Фирсов А.П. том 1

ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ
С.Н.С. ЛАБОРАТОРИИ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМ И МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ
(БИОТРОН) ФИЛИАЛА ИБХ РАН
• Тема исследований: «Разработка систем синтеза рекомбинантных белков на основе
растительных экспрессионных платформ (биофарминг)», включая
• Конструирование трансформационных векторов и экспрессионных кассет
• Генетическая трансформация объектов исследований для получения трансгенных
растений-продуцентов рекомбинантных протеинов.
• Молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений.
• Анализ экспрессии целевых протеинов.
Основные направления проводимых исследований:
•Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с βглюкуронидазой или субъединицей В рицина в трансгенных растениях табака и ряски
малой с целью разработки съедобных вакцин
•Экспрессия сверхсладкого белка тауматина II в трансгенных растениях томата
•Анализ устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным вирусам
Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой
в трансгенных растениях табака, трансформированных векторами pBIM130 и pBIM122
LB
β-глюкуронидаза
nos
ter
BamHI
М130
М122
35S CaMV
prom
XbaI
nos
ter
NPT II
nos
prom
RB
Структура экспрессионных
кассет векторов pBIM130 и
pBIM122. Красным шрифтом показана аминокислотная
последовательность
пептида М2е
MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDPLVVAAPGGQSLMLRP ~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ*
MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSPGGQSLMLRP ~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ*
A1
84 кДа
м1 м2
К- М м3
А2
К+
К-
84 кДа
К+
м1
м2
м3
М
Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM130.
Рис. А1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис.А2 – антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной
массы, К- - нетрансгенное растение, К+- трансгенное растение трансформированное вектором pBI121, м1, м2 и м3различные трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.
Б1
т1
84 кДа
т2
т3
К-
М
Б2
т1 т2
84 кДа
т4
К1
М т6 т3 К1 М
Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM122.
Рис. Б1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис. Б2 – антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной
массы, К- - нетрансгенное растение, К1 - растение, трансформированное вектором pBI121, т1-т6- различные
трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.
Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой
в трансгенных растениях ряски малой (Lemna minor), трансформированных вектором pBIM130.
А
Б
71
60
54
51
К+
50
18
17
13
М
50
70
69
К+
66
65
К-
М
54
26
18
К+
17
16
К- М
13
Вестерн-блот анализ трансгенных растений
ряски, полученных после трансформации
вектором pBIM130.
А- с использованием антител к β-глюкуронидазе, Б
и В-антител к пептиду М2е. М- маркер
молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение,
К+- трансгенное растение, трансформированное
вектором pBI121, цифрами обозначены различные
трансгенные линии ряски. Стрелкой показан
слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.
В
72
49
51
содержание М2е- β- глюкуронидазы, % ОРБ
4
3,5
3
2,5
Содержание слитого белка М2е- β- глюкуронидаза в трансгенных растениях ряски малой ,
% от ОРБ.
2
1,5
1
0,5
0
K+
K-
13
17
18
50
51
54
Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъединицей В
рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных вектором
pBI-M2eRTB.
Rep Origin 1
Rep Origin 2
T-DNA RB
promoter NOS
nptII
pBI-M2eRTB
14026 bp
terminator NOS
Схематическая карта вектора pBI-M2eRTB. PR1 SP- сигнальный пептид
PR1 белка табака, RTB- субъединица В рицина, M2e- N-концевой
фрагмент белка М2 (30 а.к.), включающий пептид М2е, CBD- хитинсвязывающий домен хитиназы А.
promoter 35S CaMV
T-DNA LB
А
terminator NOS
PR1 SP
RTB
M2e
CBD
Б
K- L101 L 83 L60 L57 L48 L 41 L34
M
K-
L59 L46 L43 L36 L24a L7b
К-
M R+ T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 K- M T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 M2+ K-
Вестерн блот анализ препаратов общего
растворимого белка трансгенных линий табака
с использованием антител к RTB (A) и M2e (Б).
T1- T14- трансгенные линии, K- не трансформированное растение табака, R+- рицин,
экстрагированный из семян клещевины, M2+пептид M2e экспрессированный в E. coli в
слиянии с интеином (вектор pTYB11). Стрелки
показывают слитый белок RTB-M2е.
L12 M
L88a
Вестерн блот анализ препаратов общего
растворимого белка трансгенных линий ряски
с использованием антител к пептиду M2e. Lразличные трансгенные линии, K- не
трансформированные
растения
ряски,
Стрелки показывают слитый белок RTB-M2е.
Анализ экспрессии пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъединицей В рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных
вектором
pBI-M2eRTB.
А
мкг RTB-M130-CBD/г сырого веса
1
OD405, unit
0,8
R2 = 0,9637
0,6
0,4
0,2
0
0
В
3,5
Б
1,2
20
40
60
80
100
120
3
2,5
2
1,5
1
0,5
ng ricin/well
0
3
K-
T1
T2
T3
T4
T7
T10
T14
T15
2,5
2
1,5
1
0,5
K-
L1
01
L8
8b
L8
3
L6
0
L5
7
L4
6
L4
2
L3
6
L2
6
L1
9
L1
1a
7a
0
L
мкг RTB-M130-CBD/г сырого веса
трансгенные линии
Количественная асиалофетуин-ИФА препаратов
общего белка из трансгенных растений табака и
ряски. А. Концентрационная зависимость связывания рицина с иммобилизованным асиалофетуином. В, С. Накопление слитого белка RTB-М2еCBD в трансгенных растениях табака (В) и ряски
(С). Использовались антитела к RTB, экви-валент
RTB-М2е-CBD был вычислен исходя из графика
концентрационной
зависимости
связыва-ния
рицина с иммобилизованным асиалофетуином (А).
К- нетрансформированное растение.
трансгенные линии
А
Б
Связывание слитого белка RTB-М2е-CBD с асиалофетуином, иммобилизованным на
CNBr-активированной сефарозе (Donayre-Torres et al., 2009). Препарат общего белка из
трансгенных растений табака пропускали через колонку с иимобилизованным асиалофетуином. После промывки связанный с асиалофетуином слитый белок снимали глицином (рН4,0). А. Электрофорез двух фракций в 12,5% ПААГ. Б. Вестерн-блот анализ
фракций этих же фракций с использованием антител к RTB. Стрелками показан слитый
белок RTB-М2е-CBD.