ОНКОМИР РАК И МИКРОРНК

ОНКОМИР
РАК И МИКРОРНК
Н.Н.Колесников
Институт молекулярной и клеточной
биологии СО РАН, Новосибирск
2013
История открытия и развития исследований по микроРНК
Функция микроРНК – контроль и регуляция
экспрессии белок кодирующих генов
•
•
•
•
МикроРНК – негативный регулятор
экпрессии генов на посттранкрипционном
уровне
Один белок кодирующий ген может
регулироваться десятками разных
микроРНК
Одна микроРНК может регулировать
работу более сотни разных генов
МикроРНК как онкогены и супрессоры
опухолей
Циркулирующие микроРНК в плазме/сыворотке крови в
составе экзосом, микровезикул и других комплексов
• Стабильность
• Селективная секреция
• Регуляция процессов
в микроокружении и в
отдаленных тканях
• Иммунномодуляция
• Потенциальные
маркеры ранней
неинвазивной
диагностики рака.
Выбранные миРНК
миР-21 – хронологически первая идентифицированная миРНК. Является сильным
онкогеном. Её экспрессия увеличивается в большинстве солидных опухолей.
Увеличивает пролиферативную и инвазивную активность опухолевых клеток.
миР-221, миР-222 – онкогенные миРНК, индуцирующие ангиогенез и пролиферацию
раковых клеток.
миР-155 – продемонстрировано участие этой миРНК в инициации как врожденного,
так и адаптивного иммунных ответов, а также в развитии иммунной системы в
целом. Некоторые работы свидетельствуют об участии миР155 в онкогенезе
различной этиологии.
миР-205 – супрессор опухолевого роста, показано, что в случае некоторых видов
опухолей миР205 индуцирует апоптоз и тормозит рост опухоли.
Признаки раковой клетки:
Автономия ростовых сигнальных путей :
Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки
продуцируют свои собственные ростовые сигналы и способны к
пролиферации без внешних стимулов.
Невосприимчивость к антиростовым сигналам:
Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых стопсигналов для того, чтобы пролиферировать.
Избегание апоптоза:
Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза.
Стабильный ангиогенез:
Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых кровеносных
сосудов.
Неограниченный потенциал репликации:
ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться неограниченное
число раз.
Инвазия в другие ткани и метастазирование:
Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы,
колонизирующих места в организме с неограниченным питанием и
пространством.
ОНКОМИР.
МикроРНК в канцерогенезе
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Общие цели:
- изучение роли микроРНК в молекулярных механизмах в норме и при
нарушениях нормальной физиологии клеток, лежащих в основе разных
патологических состояний.
- установление диагностической значимости профилей микроРНК
ассоциированных с онкологическими заболеваниями.
- создание новых методов диагностики, контроля лечения и прогноза
онкологических заболеваний человека.
- разработка подходов создания комбинированной диагностики онкологических
патологий с использованием платформ микроРНК и соматических мутаций.
Задача №1. Определить вариацию уровней экспрессии микроРНК в разных
гистопатологических типах опухолей щитовидной и молочной желез, головного
мозга сравнительно с условно нормальными клетками.
Задача №2. Установить диагностические значения в норме и при патологии.
Задача №3. Отличать состояния «рак» и «отсутствие рака»
Задача №4. Выявить маркеры, связанные с риском злокачественной
трансформации
Методический подход определения уровня экспрессии микроРНК в
раковых клетках vs прилежащих нормальных клеток у одного
пациента.
miR-155
Условная норма
miR-205
miR-21
miR-221
miR-222
U6
Схема детекции миРНК с помощью обратной
транскрипции и ПЦР в реальном времени
Опухоль vs Норма
опухоль
2^(-ddCt)
miR-155
0,933033
miR-205
1,310393
miR-21
1
miR-221
0,521233
miR-222
0,473029
7
Разработка подходов и создание прообраза
диагностической панели на основе микроРНК.
