Лекция 6. (Репликация

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
– период жизни клетки от одного деления до другого
или от деления до смерти
– Y-образная структура, перемещающаяся
вдоль родительской спирали ДНК и характеризующаяся местным
расхождением двух её цепей, в пределах которой происходит активная
репликация ДНК
– участок репликона, с которого начинается процесс
репликации
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
– полимеразная реакция, обеспечивающая процесс
матричного синтеза молекулы ДНК и приводящая к ее
самовоспроизведению (удвоению).
ЭЛЕМЕНТЫ
РЕПЛИКОН
ОРИДЖИН
РЕПЛИКАТИВНАЯ ВИЛКА
Сборка белковых комплексов и формированние репликативной
вилки начинается в определенной участке ДНК –
Схема ori вируса SV40
(origin recognition element) – участок связывания белка Т-антигена (Т-аg)
(DNA unwinding element) – участок для связывания белка,
расплетающего ДНК
– элемент, обогащенный АТ-нуклеотидами
(origin bidirectional replication) – начало двунаправленной репликации
– вспомогательный элемент, связывает димеры Т-антигена
– связывает фактор транскрипции Sp1
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
Инициация
• Образование пререпликативного
комплекса
• Формирование репликативной вилки
Элонгация
• Продолжение процесса репликации, рост
дочерней цепи ДНК
Терминация
• Завершение процесса репликации
Хромосома E. coli (4,2 млн. п.н.)
– один репликон
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
является репликазой, синтезирует обе цепи
ДНК, обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’
экзонуклеазной
действует на запаздывающей цепи для
удаления РНК-праймеров (5’ → 3’ экзонуклеазы) и дорепликации
очищенных мест ДНК, выполняет репаративную функцию,
обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’
экзонуклеазной
имеет отношение лишь к репарации, обладает
активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’ экзонуклеазной
По форме ДНКполимеразы можно
уподобить полураскрытой
кисти правой руки, в
которой ладонь, большой
палец и остальные пальцы
представляют три
основных
пространственных домена
и формируют полость,
удерживающую ДНКматрицу и затравку в ходе
синтеза.
«
» удерживают
однонитевую матрицу, а
«
»
прижимает праймер –
матричный двунитевой
участок.
ДНК-полимеразы работают совместно с различными
белковыми комплексами, удерживающими их в вилке
репликации. Их называют
и
(«sliding
clamp», «clamp loader»).
После объединения
ДНК-полимеразы с
зажимом, «загрузчик
зажима» отходит от
места реакции, но
держится поближе к
отстающей нити, чтобы
провести загрузку на
новом месте
объединения праймерматрица, как только
ДНК-полимераза
диссоциирует при
завершении синтеза
предыдущего
фрагмента Оказаки.
Осуществляет синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов Оказаки
при синтезе отстающей цепи.
Holo-фермент состоит из 10 субъединиц, каждая из которых
обладает своей функцией.
состоит из одной субъединицы (109 кДА) длиной 928 остатков,
которую можно разделить на три домена : N-концевую треть молекулы
занимает (5’→3’)-экзонуклеазный домен, в центре расположен самый
короткий (3’→5’)-экзонуклеазный домен, а самый большой
полимеразный домен находится на С-конце.
ДНК-полимераза II (состоит
из N-концевого (3’→5’)экзонуклеазного домена и
более длинного Сконцевого полимеразного
домена, не обладает 5’экзонуклеазной
активностью, лигируют
повреждённую цепь ДНК
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
ГИСТОНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ:
HU (…), IHF (integration host factor),
FIS (factor for inversion stimulation)
НЕ – HOLE-фермент
Репликация в
начинается с формирования
комплекса, в состав которого входят шесть
белков: DnaА, DnaВ, DnaС, НU, Girase и SSВ
Структура (ori С) E.coli
1. негативная суперспирализация ДНК
2. присутствием «легкоплавких» А-Т участков ДНК
3. Места для связывания со вспомогательными белками
:
1) узнает область начала репликации oriC,
последовательно связываясь с нонамерными
повторами в ДНК – блоками DnaA
2) способствует расплетанию легкоплавких АТ-богатых
участков ДНК oriC
3) вербует на расплетенные участки oriC DnaB (хеликазу)
Структура белка DnaA E. coli.
I-IV - области гомологии
бактериальных белков DnaA
1 - домен олигомеризации
2 - области связывания с
хеликазой DnaВ,
3 - сайт связывания нуклеотидов
4 - домен АТФазной активности
5 - участок взаимодействия с
мембранными фосфолипидами
6 - домен связывания с ДНК
Связывание
инициаторного белка
Dna A c ДНК
Сначала с 9 pb последовательностью связывается мономер
, затем
20–40 мономеров этого белка формируют большой агрегат.
ДНК ориджина опоясывает его, и цепи ДНК разъединяются в области трех
13 pb последовательностей.
На следующем этапе димер
присоединяется к комплексу
– формируется репликативная вилка.
а) присоединение
(инициирующий белок)
b) присоединение
(хеликазы)
c) Присоединение и
(праймазы) –
образование
, комплекса,
содержащего хеликазу
и праймазу
расплетает двухцепочечную ДНК при использовании энергии
АТФ. Скорость расплетения составляет около 6000 нукл. в сек.
удерживают одноцепочечные ДНК от ассоциации. По
мере продвижения репликационной вилки SSB диссоциируют с
одного места и присоединяются на другом. Этот процесс не
требует затрат энергии АТФ.
Формируется праймосома. Фермент
синтезирует
праймеры.
присоединяет к праймеру первый
нуклеотид.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
присоединяет к праймеру следующий нуклеотид. Идет
синтез ведущей и отстающей цепи. Обе цепи реплицируются синхронно,
что достигается взаимодействием хеликазы, праймазы и ДНК-полимеразы
и торможением синтеза лидирующей цепи во время синтеза праймеров.
Когда синтез на одном из фрагментов Оказаки достигает праймера другого
фрагмента
удаляет праймер, имеющейся у полимераз 5‘
→ 3' экзонуклеазной и 5’ → 3’ полимеразной активностью (исключение
праймера). После этого сахарофосфатный остов между фрагментами
сшивается ковалентной связью при помощи
.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ
aattagtatgttgtaactaaagt
tus (tbp) 36 кДа
Терминация репликации у
прокариот происходит, когда
«репликационная вилка»достигает
участка ДНК с особыми сайтами
и, если с ДНК этих сайтов
соединится продукт гена
.
Последовательность событий
1. DnaA узнает DnaA Box (регуляторный элемент около Ori), что
приводит к к расплетанию DNA в Ori
2. Хеликазы DnaB и DnaC связывают репликативную вилку с
противоположных сторон
3. DnaG (праймаза) присоединяется к комплексу, DnaC высвобождается,
остается комплекс xеликазы (DnaB) и праймазы (DnaG)
4. Хеликаза (DnaB) расплетает DNA, присоединяются белки SSB
5. DnaG (праймаза) синтезирует праймер
6. ДНК-полимераза III синтезирует лидирующую цепь и отстающую цепи
7. ДНК-полимераза I заменяет праймер, ДНК-лигаза сшивает фрагменты
8. Tus белки связываются с ter-последовательностями и останавливают
репликацию
9. Топоизомераза IV разъединяет ДНК