Преаналитический этап в коагулологии

Преаналитический этап в
коагулологии.
Понятие о коагулограмме и контроле
качества проводимых исследований.
Принципы коагуляционных
тестов.
•Клоттинговые:
-мануальное определение
-автоматическое определение
•Хромогенные:
-двухточечное измерение
-кинетическое измерение
Фибриноген повышается
при:
•воспалении (БОФ)
•гиперлипопротеидемии
•сахарном диабете
•гипертензии
•ожирении
•стрессе
•курении
Принципы коагуляционных
тестов.
Хромогенный субстрат состоит из
короткой пептидной цепи, связанной
с красителем (например, pNA).
Окрашивание развивается при отщеплении молекулы красителя от
пептидной цепи под действием активированного фактора свертывания.
Интенсивность развившейся окраски
служит методом оценки активности.
Принципы коагуляционных
тестов.
•Иммунологические:
-радиальная иммунодиффузия
-электроиммунодиффузия
-латексная агглютинация
-нефелометрия и турбидиметрия
-иммуноферментный анализ
-радиоиммуноанализ
Принципы коагуляционных
тестов.
Молекулярно-генетические исследования для выявления мутаций, ответственных за развитие заболеваний, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР).(Гемофилия А, В, болезнь Виллебранда, наследственный дефицит ATIII, протеинов C и S, фактора Лейдена, XII).
Антикоагулянт
Na3C6 H5 O7. 2 H2 O
M.м. 294,12 (3,13г/100мл)
Na3C6 H5 O7. 5,5 H2 O
M.м.357,18 (3,8г/100мл)
0,106 моль/л
Цитрат предотвращает коагуляцию за
счет связывания ионов кальция.
Взятие образца
•Кровь берется из периферической (чаще
кубитальной) вены
•Кровь берется в цитрат в соотношении
1:10 (1 объем цитрата к 9 объемам крови)
•Неправильное соотношение влияет на
результаты теста (концентрация цитрата,
разбавление крови)
•Разведение более 1:12 (добавление большего объема крови) ведет к активации
свертывания, что проявляется в
укорочении времени свертывания.
•Добавление малого количества крови
ведет к большему разведению плазмы и
удлинению времени свертывания за
счет разведения всех компонентов
плазмы и кальция в стандартных реагентах.
Ht между 25% - 55% не оказывает
существенного влияния на
результаты скрининговых тестов.
При Нt более 55% (у новорожденных, при полицитемии и др.) отношение кровь/цитрат должно быть
скорректировано .
Процедура взятия крови.
•Цель наложения жгута (манжеты)
при взятии крови - предотвратить обратный ток венозной
крови при сохранении кровотока
в капиллярах.
Процедура взятия крови.
•Давление жгута (манжеты) должно
быть ниже диастолического примерно
на 10 мм. рт.ст.
•Компрессия более 60 сек. или с избыточным давлением ведет к локальной активации фибринолиза и
возрастанию активности некоторых
факторов.
Стаз длительнее 3 минут приводит к:
•укорочению ПВ, АПТВ, ТВ
•увеличению примерно на 10% уровня фибриногена, АТ III
•Увеличению примерно на 20% фактора Y III:С
Процедура взятия крови.
Важно во время взятия крови максимально ограничить контактную активацию факторов свертывания крови и
тромбоцитов.
В этом процессе ведущую роль играют
смачиваемость поверхности игл и пробирок.
Игла должна быть с широким просветом, сухая и силиконированная.
Методы взятия:
•«бабочкообразная» игла - кровь
забирается в силиконизированную стеклянную центрифужную
пробирку или пластиковую
пробирку, градуированную, содержащую антикоагулянт.
Методы взятия:
•Моноветт(аспирационный метод)- градуированный шприц, содержащий раствор цитрата натрия (коммерческая система)
•Вакутейнер (вакуумный метод)коммерческая система, содержащая раствор цитрата натрия
СТАД пробирки
- коммерческие пробирки, содержащие кроме цитрата натрия,
теофилин, аденозин и дипиридамол, которые предотвращают
активацию тромбоцитов за счет
повышения концентрации
цАМФ.