•
•
ПРИМЕНЕНИЕ
диагностической панели на основе микроРНК
МикроРНК в диагностике и прогнозе
Опухоли головного мозга
•
Рак щитовидной железы
•
Рак молочных желез
Панель миРНК
Общие миРНК
miR-21 miR-221 miR-222
Специфические миРНК
miR-323 miR-224 miR-181b miR-146b miR-200a miR-31
Диагноз
Пациент А
Фолликулярная
аденома
Пациент Б
Папиллярный
рак
Пациент В
Условная норма
Пациент Г
Другой тип
опухоли
• Ранняя диагностика
• Определение
гистотипа опухоли,
стадии развития,
потенциала к
метастазированию
• Контроль эффекта
терапевтического
воздействия (химио и
радиотерапия)
• Прогностическое
значение
выживаемости
• Потенциальная
терапия
Распределение образцов опухолей головного
мозга на основе анамнеза
3%
(2)
2%
(1)
6%
(4)
7%
(5)
Глиобластома
14%
(10)
10%
(7)
Астроцитомы
Менингиома
21%
(15)
Метастаз карциномы
Эпендимома
Невринома
37%
(26)
Медуллобластома
Прочие
Всего - 70
Распределение образцов РЩЖ на основе
анамнеза
1% 4%
Распределение образцов РМЖ на основе
анамнеза
2% (2)
(3)
(7)
18%
(33)
21%
(16)
Фиброаденома
Инвазивный протоковый рак
79%
(61)
Всего - 77
33%
(61)
Опухолеподобные поражения
Фолликулярная аденома
Папиллярная карцинома
Медулярная\ карцинома
42%
(77)
Анапластический рак
Фолликулярная карцинома
Всего - 183
МикроРНК при папиллярном раке и
коллоидном узле щитовидной железы
Уровень экспрессии, усл. единицы
Сравнение уровней экспрессии микроРНК при папиллярном раке
и коллоидном узле
50
45
40
35
Коллоидный узел
30
Папиллярный рак
25
20
15
10
5
0
miR-21
miR-221
miR-222
miR-155
miR-205
микроРНК
10
МикроРНК при фолликулярной
аденоме и фолликулярном раке
60
40
Фолликулярная
аденома
20
Фолликулярный рак
0
miR21
miR221
miR222
miR155
miR205
-20
11
Глиомы
35,00
Диффузная астроцитома
Анапластическая астроцитома
30,00
Глиобластома
И
зм
ен
ен
ие
ур
ов
ня
м
иР
Н
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
-5,00
миР-21
миР-221
миР-222
миР-155
миР-205
-10,00
-15,00
-20,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
миР-126
миР-451
Мир-21 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ
и МЖ
миР-21
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
35,00
Менингиома ГМ
Диффузна я а строцитома ГМ
Ана пла стическа я а строцитома
ГМ
Глиобла стома ГМ
30,00
ОПП ЩЖ
Фолликулярна я а денома ЩЖ
25,00
Фолликулярна я ка рцинома ЩЖ
20,00
Па пиллярна я ка рцинома ЩЖ
Протокова я ка рцинома МЖ
15,00
10,00
5,00
0,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-5,00
Мир-205 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ,
ЩЖ и МЖ
миР-205
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
15,00
Менингиома ГМ
Диффузная астроцитома ГМ
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
10,00
ОПП ЩЖ
Фолликулярная аденома ЩЖ
5,00
Фолликулярная карцинома ЩЖ
0,00
Папиллярная карцинома ЩЖ
Протоковая карцинома МЖ
-5,00
-10,00
-15,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-20,00
МикроРНК в доброкачественных и злокачественных
опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ
миР-221
Менингиома ГМ
миР-222
Диффузная астроцитома ГМ
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
50,00
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
40,00
ОПП ЩЖ
30,00
Фолликулярная аденома ЩЖ
Фолликулярная карцинома ЩЖ
20,00
Папиллярная карцинома ЩЖ
10,00
Протоковая карцинома МЖ
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
50,00
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
40,00
ОПП ЩЖ
Фолликулярная аденома ЩЖ
30,00
Фолликулярная карцинома ЩЖ
20,00
Папиллярная карцинома ЩЖ
Протоковая карцинома МЖ
10,00
-10,00
-10,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-20,00
-20,00
миР-155
30,00
Менингиома ГМ
ОПП ЩЖ
Фолликулярная аденома ЩЖ
20,00
Фолликулярная карцинома ЩЖ
Папиллярная карцинома ЩЖ
15,00
Протоковая карцинома МЖ
10,00
5,00
миР-205
Диффузная астроцитома ГМ
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
25,00
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
15,00
Менингиома ГМ
Диффузная астроцитома ГМ
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
10,00
ОПП ЩЖ
Фолликулярная аденома ЩЖ
5,00
Фолликулярная карцинома ЩЖ
0,00
Папиллярная карцинома ЩЖ
Протоковая карцинома МЖ
-5,00
-10,00
-15,00
0,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-5,00
Диффузная астроцитома ГМ
0,00
0,00
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
Менингиома ГМ
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-20,00
При объединении классов «аденома» и «ОПП» точность метода
C4.5 была значительно увеличена.
