Возможности анализа состояния конституционного

Возможности анализа состояния
конституционного гетерохроматина
генома человека с помощью цифровых
технологий
Воробьева Ольга
Биологический факультет МГУ, 202 группа
Цель: разработать метод цифрового анализа состояния
конституционного гетерохроматина в ядрах клеток
культивированных лимфоцитов человека
Задачи:
•
разработать программу определения размеров
микроскопических объектов на основе методов
предварительного визуального наблюдения,
микрофотографии и последующего компьютерного анализа
цифрового изображения
•
определить размеры гетерохроматиновых блоков хромосом
человека на стандартных цитогенетических препаратах
лимфоцитов периферической крови после процедуры Сокрашивания
•
сравнить характеристики величин вариабельного
гетерохроматинового участка длинного плеча хромосомы Y
(Yq12) в стадии метафазы митоза
•
установить различия степеней конденсации
гетерохроматиновых участков в интерфазных и метафазных
клетках
•
оценить перспективы применения метода анализа цифровых
изображений дифференциально-окрашенных хромосом в
диагностической практике
Методы
В работе были использованы методы световой микроскопии, цифровой
микрографии и компьютерной биометрии с использованием авторской
программы.
Готовые С-окрашенные препараты хромосом культивированных
лимфоцитов периферической крови были любезно предоставлены
объединенной цитогенетической лабораторией Научного центра
психического здоровья РАМН - МНИИ педиатрии и детской хирургии
Минздравсоцразвития РФ (руководители: проф., д.б.н. Юров Ю.Б. и проф.,
д.б.н. Ворсанова С.Г.).
Цифровые изображения кариотипов получали при помощи любительских
фотоаппаратов моделей Samsung S 1060, Olympus FE-26 и светового
лабораторного микроскопа Nikon YS2-Y. Поиск метафаз проводился
визуально при увеличении 200х (окуляр 20х, объектив 10х). Анализ и съемка
кариотипов осуществлялись при увеличении 2000х (окуляр 20х, объектив
100х, иммерсия).
Метод цифровой биометрии заключался в определении размеров контрастноокрашенных участков С-гетерохроматина хромосом путем сравнительного
анализа цифровых изображений с помощью авторской компьютерной
программы “GenoMetr”. Оценка размера сегментов хромосом-мишеней
проводилась в миллионах пар оснований – мегабазах (Mb). В ходе работы
размер определяемого участка автоматически сопоставлялся с занесенными в
программу данными, известными для невариабельных, т.е. эухроматиновых
районов хромосом. Основным сравнительным эталоном служило короткое
плечо хромосомы 9, которая хорошо дифференцируется при С-окрашивании
благодаря большому гетерохроматиновому блоку 9qh. Короткое плечо 9р
имеет постоянный размер 45 Mb.
Программа написана на языке Microsoft visual basic v6.0. В ней
предусмотрены следующие функции:
•загрузка графического файла (микрофотографии) с изображением
кариотипа
•полуавтоматическое определение размера участков хромосом-мишеней
•количественная оценка и сохранение результатов
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием оценки
значимости различия по t-критерию Стьюдента и соответствия
экспериментального распределения нормальному с использованием
программы Excel 2003.
Микрография хромосом пациента с кариотипом 48,XXYY. Красными стрелками показаны хромосомы Y,
зелеными – хромосомы 9
Скриншот программы “GenoMetr”
Результаты
Цитогенетические диагнозы пациентам (46,XY; 46,XYqh–,16qh–; 46,XYqh+;
48,XXYY) были поставлены в лаборатории молекулярной цитогенетики
МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗСР РФ согласно стандартному
протоколу и Международной номенклатуре.
Нормальный мужской кариотип 46,XY служил для контрольных измерений.
Хромосомный набор 46,XYqh–,16qh– указывал на уменьшение
гетерохроматиновых сегментов хромосом Y и 16; запись 46,XYqh+
свидетельствовала об увеличении гетерохроматинового сегмента Yq12 (qh).
Кариотип 48,XXYY представлял собой хромосомную патологию: удвоенный
набор (дисомия) половых хромосом (гоносом).