СТАД пробирки применяются
при:
•определении факторов тромбоцитов (PF4,  -тромбоглобулина)
•определении гепарина у пациентов, получающих гепарин (НФГ и
НМГ) - АПТВ и ТВ могут быть
ложно нормальными
•определении ингибитора активатора плазминогена (PAI-1)
СТАД пробирки
•существуют в виде вакутейнеров
•пробирка после взятия крови должна
немедленно помещаться в ледяную
баню
•образцы должны центрифугироваться в криоцентрифуге (+2о - +8о С)
•скрининговые тесты могут выполняться из СТАД плазмы
Взятие образца
•Первый мл крови должен быть
«выброшен», или для исследования
гемостаза должна быть взята вторая
пробирка
•Кровь должна течь быстро и «самотеком»
•Кровь должна быть перемешана с
антикоагулянтом немедленно после
взятия
Взятие образца
Аккуратная проверка образцов крови позволяет избежать следующих
ошибок:
•неправильное соотношение
кровь/цитрат
•частично свернувшаяся кровь
•гемолиз
•иктерическая или липемическая
плазма
Взятие образца
Исследование крови из центрального катетера должно проводиться в
исключительных случаях. На
результаты влияет:
•мертвое пространство внутри катетера с возможным стазом крови
•активация свертывания на стенке
катетера
•применение инфузионных растворов
и гепарина
Взятие образца капиллярной крови
(в соответствии со стандартом DIN
58910-D)
Чистое и сухое место кончика пальца
или ушной мочки пациента пунктируется
стерильным скарификатором. Прокол
должен быть достаточно глубоким. Недопустимо давление или сжатие.
Необходимое количество крови (10-50мкл)
забирается в стерильный капилляр в течение 10 сек. Капиллярная кровь используется для адаптированных методов.
Центрифугирование крови
•Цитратная плазма богатая тромбоцитами - центрифугирование в течение 5 мин.при 100g (примерно 800
об/мин стандартной центрифуги).
Торможение центрифуги должно
быть плавное. Супернатант используется для исследования функции
тромбоцитов.
Центрифугирование крови
•Цитратная плазма, бедная тромбоцитами - кровь центрифугируется 10
мин. при 1500 - 2000g ( около 3000
об/мин)
В такой плазме тромбоциты содержатся в малых количествах.
Используется для большинства тестов.
Центрифугирование крови
•Цитратная плазма, бестромбоцитная- плазма бедная тромбоцитами
центрифугируется 20 мин. при 2500 g
( около 4000 об/мин)
•При необходимости замораживается
бестромбоцитная плазма.
Относительная центробежная сила(g)
может быть рассчитана с помощью
уравнения или по номограмме.
Rcf = 1,118 x 10-5 x r x n2
r - среднее радиальное расстояние от
оси вращения в см
n - скорость вращения в об./мин.
1,118 х 10-5 -константа, учитывающая ускорение силы тяжести
Температурные режимы хранения
проб.
•образцы должны храниться при
комнатной температуре, если исследуютя в ближайшее время
•необходимо избегать повышенных
температур
•хранение в холодильнике(+4оС) ведет
к холодовой активации YII, XI, XII
факторов
Температурные режимы
хранения проб.
•скрининговые тесты должны быть
выполнены в течение 4 часов после
взятия крови
•исследование фактора YIII в течение 2 часов после взятия крови
•более длительное хранение выдерживают факторы II, YII, X , ATIII, протеин С, кофактор ристоцетина
Температурные режимы хранения
проб(при замораживании).
•YIII фактор сохраняется:
- 2 недели при - 20оС
-до 1 года при - 70оС
•при замораживании/оттаивании воспроизводимые результаты наблюдаются,
если плазма не содержит фибрин-мономеров, ПДФ и гепарина (после оттаивания удлиняется АПТВ, ТВ и РВ, отрицательный тест на РФМК)
Положение тела влияет на количество форменных
элементов, концентрацию белков,
особенно у больных с отеками.
Уровень этих параметров выше у
пациентов в вертикальном положении.
Для получения сравнимых результатов образцы крови должны забираться при одном и том же положении
тела.
Синтез факторов свертывания начинается с 10 недели эмбрионального
периода.
