерном олигонуклеатиде резко уменьшает свою склонность вызвать основные преобразования. Таким образом не было бы никакой причины ожидать, что химеропласт, нацеленный на интрон 22/экзон 23, будет действовать на негомологичный сайт сплайсинга. Вдоль тех же самых линий было показано, что химеропласт, предназначенный для определенных геномных последовательностей, способен при стимулировании одно-основных преобразований в генах-мишенях, но не имеют никакой мутационной склонности даже в гене с очень гомологичной последовательностью. Таким образом, хотя мы не можем полностью исключить возможность, что у MDX3 могла быть мутационная активность в другом месте в геноме, очень маловероятно, что он вызывает основные преобразования специфично в сайте сплайсинга в гене дистрофина, у которого нет соответствия предназначенной последовательности. Однако, чтобы поддержать эти теоретические аргументы, мы непосредственно упорядочили все поврежденные сайты сплайсинга и нашли признак основного преобразования только в основании-мишени(Рис. 2C и 7). Кроме того, как отмечено ранее, любая гипотеза, что замена основания вызванная MDX3 происходит из-за мутаций большего количества сайтов, чем просто единственное основание в сайте сплайсинга интрон 22/экзон 23 , должна была бы принять во внимание факт, что у MDX4, идентичного MDX3 кроме единственного изменения пары оснований, не было склонности к подобным мутациям. Хотя MDX3 мог теоретически иметь эффект на РНК (например, активностью антисмыслового типа), возможность, что альтернативные продукты явились результатом постоянного действующего на синтез РНК химеропласта, исключена нашими долгосрочными результатами. Клетки делятся , и их количество увеличивается вдвое за время приблизительно 18 ч. Мы видим ту же самую структуру транскрипта и белковой экспрессии спустя 3 месяца после трансфекции, как и в течение 1 недели после трансфекции. Через 3 месяца количество химеропласта на клетку уменьшилось бы в 2120 раз со времени трансфекции, основанной исключительно на разбавлении, которое будет встречаться во время клеточного деления. Это соответствует 1×1036-кратному сокращению концентрации химеропласта, даже не принимая во внимание деградацию химеропласта в клетках, которая, вероятно, будет, по крайней мере, столь большой эффект на сокращение содержания химеропласта в клетке дает клеточное деление. Таким образом количество химеропласта в клетке через 3 месяца было бы так бесконечно мало. Мы поэтому приходим к заключению, что ни один из результатов не может быть объяснен постоянным воздействием химеропласта. Неясно, почему изменение единственного сайта сплайсинга на геномном уровне заканчивается экспрессией множественных продуктов, каждый с пропуском множественных экзонов и вверх и вниз исходного сайта сплайсинга. Этот феномен, однако, наблюдался в клинических случаях пациентов с МДД, у которых точечные мутации в сайтах сплайсинга приводят к пропуску многократных экзонов гена дистрофина. Изменение определенной последовательности интрона/экзона, содержащей регулирующие элементы для закрепления факторов сплайсинга, могло разрушить вторичную структуру, необходимую для скоординированного соединения многократных смежных экзонов. Зрелая РНК могла таким образом показать пропуск многократных экзонов и вверх и вниз от точечной мутации. Действительно, пропуск смежных экзонов наблюдался, когда процесс соединения разрушен изменением АО единственного сайта сплайсинга. У mdx мышей и у людей с МДД отмечено появление мышечных волокон, которые экспрессируют дистрофин (то есть по крайней мере часть дистрофина). Число этих так называемых ‘ревертантных’ волокон увеличиваются с возрастом, и установлено, что у таких форм есть внутренние делеции в пределах от нескольких экзонов до многих экзонов. Механизм этого явления неясен, но предпологается возникновение соматических мутаций. Недавние исследования показали, что