Московская гимназия на Юго-Западе №1543 Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Лаборатория геносистематики Иванова Анна Пустоварова Мария Научные руководители: д.б.н. В.В.Алёшин К.В.Михайлов Москва, 2011 Введение • На сегодняшний день систематику эукариот нельзя считать сложившейся. • Наиболее распространена классификация Кавалье-Смита, согласно которой все эукариоты делятся на одножгутиковых и двужгутиковых. • Изучаемый нами объект принадлежит кладе Heterokonta (разножгутиковые) (рис.1) Рисунок 1. Филогенетическое положение клады Heterokonta. Введение •Объект нашего изучения- представитель ещё не описанного вида. • Его наиболее близкий родственник- Developayella elegans (см рис.) • D. elegans- одноклеточный организм, питающийся бактериями и передвигающийся с помощью одного из своих жгутиков. (рис.2) • Возможно, D. Elegans - близкий родственник оомицетов. Рисунок 2. Developayella elegans Цель работы Целью нашей работы было более точное определение филогенетического положения Colp-4a. Для этого необходимо было определить нуклеотидную последовательность некоторых генов и сравнить их с соответствующими генами других гетероконт. В нашей работе проанализированы последовательности 18S и 28S рРНК нашего объекта. Несколько генов берутся для более достоверного определения филогенетического положения. Материалы и методы Для получения необходимого участка ДНК в ходе нашей работы были использованы следующие методы молекулярной биологии: Выделение из организма тотальной ДНК Амплификация нужного фрагмента методом ПЦР Электрофорез для выявления результатов ПЦР Отделение требуемых фрагментов ДНК от побочных продуктов ПЦР Молекулярное клонирование Выделение плазмид, содержащих разные типы вставок Секвенирование Материалы и методы Выделение культуры Colp-4a Данная культура была выделена из морского осадка, привезённого с Красного моря. Выделение геномной ДНК Для изучения данного объекта было необходимо выделить его ДНК. Этапы выделения ДНК: 1. 2. 3. Лизис клеток и денатурация белков Удаление мембран и клеточных органелл Экстрагирование ДНК из раствора Материалы и методы ПЦР (полимеразная цепная реакция) Данный метод позволяет многократно увеличить число определённых фрагментов ДНК в пробе. Необходимые компоненты реакции: 1. 2. 3. 4. 5. ДНК-матрица Прямые и обратные праймеры ДНК-полимераза Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) Буферный раствор Ход реакции: 1. 2. 3. Денатурация (цепи ДНК расходятся) Отжиг (связывание праймеров с одноцепочечной ДНК) Элонгация (репликация матричной цепи ДНК-полимеразой) Материалы и методы Гель-электрофорез Данный метод демонстрирует концентрацию молекул ДНК в анализируемом образце, а также их длины. Элюция ДНК Данный метод используется для выделения нужной ДНК из полоски геля. Ход реакции: 1. 2. 3. Растапливание полоски геля и помещение её в пробирку с фильтром Осаждение ДНК на фильтре, удаление остальных веществ из раствора Отсоединение ДНК от фильтра Материалы и методы Молекулярное клонирование Мы использовали данный метод для выявления и разделения разных типов фрагментов ДНК одинаковой длины, полученных в ходе ПЦР и последующей элюции. 1. 2. Ход работы: Выделение нужного фрагмента ДНК Встраивание нужного гена в вектор (плазмиду, которая разрезается рестриктазой, а к липким концам присоединяется нужная нам последовательность) (рис.3) Материалы и методы Рисунок 3. Плазмидный вектор Материалы и методы 3. 4. 5. Трансформация (введение плазмидного вектора в бактериальную клетку) Отбор клеток, в которые вошла чужеродная ДНК (не все бактерии трансформируются; не все плазмиды несут вставку). Используются плазмиды, обладающие двумя свойствами: Устойчивость к ампициллину, который содержится в среде (рис.3) Вставка инактивирует ген фермента LacZ в плазмиде => колонии не окрашиваются в синий цвет. Анализ колоний (случайный выбор колоний и амплификация их плазмид) (рис.4) Рисунок 4. Анализ колоний (на рисунке – амплифицированные вставки). Материалы и методы Молекулярное клонирование Рестрикция вставок (различаются ли вставки по нуклеотидной последовательности?) (рис.5) 6. Рисунок 5. Пример рестрикции . Стрелочками отмечены разные типы вставок. Материалы и методы Выделение плазмид Выделение плазмид, несущих интересующую нас вставку, и их секвенирование для определения нужной вставки. Построение филогенетического дерева Сравнение полученной нами