Уровень факторов варьирует как у
недоношенных, так и доношенных
новорожденных.
Фибриноген и фактор YIII к рождению достигают уровня взрослого человека, а остальные - в течение 6 месяцев.
Факторы свертывания подвержены
циркадным изменениям.
Наименьшие концентрации фибриногена и других факторов наблюдаются в начале ночи.
Другие параметры могут иметь иной
биоритм (например, максимум PAI-1
- между 2 и 6 часами ночи), а у ATIII
не выявлено суточных колебаний.
С учетом возможных колебаний взятие крови проводить от 7 до 9 час.утра
Физический и эмоциональный
стресс:
•АПТВ укорачивается
•концентрация ф.YIII увеличивается
•концентрация ФВ увеличивается
•активность t-PA увеличивается
•скриниговые тесты на фибринолиз
становятся патологическими
Диета и гемостаз
•пища с высоким содержанием животных жиров : ФАК
•фрукты и свежие овощи : ФАК
•Рыбная диета: тромбоциты , фибриноген , агрегация тромбоцитов
•чеснок: фибриноген , агрегация
тромбоцитов
Диета и гемостаз
•дисбаланс кишечной флоры (например,после антибиотикотерапии), нарушение всасывания жиров в кишечнике может привести к дефициту витамина К
•кофеин (кофе и т.д.) приводит к
увеличению t-PA и снижению активности PAI-1
Диета и гемостаз
•алкоголь вызывает: АТIII, Ф - снижение, PAI-1, t-PA, кофактор ристоцитина - возрастание
•хронический алкоголизм :снижение
количества тромбоцитов
•кокаин : увеличение аграгации тромбоцитов, тромбоцитопения
•курение:увеличение агрегации, адгезии, освобождение t-PA, увеличение Ф,
снижение активности ф.YII
Лекарства и гемостаз.
•Анальгетики(индометацин, ибупрофен, напроксен, фенилбутазон, диклофенак) -ингибируют агрегацию тромбоцитов
•Оральные контрацептивы:
снижение ATIII, увеличение агрегации тромбоцитов
•Аспарагиназа: снижение Ф, ATIII,
Pr.C и S витамин-К зависимых факторов, плазминогена
Лекарства и гемостаз.
•Кровозаменители(декстраны):снижение адгезии и агрегации тромбоцитов, увеличение ВК, укорочение ТВ и
РВ
•Антибиотики: дефицит витамина К
•Вальпроевая кислота:тромбоцитопения, снижение Ф, «приобретенный»
синдром Виллебранда
НОРМАЛЬНАЯ ПЛАЗМА (НП)
(референтная, 100% значения)
пул цитратных бестромбоцитных
плазм, полученный от 20 или более
клинически здоровых людей, исследованных на отсутствие нарушений
гемостаза.
Лиофилизированная НП должна
быть калибрована производителем
против свежей или свежезамороженной НП ( -70о С)
Референтная плазма
(100% значения)централизованно приготовленная
нормальная плазма, критерии и
процедура приготовления которой определены в стандарте
DIN 58939-1
КАЛИБРОВОЧНАЯ ПЛАЗМА
(значения могут отличаться от 100%,
но должны быть точно определены
по сравнению с референтной,
нормальной плазмами).
Используется для многоточечной
калибровки.
Существует набор калибровочных
плазм с различной концентрацией
или активностью. Их использование
предотвращает разведение факторов.
КАЛИБРОВОЧНЫЕ КРИВЫЕ.
Взаимосвязь между временем и
активностью чаще нелинейна. Для
линейного представления калибровочной кривой используются различные системы координат:
•обратная ( для ПВ)
•полулогарифмическая(для факторов)
•факторы калибровки (при использовании для определения ATIII методики с хромогенным субстратом)
Гепарины
•нефракционированный гепарин
(НФГ)-смесь фракций с разной
длиной полимерной цепи и имеет
м.м. от 3 000 до 30 000 Д
•низкомолекулярные фракции
гепарина (НМГ) имеют м.м.
от 3 000 до 7 000 Д
Гепарины
Связывание гепарина с АТIII превращает последний из медленно действующего ингибитора в очень быстрый ингибитор.