ревертантные волокна в пределах единственной группы экспрессируют ту же самую форму дистрофина, из чего сделано предположение, что они получены из клонального деления единственной клетки предшественника мышцы, потомство которой с мышечными волокнами локально и дает тем волокнам способность экспрессировать белок с внутренними делециями. Хотя иммуногистохимический анализ указывает, какие экзоны удалены, эти исследования не исключают возможность, что экспрессируются множественные транскрипты, и таким образом множественные формы дистрофина. Действительно, переменная интенсивность окрашивания антителами совместима с этой возможностью. Наши результаты предполагают, что ревертантные волокна могли явиться результатом непосредственных, соматических мутаций в последовательностях сайтов сплайсинга. Такие мутации могли составлять переменную структуру транскриптов и белков, и появление сокращенных форм дистрофина, в котором многократные, смежные экзоны не выражены. Системная поставка олигонуклеатидов остается главным препятствием для клинического прикладного использования антисмысловых олигонуклеатидов или химеропласта. Однако, определение, что химеропластопосредованное преобразование оснований может вести к производству функциональных форм дистрофина, ободрительно для терапевтического подхода. Однако, наши результаты исследования демонстрируют, что намного больше работы необходимо, чтобы понять механизмы, которые регулируют генное соединение дистрофина, чтобы быть в состоянии предсказать эффект изменения сайта сплайсинга такого большого и сложного гена как дистрофин. Понимание механизмов, приводящих к производству множественных транскриптов, может пролить свет на нормальный процесс формирования ревертантных волокон, процесс, который может также иметь терапевтический прикладной подход. Ясно, что у модификации сплайсинга пре-мРНК есть большой потенциал как терапевтический подход к лечению МДД, и множественные технологии продвигают этот новый терапевтический подход. Матерьялы и методы Мыши. Мdx (C57BL/10ScSn-mdx) и C57(C57BL/10SnJ) мыши приобретены в лаборатории Джаксона Синтез химеропласта. Химерные РНК/ДНК олигонуклеатиды синтезировалась как ранее описано и была обеспечена Valigen Inc. (Newtown, Пенсильвания, США). Олигонуклеатиды были подготовлены с ДНК и 2 ′-O-метил РНК фосфорамидит мономеры нуклеозида на Незатрудненном Нуклеиновом Синтезаторе Помощи (Биосистемы PerSeptive, Фрэмингэм, Массачусетс, США), очищены HPLC и определены количественно спектральном анализом. Больше чем 95% очищенных олигонуклеатидов были определены во всю длину. Планирование химеропласта, названный MDX3 (Рис. 1A), был разработан, чтобы вызвать G--T преобразование в акцепторном сайте сплайсинга экзона 23 гена дистрофина, таким образом разрушая его последовательность (Рис. 1B). Контрольный химеропласт, названный MDX4 (Рис. 1A), отличается от MDX3 единственным основанием и не имеет никаких несоответствий сайту сплайсинга интрону 22/экзон 23. Культура клеток и трансфекция. Клетки были получены из мышцы конечности новорожденных mdx и C57 мышей как ранее описано (36). Для роста клетки были покрыты металлом на блюдах, покрытых 5 мкг/мл ламинина (Жизненная Технология Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), и поддержали в питательной среде, состоящей из питательной смеси F10 (Mediatech, Херндон, Вирджиния, США) подкрепленной 20%-ой эмбриональной бычьей сывороткой (Научная Омега, Тарзана, Калифорния, США) и пенициллином/стрептомицином (Mediatech). Клеточная дифференцировка была вызвана, поддерживая клетки в низкой серологической питательной среде (‘питательная среда дифференцирования’) состоящий из питательной среды модифицированного Орла Dulbecco (Mediatech), подкрепленный 2%-ой сывороткой лошади (Invitrogen) и пенициллином/стрептомицином. Mиобласты были расположены в блюда (1×105 клетки/хорошо) за 12 ч до трансфекции. Химеропласты (10 