Сибирский федеральный университет Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики Отчет о Научно-исследовательской работе: Кинетика биолюминесцентной реакции, катализируемой бактериальной люциферазой Магистрант 2-го года: Авсиевич Татьяна Игоревна Научный руководитель: к. ф.-м. н., доцент кафедры биофизики ИФБиБТ Немцева Елена Владимировна Фундаментальная проблема • Структурно-динамическая организация белков • Принципы функционирования ферментов in vivo Практическая значимость Биолюминесценция Экологический мониторинг Клинический анализ Исследование экспрессии и регуляции генов Модель для исследования ферментативных процессов Остаются открытыми вопросы: • Характер взаимодействия реагентов • Формированиие возбужденного комплекса • Влияния модифицированных сред на биолюминесцентную реакцию 2 Современное состояние проблемы Экспериментальные данные «биферментная система+фактор» ? Математическая модель моноферментной реакции (Межевикин, 2011) Анализ экспериментальных данных с помощью мат. модели позволит: 1) Определить на какие этапы биолюминесцентной реакции влияет вязкость среды; 2) Проследить за изменением активности бактериальной люциферазы с увеличением вязкости среды; 3) Определить тип воздействия вязких сред на биолюминесцентную реакцию. 3 Цель и задачи магистерской диссертации Цель: Выяснить механизм воздействия вязких сред на кинетику моноферментной биолюминесцентной реакции. Задачи: 1) Зарегистрировать нестационарную кинетику биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи; 2) Проанализировать закономерности влияния вязких сред на кинетику реакции; 3) Проанализировать экспериментальные данные с помощью математической модели; 4) Выявить стадии реакции, наиболее подверженные влиянию вязких сред. 4 Цель и задачи практики Цель: Освоить методику регистрации нестационарной кинетики биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи Задачи: 1) Освоить методику работы на анализаторе кинетики быстрых процессов SFM-300/400 (BioLogic); 2) Адаптировать методику фотовосстановления флавинмононуклеотида для применения на анализаторе кинетики быстрых процессов; 3) Отработать методику регистрации нестационарной кинетики биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи. Практика была пройдена в Институте экспериментальной физики IV университета г. Байройт (Германия) при поддержке гранта ККФНиНТД. 5 Объект исследования Биолюминесцентная реакция бактерий Быстрое окисление субстрата (проблема!): 1) Нестационарная кинетика 2) Многосубстратная 3) Многостадийная Схема 2 RibP = CH2(CHOH)3CH2OP(O)(OH)2 J. W. Hastings, Q. H. Gibson, 1963 6 Результаты: фотовосстановление ФМН Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) стабилизатор 7 Результаты: фотовосстановление ФМН Разработанная методика Приготовление фотовосстановленного дегазированного раствора ФМН в буфере (в шприце для анализатора кинетики): 1) Вакуумная дегазация с применением ультразвуковой ванны Sonorex (BANDELIN); 2) Барботирование аргоном в течение 15 минут; 3) Наполнение шприца раствором с аргоновой «подушкой» сверху; 4) Облучение реагента в шприце светом ксеноновой лампы. Таблица 1. Состав реакционной смеси для фотовосстановления ФМН Реагент Объем, мкл Исходная концентрация, М Концентрация в шприце, М FMN 488 0,004 81*10-6 EDTA 12 000 0,02 0,01 Buffer 11 512 0,05 0,02 Sonorex (BANDELIN) 8 Результаты: фотовосстановление ФМН Контроль восстановления на спектрофотометре: Спектр поглощения восстановленного и окисленного ФМН Окисленный ФМН A445 = 0,56 Восстановленный ФМН A445 = 0,11 9 Кинетика окисления ФМН, снятая на Stopped-Flow SFM 300 (режим абсорбции) • Кинетика окисления ФМН при смешивании: 1 - с буфером 2 – с дегазированным буфером 10 Кинетика окисления ФМН при смешивании с буфером, снятая на Stopped-Flow SFM 300 (режим флуоресценции) • • • • Excitation wavelength : 445 nm Emission wavelength : 0 nm HV= 609V Total volume : 150 µl Flow : 12 mL/s • Dead time : 2 ms 11 Результаты: освоение анализатора Анализатор кинетики быстрых процессов Stopped-Flow SFM 300 • Одновременное смешивание 3-х реагентов • Минимальное мертвое время для микрокюветы 0.25ms 12 Результаты: освоение анализатора Оптическая ячейка TC-100/10F • Мертвый объем 30,2 L • Мертвое время 3 ms 13 Результаты: регистрация кинетики Методика регистрации биолюминесцентной вспышки Stopped-Flow SFM 300 Таблица 2. Реакционная смесь для каждого шприца Шприц Реагент Концентрация в шприце, µM Концентрация в кювете, µM R1 Альдегид в буфере 6 2 R2 Люцифераза в буфере 0,6 0,2 R3 Восстановленный ФМН 81 27 14 Результаты: регистрация кинетики Алгоритм регистрации кинетики биолюминесценции: • • • • • Заполнение экспериментальной установки азотом; Установить 0 для значений длин волн возбуждения и испускания; Включить напряжение ФЭУ: HV=600 V; Задать объем в зависимости от отношения смешиваемых объемов из каждого шприца; Мертвое время оценивается в зависимости от скорости потока и смешиваемого объема. • • • • • • Excitation wavelength : 0 nm Emission wavelength : 0 nm HV= 609V Total volume : 150 µl Flow : 12 mL/s Ratio : S1: 1, S2: 1, S3: 1 Dead time : 2 ms 15 Результаты: регистрация кинетики Варьирование концентрации альдегида Подбор адекватной концентрации альдегида для протекания биолюминесцентной реакции 16 Результаты: регистрация кинетики 17 Выводы 1. 2. 3. 4. Для получения кинетической кривой реакции, катализируемоуй бактериальной люциферазой, необходимо создание условий, приближенных к анаэробным: дегазация растворов ФМН, наполнение установки азотом и др. Экспериментальные условия с «мертвым» временем около 2 ms позволяют регистрировать полную кинетическую кривую биолюминесцентной реакции, включающую не только спад, но и начальный рост светоиспускания; Требуются дополнительные меры по гомогенизации раствора альдегида (не только с точки зрения контроля концентрации, но и для корректной работы установки). Для более полного отображения механизма действия люциферазы требуется проведение эксперимента с введением вязких сред. 18