отчетНИСеминар_БФ_Ф_Тема1_Лоншакова (1.6Mб, ppt)

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ В
ПОЛИМЕРНЫЕ ГЕЛИ
ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ:
ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
Лоншакова Виктория Ивановна
Научный руководитель: Есимбекова Е. Н.
к.б.н., н.с. ИБ СО РАН
Антропогенное давление
ОКРУЖАЮЩАЯ
СРЕДА
Рост:
• уровень загрязнения;
• перечень контролируемых
веществ
Тест-методы:
 Химические;
 Биологические.
Преимущества
биологических методов
анализа:
• интегральность;
Токсические вещества:
• соли тяжелых металлов;
• фенолы;
• хиноны;
• фосфорорганические
соединения (ФОС).
Бактериальное заражение
2
Организм
Токсическое
вещество
Параметр
жизнедеятельности
Ферментативные
реакции
Токсическое
вещество
Ответ
Ответ
Проблемы:
Уменьшение «времени жизни» фермента после
извлечения из естественного окружения
Повышенные температуры
Изменение состава реакционной смеси (растворов)
Изменение значений pH
Удаление времен использования и приготовления
ферментных препаратов
3
Стабильность фермента
Способность фермента сохранять собственную каталитическую
активность в условиях, когда отсутствуют инактивационные
механизмы
Стабилизация ферментов
Иммобилизация
Внесение
стабилизирующих добавок
4
Цель:
Разработка стабильных иммобилизованных препаратов на основе
ферментных систем для проведения биотестирования
Задачи:
1. Создание методики иммобилизации ферментных систем (на
основе
бутирилхолинэстеразы,
АТФ-зависимой
люциферазы,
системы
НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люциферазаалкогольдегидрогеназа) в крахмальный и желатиновый гели;
2. Установить
механизмы
(способы)
регулирования
чувствительности иммобилизованных реагентов к действию
токсических веществ;
3. Разработать способ биотестирования токсичности водных
экосистем на основе иммобилизованных реагентов.
5
Материалы и методы
Метод иммобилизации
ферментов светящихся
бактерий в крахмальный
или желатиновый гели
Бутирилхолинэстераза
и её субстраты
Люцифераза светляков и
её субстраты
6
Система NADH:FMN-оксидоредуктаза –
люцифераза
NADH:FMN-оксидоредуктаза (R)
NAD (P) H + FMN + H+
NAD (P)+ + FMNH2
люцифераза (L)
RCOOH + FMN + H2O + свет
RCHO + FMNH2 + O2
Ферментативные реагенты для
биолюминесцентного анализа
Лиофильно высушенные
ферменты (растворимые)
Иммобилизованные
реагенты
L+R
• t0 хранения: -40 0С;
• срок хранения: 1-2 года
(без потери активности)
L + R + C14 + NADH
• t0 хранения: 4 - 40 0С;
• срок хранения: ~1 год
(потеря активности~в 5 раз)
7
Стабилизаторы
Дитиотрейтол (ДТТ)
Меркаптоэтанол
1∙10-4 – 5∙10-4 М
5∙10-5 – 5∙10-4 М
Реакционная смесь:
• иммобилизованный реагент
• 300 мкл дистиллированной
воды
• 10 мкл 5∙10-4 М раствора FMN
Бычий сывороточный
альбумин (БСА)
1∙10-8 – 5∙10-4 М
Измеряемые параметры
биолюминесценции:
• Максимальная интенсивность
свечения (Imax)
• Константа спада свечения (kсп)
• Время выхода свечения на
максимальный уровень (Tmax)
8
Условия экспериментов
Исследуемые характеристики иммобилизованных реагентов
Параметры биолюминесценции реагентов через 3 дня