мкг) образовали комплекс с 1 мкл Lipofectamine 2000 (GIBCO/BRL) в течение 30 минут при комнатной температуре в суммарном объеме 0.5 мл F10. Комплекс был добавлен к колонкам, содержащим 1.5 мл питательной среды в течение 16 ч. Трансфекция была остановлена, заменяя раствор для трансфекции новой питательной средой. Вестерн блот анализ. Клетки были растворены в буфере RIPA (50-миллиметровые Тримараны-HCl, pH фактор 7.4, 150-миллиметровый NaCl, 0.5% deoxycholate и 1% Nonidet P-40) содержащий aprotinin (20 мкг/мл), leupeptin (20 мкг/мл), фенилметилсульфонил фторид (10 мкг/мл) и натрий ортованадат (1 мм) было определено Биорадиусом белковой пробой (Биорадиус, Геркулес, Калифорния, США). Для обнаружения дистрофина 350 мкг общего количества, из каждого образца, были отделены электрофорезом (10 мА в течение 15 ч) с использованием 5%-ых гелей SDS– полиакриламида, и затем перешли (250 мА в течение 7 ч) на нитроклетчаточные мембраны. Мембраны были обработаны при 4°C антителами, направленными к области прута (Mandys-8, 1:400; Сигма) или C-терминальной области (Dys-2, 1:50; Novacastra, Ньюкасл, Великобритания) как ранее описано. Мембраны были заблокированы с5%-ым молоком в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Пятна были вымыты в 0.05% Tween-20 в PBS и затем обработанныс пероксидазой и вторичными антителами против мыши (Amersham Pharmacia Biotech, Пискэтэуэй, Нью-Джерси, США). Определенные антитела были обнаружены, используя расширенную хемилюминесцентную систему (Amersham). ARMS анализ и анализ рестриктазы. Культивируемые миобласты были ополоснуты дважды с PBS, и геномная ДНК была извлечена, используя комплект извлечения ДНК (Промега, Мадисон, Висконсин, США) согласно инструкциям производителя. Для каждой реакции амплификации 500 нг полной ДНК, извлеченной из культур миобластов, были переварены в течение 2 ч в 37°C с Sal I или NotI, чтобы развернуть супернамотанную структуру ДНК как ранее описано. Обозначения и последовательности всех праимеров перечислены в Таблице 2. Для ARMS анализа мы использовали передовой праймер для интрона 22 [F (интервал) 22] и любой из двух обратных праймеров. Один, названный ‘w’, был определенным для интрона 22/экзон 23 сайтов сплайсинга и другой ‘m3’, был определенным для последовательности сайта сплайсинга после G-to-T трансверсии в нуклеотиде 3137 (см. Рис. 1B). Параметры настройки ПЦР и условия реакции были ранее описаны. Продукты ДНК фракционировались на 2%-ых гелях агарозы в буфере Tris-acetate/EDTA. Продукты ПЦР были очищены, используя Qiaquick (Qiagen Inc., Валенсия, Калифорния, США), и упорядочивание ДНК было выполнено, используя Прикладные Биосистемы, ABI377 Праймер Последовательность 5′–3′ Гомологичный регион F(int) 22AACTCATCAAATATGCGTGTTAGTG intron 22 1, 2 w GCTCTTTCAAAGAACTTTGCAGACC exon 23 1 m3 GCTCTTTCAAAGAACTTTGCAGACA exon 23 1 R23 CTGGCATATTTCTGAAGGTGC exon 23 2, 4 R32 GGCTGGTTTTTGGAATAATCG exon 32 3, 4 F22 GACACTTTACCACCAATGCG exon 22 3 F22in GGAGACAATGAGTAGCATCAGG exon 22 4 R24 CAGGGCAGGCCATTCCTCTTTC exon 24 4 R25 CTGCCCACCTTCATTAACAC exon 25 4 R30 GGACCTTTTCAATTTCCTGGGC exon 30 4 R33 CTGCTTTTTCTGTACAATTTGACG exon 33 3 R35out CTGGAGGTGACAGCTATCCAG exon 35 3 R43out CTTTCACCTTTTCCATGGAGG exon 43 3 R50out CCAGTAGTGCTCAGTCCAGGG exon 50 3 F8 GTGGAAATGTTGCCCAGGAC exon 8 3 F9 GTTATGCCTTCACACAGGCTGC exon 9 4 F19 GCAAGATGCCAGCAGATCAGC exon 19 4 R35in CTTGCCCAACACCATTTTCAAAG exon 35 4 R43in CAATCCGACCTGAGATTTGTTGC exon 43 4 R50in GGTTTACAGCCTCCCACTCAG exon 50 4 Таблица 2. ПЦР праймеры Анализ рестриктазы был выполнен на полной геномной ДНК. 200 нг геномной ДНК были подвергнуты амплификации, используя передовой праймер для интрона 22 [F (интервал) 22] и обратный праймер для экзона 23 (R23). Каждая смесь амплификации содержала 25 пмолей адекватного праймера, 10%-ого диметилсульфоксида, 0.5 полимеразы ДНК U Taq (Takara, Panvera Corp., Мадисон, Висконсин, США), и 5 мм каждого