2) Нативные биологические частицы в ЕМ наблюдаются в виде
advertisement
Электронная микроскопия Длина волны электрона зависит от ускоряющего потенциала как 12.5 U Трехмная где U в вольтах (без вклада релятивистского члена). Отсюда следует, что длина волны электронов, ускоренных в поле 90 кV, равна 0.04 Å. Такая длина волны намного короче длины волны рентгеновских лучей и в принципе можно ожидать, что Электронный из электронной микроскопии можно получить разрешение лучше, чем из дифракции рентгеновских лучей. Однако на практике это не происходит минимум по трем причинам. 1) Нет линз, способных фокусировать электроны, рассеянные под большими углами (получение информации о малых расстояниях затруднено). 2) Нативные биологические частицы в ЕМ наблюдаются в виде бесструктурных пятен (малый контраст). 3) Существуют огромные, подчас очень специфические, трудности приготовления биологических образцов для ЕМ («равило «золотых рук») Основное различие между формированием изображения в экспериментах по дифракции и в электронном микроскопе состоит в том, что в последнем случае двумерное изображение можно наблюдать непосредственно. Оптическая система электронного микроскопа Нить накала Электронная пушка Анод Четыре основные отличия СМ от ЕМ 1) Электроны сильно поглощаются воздухом. Поэтому в отличие от светового микроскопа образец в ЕМ всегда должен находится в глубоком вакууме. 2) Увеличение в ЕМ может изменяться за счет изменения тока текущего через линзы; в световом микроскопе увеличение для данной линзы постоянно. 3) В силу особенностей построения изображения сегодняшние электромагнитные линзы работают при очень маленькой апертуре (0.0005). Это влечет за собой практический предел разрешения около 4Å. 4) Аберрации в той или иной степени присутствуют в электромагнитных линзах Конденсорная линза Образец Обьектив Промежуточная линза Дифракционная линза Проекционная линза Флуоресцентный экран или фотопластинка Система поддержки образца в электронном микроскопе Поддерживающая пленка Образец Металлическая решетка Вид сверху Вид сбоку Металлическая решетка состоит обычно из меди и поддерживающая пленка - обычно из углерода . Биологическая макромолекула состоящая из C, N, O, P, S атомов лежит на подложке в основном из C атомов, что и приводит к очень низкому контрасту. Отсюда возникает необходимость контрастирования биологических макромолекул. Методы контрастирования белков, нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов Контрастирование оттенением Негативное контрастирование Опоры (медные сеточки), подложки (углерод и коллодий) Оттенение-испарение металла (платина, палладий, вольфрам в вакууме Пример Недостаток метода: ограничение разрешения деталей размером зерна напыляемого металла Контрастирование 2% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) Пример Недостаток метода: влияние ФВК на структуру изучаемых частиц Триумф ЕМ с использованием методов контрастирования (1980 годы) 70S рибосомная частица в двух проекциях Фотографии моделей 70S рибосомных частиц. Малая (30S) и большая (50S) показаны желтым и красным, соответственно (Васильев, 1983) Иммунноэлектронная микроскопия-сочетание иммунохимии и электронной микроскопии Трехмерная структура молекулы иммуноглобулина (слева ) и его схематическое изображение (справа) Применение к изучению структуры малой (50S) рибосомной субчастицы Крио-ЕМ изображение 50S субьединицы 100 Å 40 Å Просвечивающая криоэлектронная микроскопия Проблема: Решение: Результат: макромолекулы в электронном микроскопе имеют вид бесструктурных пятен макромолекулы замораживаются в жидком этане и тысячи изображений анализируются модели более высокого пространственного разрешения по сравнению с контрастированием 70S 50S 30S Рибосомные частицы. Пространственное разрешение около 11 Å; оранжевым цветом изображен кусок РНК, зеленым - молекулы т-РНК Сравнение кристаллографии и крио-электронной микроскопии Рентгеновская кристаллография на одиночных кристаллах • Число молекул в образце ~ 1015 Крио-электронная микроскопия нaх молекулах ~ 104 • Эффективность рассеяния излучения с веществом • Падающий поток • Реальное изображение • Динамические возможности • Радиационная опасность • Контраст • Особенности источника очень низкая очень высокая очень высокий очень высокий отсутствует двумерное часы секунды присутствует ярко выражена средний очень низкий хорошо сфокусированный много недостатков монохроматичный • Алгоритм 3-М реконструкции хорошо разработан в стадии разработки ТРЕХМЕРНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ В основе трехмерной реконструкции частиц лежит известная в кристаллографии теорема проекций, которая утверждает, что двумерная трансформанта Фурье плоской проекции трехмерного распределения плотности идентична соответствующему центральному сечению трехмерной трансформанты, нормальному направлению проецирования. Различные проекции получаются либо наклоном образца в электронном микроскопе или от образцов, имеющих разную ориентацию по отношению к падающему пучку Подготовка образца П роекц ии п олу чен н ы х и зоб ражен ий Утоньшение и стеклование образца Криомикроскопия Микрофотография Ф урь е - п реоб разов ание к аждо й п роек ции Выбор изображения Оцифровка Обработка 3D-реконструкция Получение трехмерной карты плотности Рек он ст рук ция объ ек т а с ин тез ом ф урье - п реобраз ован и й Визуализаия Моделирование Интерптретация Число разных углов наблюдения, требующихся для расчета модели до разрешения d, зависит от порядка симметрии (n) и диаметра (D) частицы. Минимально необходимое число точек наблюдения, N, это N треб N проекц ( D nd ) где d есть желаемое разрешение реконструкции. Например, икосаэдрические вирусы, благодаря своей 60-кратной симметрии, требуют в 60 раз меньше углов наблюдения, чем асимметричная рибосома. С большим запасом надежности в качестве критерия можно принять, что для достижения отношения сигнал/шум более 3σ при разрешении реконструкции в 9 Å потребуется 60 000 изображений частиц. (б) (в) (г) Рис. Ж2.13. Крио-ЭМ-структуры комплекса70S рибосомы с аминоацил тРНК в рибосомном А участке. Обе субчастицы показаны полупрозрачными (50S светлоголубая и 30S светло-желтая) с тем, чтобы оттенить положение т-РНК на поверхности субъединиц. а) Комплекс 70S-fMet-tRNAfMet−Phe-tRNAPhe− EF-Tu − GDP − kir с разрешением в 9Å. Элонгационный фактор EF-Tu показан красным, т-РНК в А/Т участке − бледно- розовым, в P-сайте − зеленым, в E-сайте − оранжевым. kir − антибиотик киромицин (Valle et al., 2003a)
