ν E = h λ E = h c /
advertisement
Электромагнитные колебания Длина волны λ E E=hν H E=hc/λ H E Направление распространения Длина волны в Å 1 10 Рентгеновское излучение 102 103 104 УФ- и видимое излучение 105 Инфракрасное излучение 106 107 Микроволновое Радиоволны излучение Уменьшение энергии падающего излучения Электронные переходы Абсорбционная спектроскопия в видимой и УФ-области спелтра Колебательные и вращательные Инфракрасная спектроскопия и рассеяние Мандельштама-Рамана Ядерные ЯМР 1 Электронные и колебательные переходы в атоме или молекуле Энергия S1 S0 hc E2 E1 УФ-излучение ИФ-излучение r v e К о н ф о р м а ци о н н а я к о о р дин а та Диаграмма типичных уровней энергии, показывающая основное состояние (So) и первое возбужденное состояние (S1) в атоме или молекуле. Колебательные уровни основного состояния показаны тонкими горизонтальными линиями. r, v, и e - соответственно вращательные, колебательные и электронные переходы 2 Закон Бера-Ламберта Величина поглощения при данной длине волны характеризуется молярным коэффициентом экстинкции. Если свет интенсивности I0 проходит через раствор толщины d и молярной концентрации C, то интенсивность I прошедшего света подчиняется закону Бера-Ламберта : dC 0 I I 10 или log( I o / I f ) C ( )d A( ) OП = 2 где ε- молярный коэффициент экстинкции. If – интенсивность света, пропущенного образцом. Поглощение измеряется в % (100 I/I0), но чаще всего в поглощении A, (log I/I0). Когда d = 1 cm, A называется оптической плотностью ОП, где есть длина волны , при которой производятся измерения. Оптическая плотность равна ε× C 3 В ол ь ф ра м ова я л ам па К ач а ю щ а яс я во гн у та я д иф р ак ци он на я ре ш етк а Д ей те ри ева я л ам па К ач а ю щ е ес я в о гн у то е с ф е ри ч ес к ое з ер ка л о Ра с щ еп ите ль п у ч ка Д ете кт ор с р ав нен ия О бр аз ец Д ете кт ор Оптический путь в однолучевом спектрофотометре. Лампа накаливания для видимой области и дейтериевая лампа для УФ-области служат источниками излучения. Поворачивающаяся вогнутая голографическая дифракционная решетка геометрически разлагает луч на спектральные компоненты. Затем весь диапазон длин волн измеряется одновременно диодной линейкой (линейным детектором). Часть луча с помощью светового делителя отводится на контрольный детектор для4 эталонных измерений Применение абсорбционной спектроскопии для измерения концентрации белков и нуклеиновых кислот 280 нм λ=280 nm Поглощение ближнего ультрафиолета для ароматических аминокислот в водных растворах при pH 6. Отметьте, по оси ординат молярное поглощение отложено в логарифмической шкале. λ=258 nm 258 нм Поглощение ближнего ультрафиолета для пуриновых и пиримидиновых оснований в водных растворах при pH 7. Отметьте, по оси ординат молярное поглощение отложено линейной шкале. Примеры, оптическое поглощение для tRNA ОП258 = 1 соответствует концентрации 44 g/ml; оптическое поглощение для рибосом ОП258 = 1 соответствует концентрации 66 g/ml. 5 Применение абсорбционной спектроскопии для определения концентрации белков. 0.6 S6 0.4 S13 0.18 0.3 0.38 Absorbance 0.5 Пример белка в растворе, не образующего истинного молекулярный раствор Absorbance Пример белка в растворе, образующего истинный молекулярный раствор 0.7 0.2 0.1 0.0 24 0 26 0 28 0 30 0 32 0 Wavelength (nm) 34 0 36 0 24 0 26 0 28 0 30 0 32 0 34 0 36 0 Wavelength (nm) 6 Применение абсорбционной спектроскопии для определения конформационных переходов в ДНК. Оптическая плотность трех образцов ДНК как функция температуры: E. Coli (50% GC) при ионной силе 0.01 и 0.1. Pseudomonas aeroginosa DNA (68% GC). Отметьте, что температура перехода (денатурации) зависит как от ионной силы, так и от содержания ГЦ пар. Кривая плавления раствора ДНК фага Т7. При прогревании раствора ДНК до температуры денатурации с последующем охлаждением кривая обратима. При прогревании раствора ДНК выше температуры денатурации кривая необратима. Поглощение раствора падает до величины 1.12 и ДНК выпадает в осадок.7