трифосфата дезоксирибонуклеотида. После начального шага денатурации при 95°C в течение 5 минут, амплификация была выполнена для 35 циклов в 95°C в течение 1 минуты, сопровождаемой, отжигом при 55°C в течение 3 минут, и 72°C для 2 минимальных реакций. Амплификация была закончена дополнительным шагом при 72°C в течение 10 минут. Продукты ПЦР были загружены на 2%-ом геле агарозы, и ожидаемые 150 продуктов усиления были извлечены из геля и очистили используя комплект Qiagen. Из 30 мкл повторно приостановленного продукта ДНК 5 мкл были подвергнуты второму раунду ПЦР с использованием тех же самых условий, ранее описанных с дополнением 10 мКи [32P] dCTP. Радиоактивные образцы были очищены, используя Amicon Microcon®-PCR (Корпорация Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США) и повторно растворены в 50 мкл H20. Десять микролитров были переварены в течение 1 ч в 37°C с Hinf I и загружены на 8% гель акриламида. Полосы визуализировались после прямого выделения геля. ОТ-ПЦР Полная РНК была извлечена из культивируемых мышечных трубочек, используя РЕАКТИВ ТРИМАРАНА (Сигма). Для каждой реакции 100 нг РНК смешивалось с 1 U дезоксирибонуклеазы I (GIBCO/BRL) при комнатной температуре. Обратная транскрипция и амплификация были выполнены, используя обратный праймер в экзоне 33 (R33), соединенный с передовым праймером в экзоне 22 (F22). Вложенный ПЦР был выполнен с 2 мкл первой реакции, используя передовой (внутренний) праймер в экзоне 22 (F22in) и обратные праймеры в экзонах 23 (R23), 24 (R24), 25 (R25), 30 (R30) и 32 (R32). Чтобы обнаружить альтернативные продукты соединения за пределами области между экзонами 22 и 32 (см. Рис. 6), ряд различной обратной транскрипции и первый раунд реакции амплификации были выполнены, используя обратные праймеры для экзонов 33 (R33), 35 (R35out), 43 (R43out) и 50 (R50out), соединенных с передовым праймером для экзона 8 (F8). Вложенный ПЦР был выполнен с передовыми праймерами в экзонах 9 (F9) и 19 (F19), соединенный с обратными праймерами в экзонах 32 (R32), 35 (R35in), 43 (R43in) и 50 (R50in). Амплификация была выполнена в 25 циклов при 94°C в течение 30 с, 55°C в течение 2 минут и 72°C в течение 2 минут. Продукты ПЦР были удалены из геля агарозы, очистищены использованием комплекта Qiagen и упорядочили использование автоматизированного секвенсера. Анализ сайтов сплайсинга последовательности. Последовательности гена дистрофина были восстановлены от базы данных генома мыши NCBI. Геномная ДНК была изолирована как ранее описано от неинфицированных вирусом клеток или клеток, обработанных MDX3, которые сохранялись в культуре в течение 3 месяцев после трансфекции. Исследования последовательностей сайтов сплайсинга были выполнены, используя 100 нг геномной ДНК. Интрон 22/экзон 23 сайт сплайсинга был усилен, используя F (интервал) 22 и R23 праймеры, ранее описанные. Для всех других сайтов сплайсинга полностью изменены праймеры, чтобы усилить ∼400 BP, включая целый экзон и донорные и акцепторные сайты сплайсинга. Амплификация была выполнена в 30 циклов, используя параметры, ранее описанные для анализа. Продукты ПЦР были расположены на гелях агарозы, очистили и повторно растворили в 30 мкл H2O. Второй раунд амплификации был выполнен, используя 2 мкл очищенного продукта еще для 30 циклов. Последовательности праймеров и электрофореграммы предоставляются по запросу. Иммуногистохимия Иммуногистохимия выполнена как описано прежде. Вкраце, культура клеток на покровном стекле фиксированы охлажденным этанолом в течении 10 мин, промыты ПСБ, и закреплены 0,3% тритономХ-100 в течение 10 мин при комнатной температуре. Раствор содержал 5% инактивирован нормальной козлиной сывороткой и 1 мг/мл БСА в ПСБ использован как блокирующий раствор в течение 30 минут. Клетки инкубированы с первичными антителами к дистрофину или α-дистрогликану при 4°C. Клетки были отмыты в ПСБ перед инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре с AlexaTM 546-двойными козлиными антимышинными антителами(H+L) или вторичными антителами конъюгированными с ФИТС. Проведена флюоресцентная микроскопия стекол. Ссылки ↵ Koenig, M., Hoffman, E.P., Bertelson, C.J., Monaco, A.P., Feener, C. and Kunkel, L.M. (1987) Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell, 50, 509–517. ↵ Amalfitano, A., Rafael, J.A. and Chamberlain, J.S. (1996) Structure and mutation of the dystrophin gene. In Brown, S.C. and Lucy, J.A. (eds), Dystrophin., Cambridge University Press, Cambridge, pp. 1–26. ↵ Monaco, A.P., Bertelson, C.J., Liechti-Gallati, S., Moser, H. and Kunkel, L.M. (1988) An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics, 2, 90–95. ↵ Chen, H.H., Mack, L.M., Choi, S.Y., Ontell, M., Kochanek, S. and Clemens, P.R. (1999) DNA from both high-capacity and first-generation adenoviral vectors remains intact in skeletal muscle. Hum. Gene Ther., 10, 365–373. Gilbert, R., Nalbantoglu, J., Howell, J.M., Davies, L., Fletcher, S., Amalfitano, A., Petrof, B.J., Kamen, A., Massie, B. and Karpati, G. (2001) Dystrophin expression in muscle following gene transfer with a fully deleted (‘gutted’) adenovirus is markedly improved by trans-acting adenoviral gene products. Hum. Gene Ther., 12, 1741–1755. Wang, B., Li, J. and Xiao, X. (2000) Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 13714–13719. ↵ Hauser, M.A., Amalfitano, A., Kumar-Singh, R., Hauschka, S.D. and Chamberlain, J.S. (1997) Improved adenoviral vectors for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Neuromusc. Disord., 7, 277–283. ↵ De Angelis, F.G., Sthandier, O., Berarducci, B., Toso, S., Galluzzi, G., Ricci, E., Cossu, G. and Bozzoni, I. (2002) Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 9456–9461. ↵ Dunckley, M.G., Manoharan, M., Villiet, P., Eperon, I.C. and Dickson, G. (1998) Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum. Mol. Genet., 7, 1083–1090. ↵ Mann, C.J., Honeyman, K., Cheng, A.J., Ly, T., Lloyd, F., Fletcher, S., Morgan, J.E., Partridge, T.A. and Wilton, S.D. (2001) Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 42–47. van Deutekom, J.C., Bremmer-Bout, M., Janson, A.A., Ginjaar, I.B., Baas, F., den Dunnen, J.T. and van Ommen, G.J. (2001) Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum. Mol. Genet., 10, 1547–1554. ↵ Wilton, S.D., Lloyd, F., Carville, K., Fletcher, S., Honeyman, K., Agrawal, S. and Kole, R. (1999) Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromusc. Disord., 9, 330–338. ↵ Rando, T.A. (2002) Oligonucleotide-mediated gene therapy for muscular dystrophies. Neuromusc. Disord., 12, S55–S60. ↵ Kapsa, R.M., Quigley, A.F., Vadolas, J., Steeper, K., Ioannou, P.A., Byrne, E. and Kornberg, A.J. (2002) Targeted gene correction in the mdx mouse using short DNA fragments: towards application with bone marrow-derived cells for autologous remodeling of dystrophic muscle. Gene Ther., 9, 695–699. ↵ Rice, M.C., Czymmek, K. and Kmiec, E.B. (2001) The potential of nucleic acid repair in functional genomics. Nat. Biotechnol., 19, 321–326. ↵ Gamper, H.B. Jr, Cole-Strauss, A., Metz, R., Parekh, H., Kumar, R. and Kmiec, E.B. (2000) A plausible mechanism for gene correction by chimeric oligonucleotides. Biochemistry, 39, 5808–5816. ↵ Kren, B.T., Metz, R., Kumar, R. and Steer, C.J. (1999) Gene repair using chimeric RNA/DNA oligonucleotides. Semin. Liver Dis., 19, 93–104. ↵ Kren, B.T., Parashar, B., Bandyopadhyay, P., Chowdhury, N.R., Chowdhury, J.R. and Steer, C.J. (1999) Correction of the UDP-glucuronosyltransferase gene defect in the Gunn rat model of Crigler–Najjar syndrome type I with a chimeric oligonucleotide. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 10349–10354. ↵ Kren, B.T., Bandyopadhyay, P. and Steer, C.J. (1998) In vivo site-directed mutagenesis of the factor IX gene by chimeric RNA/DNA oligonucleotides. Nat. Med., 4, 285–290. ↵ Bertoni, C. and Rando, T.A. (2002) Dystrophin gene repair in mdx muscle precursor cells in vitro and in vivo mediated by RNA–DNA chimeric oligonucleotides. Hum. Gene Ther., 13, 707–718. ↵ Rando, T.A., Disatnik, M.H. and Zhou, L.Z. (2000) Rescue of dystrophin expression in mdx mouse muscle by RNA/DNA oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 5363–5368. Tagalakis, A.D., Graham, I.R., Riddell, D.R., Dickson, J.G. and Owen, J.S. (2001) Gene correction of the apolipoprotein (apo) E2 phenotype to wild-type apoE3 by in situ chimeraplasty. J. Biol. Chem., 276, 13226–13230. ↵ Yoon, K., Cole-Strauss, A. and Kmiec, E.B. (1996) Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA:DNA oligonucleotide. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 2071–2076. ↵ Cole-Strauss, A., Yoon, K., Xiang, Y., Byrne, B.C., Rice, M.C., Gryn, J., Holloman, W.K. and Kmiec, E.B. (1996) Correction of the mutation responsible for sickle cell anemia by an RNA–DNA oligonucleotide. Science, 273, 1386–1389. ↵ Alexeev, V., Igoucheva, O., Domashenko, A., Cotsarelis, G. and Yoon, K. (2000) Localized in vivo genotypic and phenotypic correction of the albino mutation in skin by RNA–DNA oligonucleotide. Nat. Biotechnol., 18, 43–47. ↵ Igoucheva, O.A. and Yoon, K. (2002) Gene correction frequency by chimeric RNA–DNA oligonucleotide using nuclear extracts. Meth. Mol. Med., 69, 95–107. ↵ Ohlendieck, K. and Campbell, K.P. (1991) Dystrophin-associated proteins are greatly reduced in skeletal muscle from mdx mice. J. Cell Biol., 115, 1685–1694. ↵ Harper, S.Q., Hauser, M.A., DelloRusso, C., Duan, D., Crawford, R.W., Phelps, S.F., Harper, H.A., Robinson, A.S., Engelhardt, J.F., Brooks, S.V. and Chamberlain, J.S. (2002) Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Nat. Med., 8, 253–261. ↵ Sironi, M., Pozzoli, U., Cagliani, R., Comi, G.P., Bardoni, A. and Bresolin, N. (2001) Analysis of splicing parameters in the dystrophin gene: relevance for physiological and pathogenetic splicing mechanisms. Hum. Genet., 109, 73–84. ↵ Melis, M.A., Muntoni, F., Cau, M., Loi, D., Puddu, A., Boccone, L., Mateddu, A., Cianchetti, C. and Cao, A. (1998) Novel nonsense mutation (C→A nt 10512) in exon 72 of dystrophin gene leading to exon skipping in a patient with a mild dystrophinopathy. Hum. Mutat., 11, S137–S138. ↵ Cartegni, L., Chew, S.L. and Krainer, A.R. (2002) Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat. Rev. Genet., 3, 285–298. ↵ Thanh, L.T., Nguyen, T.M., Helliwell, T.R. and Morris, G.E. (1995) Characterization of revertant muscle fibers in Duchenne muscular dystrophy, using exon-specific monoclonal antibodies against dystrophin. Am. J. Hum. Genet., 56, 725–731. ↵ Lu, Q.L., Morris, G.E., Wilton, S.D., Ly, T., Artem'yeva, O.V., Strong, P. and Partridge, T.A. (2000) Massive idiosyncratic exon skipping corrects the nonsense mutation in dystrophic mouse muscle and produces functional revertant fibers by clonal expansion. J. Cell Biol., 148, 985–996. ↵ Hoffman, E.P., Morgan, J.E., Watkins, S.C. and Partridge, T.A. (1990) Somatic reversion/suppression of the mouse mdx phenotype in vivo. J. Neurol. Sci., 99, 9–25. ↵ Wilton, S.D., Dye, D.E., Blechynden, L.M. and Laing, N.G. (1997) Revertant fibres: a possible genetic therapy for Duchenne muscular dystrophy? Neuromusc. Disord., 7, 329–335. ↵ Rando, T.A., Disatnik, M.H., Yu, Y. and Franco, A. (1998) Muscle cells from mdx mice have an increased susceptibility to oxidative stress. Neuromusc. Disord., 8, 14–21. ↵ Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, L.E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C. and Markham, A.F. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucl. Acids Res., 17, 2503– 2516. Оригинальная статья http://hmg.oxfordjournals.org/content/12/10/1087.full?view=long&pmid=12719373 Переведено проектом МойМио http://www.mymio.org/