НФГ
(IIa + ATIII + НФГ) и (Ха + ATIII + НФГ)
НМГ
•не могут надежно образовывать (IIa + ATIII +
НМГ)
•преимущественно блокирует фактор
Ха
СХЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Внутренний механизм
XIIa +Калликреин,ВМК
XI
IX + XI a
Тканевой активатор
YII
YIIa+ТФ+Са2+
Ca2+
IXa
X
XII
Внешний механизм
YIII
Са2+ ,
ф/липиды
Xa
Ca2+
YIIIa
IIa
ф/липиды
II
Y
АТ III + гепарин
IIa
Ya
IIa
фибриноген
фибрин
АП(Ч)ТВ
АКТИВИРОВАННОЕ ПАРЦИАЛЬНОЕ
(ЧАСТИЧНОЕ) ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ
ВРЕМЯ
Отражает изменение активности
факторов
ВНУТРЕННЕГО пути свертывания
крови:
YIII, IX, XI, XII, X, Y, II , I
Тест чувствителен к ГЕПАРИНУ,
ингибиторам
АПТВ
К плазме без тромбоцитов
добавляют:
•активаторы контактной фазы
свертывания (каолин, силикаты,
эллаговая кислота )
•парциальные тромбопластины
(фосфолипидная смесь, заменяющая
PF 3)
•хлорид кальция
АПТВ
Тест не стандартизован ВОЗ.
В качестве заменителя PF3 используют тромбоциты, ФЛ животного происхождения(мозг кроликов, быка или
человека), растительные ФЛ (сои),
смесь растительных и животных ФЛ,
ФЛ мембран эритроцитов человека
(эрилид, эритрофосфатид). Реагенты
отличаются по типу активатора (каолин, эллаговая кислота, буфер и т.д.)
ПРИЧИНЫ УДЛИНЕНИЯ АПТВ:
• снижение активности факторов внутреннего пути активации свертывания
• наличие гепарина в пробе
• наличие в пробе продуктов деградации фибрина/фибриногена (ПДФ)
•наличие в пробе патологических
ингибиторов
Лабораторный контроль НФГ
определяется дозами и путем
введения препарата.
Дозы менее 20 000 ЕД/сутки
считаются профилактическими (200
ЕД/кг/день) - не требуют
лабораторного мониторинга.
Лабораторный контроль терапевтических доз НФГ(400-800 ЕД/кг/день)
__________________________________
Метод
Время взятия АПТВ пациента
введения
крови
АПТВ до введения
___________________________________________
Перфузия Любое время 2 - 2,5 (НФГ 0,4-0,6
ЕД/мл)
В/В
1 час до следую- 1,5 - 2 (НФГ 0,15-0,3
болюсно щей инъекции
ЕД/мл)
П/К
Между 2 инъек2-3 раза/д.
циями
2 - 2,5 (НФГ 0,4-0,6
ЕД/мл )
НМГ
(соотношение анти-Ха / анти - IIа)
•ФРАКСИПАРИН (надропарин кальциевая соль) - 3,5 : 1
•ФРАГМИН (дальтепарин натриевая
соль) - 2,2 : 1
•КЛЕКСАН, ЛОВЕНОКС (эноксапарин
натриевая соль) - 3,9 : 1
Контроль за лечением НМГ
Допустимо профилактическое назначение препаратов НМГ с учетом
массы тела пациента в дозировке,
рекомендуемой производителем, без
лабораторного
мониторинга.
Контроль за лечением НМГ
Терапевтическая концентрация НМГ должна соответствовать определенному
уровню анти - Ха активности плазмы
(0,2 - 0,4 МЕ/мл).
Не осуществляется контроль по АПТВ,
т.к. НМГ обладает преимущественно
анти-Х-а действием.
Оценка анти Х-а активности с использованием хромогенного субстрата не входит
в международные протоколы.