Матрица несоответствий
Заболевание
чувствительность
специфичность
общая
точно
сть
ОПП/аденома
0.975
0.962
0.970
ОПП/аденома
ОПП/аденом
а
карцинома
39
1
1
25
карцинома
карцинома
0.962
0.975
0.970
Общая ошибка
0.030
Общая ошибка при кроссвалидации
0.133
РЕЗЮМЕ. МикроРНК в диагностике опухолей
Создан прообраз платформы на основе микроРНК для диагностики
онкологических заболеваний, что позволит:
• Дифференцировать
доброкачественные опухоли
от злокачественных
новообразований
• Контролировать эффект
терапевтического
воздействия (лучевая и
химиотерапия)
• Выявлять различные
патоморфологические типы
опухолей
• Разработать алгоритмы
ранней диагностики
онкологических заболеваний
• ПРИМЕНЕНИЕ
• Ранняя диагностика
• Определение гистотипа
опухоли, стадии развития,
потенциала к
метастазированию
• Контроль эффекта
терапевтического
воздействия (химио и
радиотерапия)
• Прогностическое значение
выживаемости
• Потенциальная терапия
Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний человека
на основе молекулярных маркеров - микроРНК и соматических мутаций
УЧАСТНИКИ ПРОЕКТА:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Титов Сергей Евгеньевич
- Вектор-Бест, ИМКБ СО РАН,
Веряскина Юлия Андреевна
- ИМКБ СО РАН
Ахмерова Лариса Григорьевна
- ИМКБ СО РАН
Иванов Михаил Константинович
– Вектор-Бест
Жимулев Игорь Федорович
- ИМКБ СО РАН
Гуляева Людмила Федоровна
- ИМББ СО РАМН
Деменков Павел Сергеевич
- ИЦиГ СО РАН
Шевченко Сергей Петрович
- МБУЗ № 1
Карпинская Елена Владимировна
- МБУЗ № 1
Козлов Вадим Викторович
- НООД
Войцицский Владимир Евгеньевич
- НООД
Сидоров Сергей Васильевич
- МБУЗ № 1
Ступак Вячеслав Владимирович
- ФГБУ НИИТО
Лехнер Андрей Вячеславович
- ФГБУ НИИТО
Садовой Михаил Анатольевич
- ФГБУ НИИТО
•
При поддержке фирмы БИОРАД Сибирское отделение
Анти-МиР- терапия
Nanoparticle-based therapy in an in vivo
microRNA-155 (miR-155)-dependent
mouse model of lymphoma (Babar et
al.,PNAS,June 8, 2012)
Регрессия лимфомы
после доставки уникальных наночастиц
с анти-миР-155 в лимфоциты
• Благодарю за внимание.