В процессе работы было получено и проанализировано 29 цифровых
изображений полных метафазных пластинок для определения протяженности
геномного гетерохроматина, проведен сравнительный анализ 465 пар «9р» –
«Yqh» по сопоставлению размера гетерохроматина Yq с коротким плечом
хромосомы 9.
Протяженность C-гетрохроматиновых последовательностей генома, по
результатам проведенных исследований у четырех пациентов, варьировала от
231,3 Mb (кариотип 48,XXYY) до 464,7 Mb (кариотип 46,XYqh+), т.е
различалась более чем двукратно и составляла 7,2% и 14,5% нормального
гаплоидного генома (3200 Mb), соответственно. Размер геномного Сгетерохроматина двух других пациентов составлял 336,28Mb (для
нормального кариотипа) и 300,28Mb (при кариотипе 46,XYqh–,16qh–), что
соответствует 10,5% и 9,4% гаплоидного генома.
Протяженность экстремальных вариантов Yqh- и Yqh+ была определена в
15,80 и 70,59 Mb. Размер двух экстремальных вариантов хромосом Y, таким
образом, отличается почти в 4,5 раза. У пациентов с кариотипами 46,XY и
48,XXYY, не имеющих хромосомных вариантов, размер гетерохроматиновых
сегментов Y отличался лишь на 3,56 Mb. Однако, при наличии двух хромосом
Y в кариотипе, его доля в геноме составляла 1,6%, в отличие от 0,9% при
нормальном хромосомном наборе.
Сравнительный анализ не выявил достоверных различий в степени
конденсации С-гетерохроматина интерфазных и метафазных ядер, что может
дополнительно свидетельствовать о его генетической инертности на всех
этапах митоза и, возможно, клеточного цикла.
Статистическая обработка показала высокую степень достоверности
полученных результатов. Для пациента с кариотипом 46,XYqh+, например,
эмпирически полученное значение размера гетерохроматина длинного плеча
хромосомы Y составляет: L = 70,59 ± 0,88 (Mb), а относительная
статистическая ошибка δ = 1,3%.
46,XY
336,28
46,XYqh-
Количество
замеров (по
1 гомологу
хромосомы
9р)
р=
%генома
Общий
геномный Сгетерохрома
тин, Mb
Количеств
о замеров,
полных
метафаз
(хромосом
)
р=
Гетерохромат
ин длинного
плеча (Yqh,
Mb)
10,5
6 (276)
0,02
29,82
300,28
9,4
8 (368)
0,01
46,XYqh+
464,71
14,5
9 (414)
48,XXYY
231,30
7,2
6 (288)
%генома
Кариот
ип
0,9
121
0,01
15,80
0,5
108
0,03
0,04
70,59
2,2
122
0,01
0,04
26,26 (х2)
1,6
114
0,01
500
80
450
70
400
60
350
50
300
46,XY
250
46,XYqh-
200
46,XYqh+
150
48,XXYY
46,XY
40
46,XYqh46,XYqh+
30
48,XXYY
20
100
10
50
0
Геномный Сгетерохроматин, Mb
0
Гетерохроматин длинного
плеча Yqh, Mb
ВЫВОДЫ
•
•
•
•
•
Разработанная программа анализа цифровых изображений
окрашенных хромосом позволяет определять размер
гетерохроматиновых сегментов хромосом in silico с точностью до
1Mb
Протяженность геномного С-гетерохроматина у четырех
индивидуумов варьирует в широких пределах и различается более
чем двукратно: от 231,3 Mb до 464,7 Mb, что составляет от 7,2% до
14,5% нормального гаплоидного генома, соответственно
Уровень вариабельности гетерохроматина Yq12 в рассмотренной
группе составляет 54,79 Mb, что почти в два раза превышает
величину нормального сегмента Yqh (~30Mb)
Отсутствие достоверного различия степени конденсации Сгетерохроматина в интерфазе и метафазе может свидетельствовать о
его генетической инертности в клеточном цикле
Проведенная статистическая обработка показывает высокую
степень достоверности полученных результатов. Разработанная
технология может быть использована в цитогенетической
диагностике для количественного анализа хромосомных вариантов,
а также в исследовательских целях (экология человека, генеалогия,
этногеномика)