после его приготовления и при хранении в течение 6
месяцев (40С)
Чувствительность к действию токсических веществ (EC50)
Выбор реагента, наиболее чувствительного к действию CuSO4 и
бензохинона (концентрации в реакционной смеси составляли 4∙10-6 М
и 5∙10-7 М соответственно)
Чувствительность к действию рядов модельных токсических веществ
Остаточная интенсивность
свечения:
(Ii/I0)∙100%,
Ii – Iмакс опытного образца
I0 – Iмакс контрольного образца
Хиноны (нафтохинон, тимохинон, толухинон)
Фенолы (гидрохинон, монофенол, пирокатехин)
Соли тяжелых металлов (CuSO4, CoCl2, CrCl2)
9
Рисунок 1 – Интенсивность свечения иммобилизованной совместно
со стабилизаторами биферментной системы
(контрольный раствор - дистиллированная вода)
10
Таблица 2 – Действие ряда токсических
веществ
на
иммобилизованную
биферментную систему
Класс
вещества
Действующее
вещество
CuSO4∙5H2O
(ПДК 1 мг/л)
Соли
Фенолы
Хиноны
ЕС50, мг/л
ДТТ
Контроль (100 мкМ)
10
16
CrCl2∙6 H2O
(ПДК 0,05 мг/л)
479
586
HgCl2
(ПДК 1 мг/л)
0,62
0,73
Пирокатехин
(ПДК 0,1 мг/л)
84,8
148,4
Таблица 3 – Константы спада
свечения реагента в зависимости от
концентрации токсических веществ
k сп, мин-1
Действующее Концентрация
ДТТ
Контрол
вещество
, мг/л
(100мкМ
ь
)
Контроль
CuSO4∙5H2O
0,26
0,16
0,025
0,18
0,24
1,25
0,20
0,17
6,24
0,23
0,26
24,9
0,66
0,53
0,011
0,15
0,09
0,053
0,11
0,10
0,106
0,17
0,10
Резорцин
(ПДК 0,004 мг/л)
1760
Гидрохинон
(ПДК 0,2 мг/л)
3,06
4,72
0,318
0,20
0,11
Бензохинон
(ПДК 0,1 мг/л)
0,002
0,003
0,2∙10-6
0,27
0,16
Толухинон
0,00008
0,00008
1∙10-6
0,38
0,28
0,00005
0,0007
5∙10-6
0,24
0,17
1∙10-5
0,32
0,18
Тимохинон
Нафтохинон
(ПДК 0,25 мг/л)
0,001
1765
0,0016
Пирокатехин
Тимохинон
11
Бутирилхолинэстераза (BChE)
БХолинэстераза
Бутирилтиохолин
Тиохолин
+
Н2О
Тиохолин + Масляная кислота
+
5,5′-Дитио-бис
(2-нитро-бензойная кислота)
2-нитро-5-тио-бензойная кислота
Метод Элмана
Иммобилизация
BChE
BChE совместно с
индикатором
12
Активность
бутирилхолинэстеразы
=
скорость гидролиза
бутирилхолина
, где D – оптическая плотность (λ = 412 нм);
t – время.
Реакционная смесь:
• 1 диск реагента;
• 2 мл 0,05 М калий-фосфатного
буфера pH = 8,1;
• 100 мкл S-BChI 120·10-3 М
13
Результаты
Количество ед.
активности BChE, U
Коэффициент наклона
0,130
0,189
0,120
0,112
0,100
0,074
0,090
0,057
0,064
0,019
Таблица 1 – Значения коэффициента
угла наклона
Рисунок 1 – Зависимость изменения оптической плотности от
времени в реакционных смесях с различным содержанием
бутирилхолинэстеразы
14
Рисунок 2 - Зависимость изменения оптической
плотности от времени растворимой и
иммобилизованной в крахмальный гель
бутирилхолинэстеразы (10 U)
15
АТФ-зависимая люцифераза
+ АТФ + O2
Mg2+
→
+ свет
Иммобилизация
L
L совместно с LH2
16
Выводы
1.
2.
Наибольший стабилизирующий эффект при сохранении
чувствительности
к
действию
токсических
веществ
наблюдается при внесении в иммобилизованный реагент на
основе биферментной системы NADH:FMN-оксидоредуктаза –
люцифераза 100 мкМ ДТТ.
Иммобилизация BChE совместно с индикатором на тиольную
группу не оказывает влияния на активность фермента.
17