dual function: as oncogene
or tumor-suppressor
Гипотезы 1+2
Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний
человека на основе молекулярных маркеров - микроРНК и
соматических мутаций в онкогенах
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Н.Н. Колесников,
С.Е. Титов,
Е.В. Карпинская,
C.П. Шевченко,
Ю.А. Веряскина,
Л.Г. Ахмерова,
М.К. Иванов ,
Л.Ф. Гуляева ,
В.В. Ступак,
А.В. Лехнер,
М.А. Садовой ,
В.В.Козлов,
С.В.Сидоров,
И.Ф.Жимулев
• ИМКБ СО РАН, Институт
молекулярной и клеточной
биологии СО РАН;
• ЗАО «Вектор-Бест»;
• Городская клиническая
больница №1
г.Новосибирска;
• ИМББ СО РАН, Институт
молекулярной биологии и
биофизики СО РАН;
• Новосибирский НИИ
травматологии и
ортопедии
Минздравсоцразвития РФ
• Новосибирский
онкологический диспансер
Операционный материал
Опухолевые и нормальные ткани были
получены от 183 пациентов с различными
типами новообразований щитовидной железы:
Основные классы опухолей и опухолеподобных
заболеваний щитовидной железы.
(в соответствии с международной гистологической классификацией
ВОЗ 2-го пересмотра (1988 гг.).
Распределение образцов РЩЖ на основе
анамнеза
1% 4%
2% (2)
(3)
(7)
18%
(33)
33%
(61)
Опухолеподобные поражения
Фолликулярная аденома
Папиллярная карцинома
Медулярная\ карцинома
42%
(77)
1.1.1.Фолликулярная аденома
ФА
77
1.2.1. Фолликулярная карцинома
ФК
7
1.2.2. Папиллярная карцинома
ПК
61
1.2.3. Медуллярная карцинома
МК
3
1.2.4. Анапластическая карцинома
АК
2
7. Опухолеподобные поражения
ОПП
33
Анапластический рак
Фолликулярная карцинома
Всего - 183
микроРНК в опухолях молочной железы
микроРНК для диагностики рака
молочной железы
Эффект лучевой (А) и химиотерапии (Б) на профиль
экспрессии микроРНК при инвазивном
раке молочных желез.
Распределение образцов РМЖ на основе
анамнеза
21%
(16)
Б
А
Фиброаденома
Инвазивный протоковый рак
79%
(61)
изменение профиля экспрессии микроРНК в раковых клетках по сравнению с нормой.
50
Изменение уровня миРНК при патологии по
отношению к контролю
Протоковая карцинома МЖ
Фиброаденома
16
Инвазивный протоковый рак
61
Всего
77
Папиллярная карцинома ЩЖ
40
30
20
10
0
-10
миР-21
миР-221
миР-222
миР-155
-20
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
миР-205
Веряскина и др.,2012,
Колесников и др., 2013
Опухоли головного мозга проанализированные
по 7 миРНК в зависимости от их гистотипа (Колесников и др.,2013)
Гистоструктура
Число
слу
чае
в
%
Степень
злокачественно
сти (Grade)*
Глиобластома
10
14.3
Астроцитомы
15
21.4
пилоцитарная
(1)
I
диффузная
(4)
II
анапластическая
(10)
III
IV
Эпендимома
1
1.4
I
Медуллобластома
2
2.8
IV
Менингиома
26
37.1
Невринома
4
5.7
Метастаз
карциномы
7
10.0
Прочие
5
7.1
Всего
70
100
I
I
Распределение образцов опухолей головного
мозга на основе анамнеза
3%
(2)
2%
(1)
6%
(4)
7%
(5)
10%
(7)
Глиобластома
14%
(10)
Астроцитомы
Менингиома
21%
(15)
Метастаз карциномы
Эпендимома
Невринома
37%
(26)
Медуллобластома
Прочие
МикроРНК как биомаркеры. Анализ операционного материала с
предоставленным гистологическим заключением
• МикроРНК в
опухолях ЩЖ
• МикроРНК в
опухолях МЖ
• МикроРНК в
опухолях головного
мозга
•
•
•
•
•
Проанализировано:
ЩЖ – 183 образца,
МЖ – 77 образцов,
ОГМ – 70 образцов
Всего - 330
Главные признаки раковой
клетки.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Автономия ростовых сигнальных путей :
Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки
продуцируют свои собственные ростовые сигналы и
способны к пролиферации без внешних стимулов.