последовательности с уже секвенированными генами других гетероконт для создания выравнивания. На основе выравниваний генов 18S и 28S рРНК были построены филогенетические деревья. Результаты В ходе работы нами были выделены и секвенированы гены 18S и 28S рРНК Были составлены три выравнивания (первое содержало лишь 18S рРНК, второе – 28S рРНК, третье - и то, и другое) На основе каждого из них построены деревья Подтвердилось, что ближайшим родственником Colp-4a является Developayella elegans. Филогенетическое дерево 18S рРНК демонстрирует родство D. elegans и оомицетов. Но, судя по дереву, построенному на основе выравнивания 28S рРНК, ни D.elegans, ни Colp-4a не входят в состав Pseudofungi. (Pseudofungi = оомицеты + близкие к ним виды) Результаты А) Дерево на основе выравнивания гена 18S рРНК АВТОТРОФНЫЕ HETEROKONTA Сolp-4a + D. elegans ООМИЦЕТЫ ВНЕШНЯЯ ГРУППА Результаты Б) Дерево на основе выравнивания гена 28S рРНК АВТОТРОФНЫЕ HETEROKONTA Сolp-4a + D. elegans ООМИЦЕТЫ ВНЕШНЯЯ ГРУППА Обсуждение Подтверждено родство Colp-4a и Developayella elegans. Следовательно, их признаки должны быть схожими. Однако длина ветвей после их общего узла показывает, что уже должны были появиться различия между этими организмами. Принадлежность таксона, содержащего D. Elegans, к Pseudofungi требует дополнительной проверки. Определение филогении Colp-4a и Developayella elegans позволит уточнить признаки, характерные для группы Pseudofungi. Выводы За время работы мы освоили многие методы молекулярной биологии. Были выделены и секвенированы гены 18S и 28S рРНК простейшего Colp-4a. Оба филогенетических дерева, построенных на основе полученных последовательностей, показывают, что Colp-4a и Developayella elegans - близкородственные виды. Филогенетическое дерево по гену 18S рРНК даёт высокую поддержку монофилии группы Pseudofungi, в то время как в дереве по гену 28S рРНК Colp-4a и Developayella elegans не входят в их состав. Благодарности Мы благодарим: Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики. Сотрудников отдела эволюционной биохимии НИИ имени А.Н.Белозерского, которые руководили нашей работой и помогали нам её выполнять. Вахрушеву Ольгу рецензирование нашей работы. Спасибо за внимание! d71 Q5 18S d6 28s 28d5 28d1 r71 Q39 28r2 28r3 28r7 28r12 Карта ДНК в районе 18S и 28S рРНК. Фрагменты слева направо: 18S рРНК, 5S рРНК, 28S рРНК. Стрелочками обозначены различные праймеры к данным генам; сверху прямые, внизу обратные. Используемые праймеры Ген Прай -мер Ориентация 18s Q51 прямой 18s Q39 обратный GAATGATCCWTCYGCAGGTTCACCT AC 28s 28s d1 прямой 28s 28s d5 28s 28s r7 обратный AGCCAATCCTTWTCCCGAAGTTAC 28s 28s r12 обратный TTCTGACTTAGAGGCGTTCAG 60-62 °C 28s 28s r13 обратный MRGGCTKAATCTCARYRGATCG 57-68 °C прямой Последовательность GTATCTTGTTGATCCTGCCAGTAG Диапазон устойчивости (Тпл) 63-64 °C 65-68 °C GACCCGCTGAAYTTAAGCATAT 60-63 °C TCCGCTAAGGAGTGTGTAACAAC 63-64 °C 63-65 °C Laminaria [email protected] 82 100 Ectocarpus [email protected] 54 Phaeophyceae Fucus [email protected] 88 Phaeothamniophyceae Phaeothamnion [email protected] Tribonema [email protected] 87 Xanthophyceae Chlorellidium [email protected] 96 Vacuolaria [email protected] Raphidophyceae Chattonella [email protected] 100 24 Heterosigma [email protected] 31 Nannochloropsis [email protected] 100 Eustigmatophyceae Nannochloropsis [email protected] Ochromonas [email protected] 42 73 Chrysophyceae Synura [email protected] 100 97 Mallomonas [email protected] Pinguiococcus [email protected] 100 Pinguiophyceae Glossomastix [email protected] Phaeodactylum [email protected] 88 99 Bacillariophyta Skeletonema [email protected] 4 Rhizosolenia [email protected] 92 Pseudochattonella [email protected] 89 100 2 Dictyochophyceae Dictyocha [email protected] Pseudopedinella [email protected] Pelagococcus [email protected] 36 Pelagophyceae Pelagomonas [email protected] 100 Aureococcus [email protected] 89 Hyphochytrium [email protected] 99 Developayella [email protected] 100 86 Colp-4a Pseudofungi Achlya [email protected] 76 Oomycetes Phytophthora [email protected] 100 Pythium [email protected] 100 Japonochytrium [email protected] 100 Thraustochytrium [email protected] Labyrinthulida Blastocystis [email protected] 72 Caecitellus [email protected] 71 Bicosoecida Nerada [email protected] 83 Pfiesteria [email protected] 100 Akashiwo [email protected] 100 Theileria [email protected] Frenkelia [email protected] 100 Thaumatomonas [email protected] 100 Chlorarachnion [email protected] 100 Guillardia [email protected] 66 Cryptomonas [email protected] Pavlova [email protected] 83 Isochrysis [email protected] 100 100 0.02 Prymnesium [email protected] Рисунок 6. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 18S рРНК Pseudochattonella [email protected] 78 100 Dictyochophyceae Dictyocha [email protected] Apedinella [email protected] 99 Aureococcus [email protected] 19 Pelagophyceae Pelagococcus [email protected] 100 100 Pelagomonas [email protected] Pinguiococcus [email protected] 100 Pinguiophyceae Glossomastix [email protected] Nannochloropsis [email protected] 40 44 Eustigmatophyceae Nannochloropsis [email protected] 100 Mallomonas [email protected] 87 100 Chrysophyceae Synura [email protected] Ochromonas [email protected] Chlorellidium [email protected] 45 70 100 9 Xanthophyceae Tribonema [email protected] Phaeothamniophyceae Phaeobotrys [email protected] Fucus [email protected] 98 Phaeophyceae Laminaria [email protected] 100 Streblonema [email protected] 91 96 Skeletonema [email protected] Bacillariophyta Phaeodactylum tricornutum@contig 100 Rhizosolenia [email protected] 61 75 Vacuolaria [email protected] Chattonella [email protected] 79 74 Raphidophyceae Heterosigma [email protected] 100 Colp-4a Developayella [email protected] 98 Hyphochytrium [email protected] 28 / / 16 Blastocystis hominis@contig Achlya@contig 18 Phytophthora [email protected] 100 100 99 Oomycetes Pythium@contig Japonochytrium [email protected] Thraustochytrium [email protected] 100 Labyrinthulida Caecitellus [email protected] Nerada [email protected] 100 100 Bicosoecida Pfiesteria [email protected] Akashiwo [email protected] 100 Theileria [email protected] 67 100 Frenkelia [email protected] Thaumatomonas [email protected] Chlorarachnion [email protected] 100 100 Guillardia [email protected] Cryptomonas [email protected] Pavlova@contig 96 Isochrysis galbana@contig 100 100 Prymnesium [email protected] 0.05 Рисунок 7. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 28S рРНК Pseudochattonella farcimen 92 100 Dictyochophyceae Dictyocha speculum Pedinellales 99 Aureococcus anophagefferens 47 Pelagophyceae Pelagococcus subviridis 100 100 Pelagomonas calceolata Pinguiococcus pyrenoidosa 32 Pinguiophyceae Glossomastix chrysoplastos 100 Nannochloropsis salina 30 Eustigmatophyceae Nannochloropsis gaditana 100 Chattonella 83 100 Raphidophyceae Heterosigma akashiwo Vacuolaria virescens 96 Laminaria 100 85 90 Phaeophyceae Ectocarpales Fucus Phaeothamniophyceae Phaeothamniales 100 Chlorellidium tetrabotrys 100 Xanthophyceae Tribonema 94 98 Ochromonas Chrysophyceae Synura sphagnicola 100 Mallomonas tonsurata 98 51 Rhizosolenia setigera Skeletonema pseudocostatum 90 93 Bacillariophyta Phaeodactylum tricornutum 100 Developayella elegans Colp-4a 100 Hyphochytrium catenoides 51 Achlya 87 Oomycetes Phytophthora 100 26 100 Pythium / / 100 Blastocystis hominis Caecitellus parvulus Bicosoecida Nerada mexicana 100 Thraustochytrium aureum Japonochytrium sp 100 100 Labyrinthulida Pfiesteria piscicida Akashiwo sanguinea 100 Theileria parva 59 Frenkelia microti 100 Thaumatomonas Chlorarachnion CCMP621 100 100 Guillardia theta Cryptomonas Pavlova 100 Isochrysis galbana 100 100 Prymnesium 0.02 Рисунок 8. Филогенетическое дерево на основе выравнивания, содержащего гены 18S и 28S рРНК. Литература [1] Ingvild Riisberga, Russell J.S. Orrb, Ragnhild Klugeb, Kamran Shalchian-Tabrizid, Holly A. Bowerse, Vishwanath Patilb, Bente Edvardsena and Kjetill S. Jakobsen. Seven Gene Phylogeny of Heterokonts. // Protist, Vol.160, 191—204, May 2009. [2] Mayumi Moriya, Takeshi Nakayama, Isao Inouye. Ultrastructure and 18S rDNA Sequence Analysis of Wobblia lunata gen. et sp. nov., a New Heterotrophic Flagellate (Stramenopiles, Incertae Sedis). // Protist, Vol. 151, 41–55, May 2000. [3] Neil A. Campbell, Jane B. Reece. Biology - 8th ed. Pearson Benjamin Cummings, San Francisco, 2008. [4] Cavalier-Smith T. Only six kingdoms of life. Proc R Soc Lond B. 2004;271:1251–1262 [5] Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. // Москва, изд. Мир, 1984. [6] Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с. [7] Encyclopedia of life. Description of Developayella elegans. Режим доступа: http://www.eol.org/pages/2912228