Невосприимчивость к антиростовым сигналам:
Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых
стоп-сигналов для того, чтобы пролиферировать.
Избегание апоптоза:
Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза (
программированной клеточной смерти) и увеличиваются в
числе.
Стабильный ангиогенез:
Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых
кровеносных сосудов
Неограниченный потенциал репликации:
ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться
неограниченное число раз.
Инвазия в другие ткани и метастазирование:
Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы,
колонизирующих места в организме с неограниченным
питанием и пространством.
4 Дополнения к признакам раковой клетки:
+ дерегуляция энергетики клетки
+ избегание воздействия иммунной системы
+ хромосомные нарушения и нестабильность ДНК
+ воспалительные процессы
Cell, January, 2000, March, 2011, Douglas Hanahan and Robert Weinberg.
Попарное сравнение двух групп образцов с
помощью U-критерия Манна-Уитни
40
узлы
30
рак
Изменение уровня миРНК при
патологии по отношению к
контролю
35
25
20
15
10
5
0
-5
миР21
миР221
миР222
миР155
миР205
-10
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
U
Группа 1:
Узлы/Группа
2: Рак
p
Размер выборки
Узлы
Рак
миР-21
59,5
0,000258
15
26
миР-221
22
0,000003
15
26
миР-222
31
0,00001
15
26
миР-155
125,5
0,438922
13
23
миР-205
167
0,680952
14
26
Изменение уровня экспрессии пяти микроРНК в разных
гитопатологических типах опухолей ЩЖ
40
ОПП
Фолликулярная аденома
30
Папиллярная карцинома
20
10
0
миР-21
-10
-20
миР-221
миР-222
миР-155
миР-205
Мир-221 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ,
ЩЖ и МЖ
миР-221
Менингиома ГМ
Диффузная астроцитома ГМ
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
50,00
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
40,00
ОПП ЩЖ
30,00
Фолликулярная аденома ЩЖ
Фолликулярная карцинома ЩЖ
20,00
Папиллярная карцинома ЩЖ
10,00
Протоковая карцинома МЖ
0,00
-10,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-20,00
Мир-222 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ,
ЩЖ и МЖ
миР-222
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
50,00
Менингиома ГМ
Диффузная астроцитома ГМ
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
40,00
ОПП ЩЖ
Фолликулярная аденома ЩЖ
30,00
Фолликулярная карцинома ЩЖ
20,00
Папиллярная карцинома ЩЖ
Протоковая карцинома МЖ
10,00
0,00
-10,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-20,00
Мир-155 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ,
ЩЖ и МЖ
миР-155
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
30,00
Менингиома ГМ
Диффузная астроцитома ГМ
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
25,00
ОПП ЩЖ
Фолликулярная аденома ЩЖ
20,00
Фолликулярная карцинома ЩЖ
Папиллярная карцинома ЩЖ
15,00
Протоковая карцинома МЖ
10,00
5,00
0,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-5,00
Мир-205 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ,
ЩЖ и МЖ
миР-205
Из
ме
не
ни
е
ур
ов
ня
ми
РН
К
15,00
Менингиома ГМ
Диффузная астроцитома ГМ
Анапластическая астроцитома
ГМ
Глиобластома ГМ
10,00
ОПП ЩЖ
Фолликулярная аденома ЩЖ
5,00
Фолликулярная карцинома ЩЖ
0,00
Папиллярная карцинома ЩЖ
Протоковая карцинома МЖ
-5,00
-10,00
-15,00
Медиана, 0.25-квантиль/0.75-квантиль
-20,00