Мониторинг достигаемых эффектов
терапии НМГ
-динамика уровня эндогенной
тромбинемии:
•РФМК
•тромбин-антитромбиновый комплекс
•фрагменты протромбина 1+2
•Д-димер
СХЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Внутренний механизм
XII
Внешний механизм
XIIa +Калликреин,ВМК
XI
IX + XI a
Тканевой активатор
YII
YIIa+ТФ+Са2+
Ca2+
IXa
ПротеинС
+протеин S
X
Тромбомодулин,тромбин
Са2+ ,
ф/липиды
YIII
АРС
IIa
YIIIa
Xa
Ca2+
ф/липиды
II
Y
IIa
Ya
IIa
фибриноген
фибрин
АНД препятствуют образованию
в гепатоците
полноценных
карбоксилированных факторов,
образуя PIVKA
( Proteins, Induced in Vitamin K
Absence ),
у которых снижена способность
связывать
ионы кальция.
Предшественники
фактора свертывания
«Полный» фактор
свертывания
активация
Восстановленный
витамин К
Эпоксид
витамина К
Эпоксидредуктаза
витамина К
ингибирование
ВАРФАРИН
Варфарин обеспечивает более
стабильное воздействие на процесс
свертывания крови.
Фенилин токсичен.
Пелентан обладает неустойчивым
антикоагулянтным эффектом.
Протромбиновое время
удлиняется:
•при заболеваниях печени
•при приеме антагонистов
витамина К
•при дефиците витамина К
•коагулопатии потребления
Тест Квика отражает
нарушение активности
трех витамин-К зависимых
факторов (YII,X,II),
фибриногена и фактора Y
Основным реагентом является
тромбопластин,содержащий
тканевой фактор и
фосфолипиды.
ВЛИЯЮТ НА ТЕСТ:
•тип используемого тромбопластина
(полученный из разных органов и видов
животных)
•тип добавок в реагент (ф.Y,I и антагонисты гепарина
•измерение мануальное или автоматическое
•использование плазмы или капиллярной
крови
ПРОТРОМБИНОВЫЙ ИНДЕКС
(ПИ)
протромбиновое время
нормальной (100%) плазмы
ПИ=
х100%
протромбиновое время
образца
ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ В
ПРОЦЕНТАХ (%)
КАЛИБРОВОЧНАЯ КРИВАЯ
ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ
ПЕРЕСЧЕТА ПРОТРОМБИНОВОГО
ВРЕМЕНИ ПАЦИЕНТА В % ОТ
НОРМЫ
(% АКТИВНОСТИ ФАКТОРОВ
ПРОТРОМБИНОВОГО
КОМПЛЕКСА)
ПРОТРОМБИНОВОЕ
ОТНОШЕНИЕ
(ПО)
протромбиновое время
образца
ПО=
протромбиновое время
нормальной (100%) плазмы
МНО определяется как ПО,
полученное при использовании
тромбопластина, приготовленного в
соответствии с международными
стандартами.
Необходимо знать его
международный индекс
чувствительности
(International Sensitivity Index, ISI)
Определение МНО
МИЧ (ISI)
ПВ пациента
МНО (INR) =
ПВ
нормальной
плазмы
МНО = Международное Нормализованное
МИЧ =
Отношение
Международный Индекс
Чувствительности
Пример расчета МНО
Отношение ПВ (РНПлиофил)/ПВсвеж.плазмы
=1,14
ПВ (РНП,контроля) =16 сек.
ПВ (100%) = 16/1,14 = 14 (сек)
ПВ(пациента) = 37 сек.
ПО = 37 / 14 = 2,64
МИЧ = 1,2
МНО =
1,2
2,64 =
3,2
Пример расчета МНО
МНО=(ПВ(пац.)/ПВ(РНП)хК)мич
К=0,88
ПВ (РНП,контроля) =16 сек.
ПВ(пациента) = 37 сек.
ПО = 37 / 16х0,88 = 2,63
МИЧ = 1,2
МНО = 2,631,2
Доза варфарина назначается в 17-19 ч.
МНО на следующий день не исследуется.
МНО на 2 день и далее исследуется в 9-11ч.
Больные имеют высокую, обычную и низкую
чувствительность к варфарину, что влияет на
применяемую дозу с учетом показаний МНО.
Показания к применению АНД
МНО
Профилактика и лечение
венозных тромбозов
2,0 - 3,0
Лечение ТЭЛА
Инфаркт миокарда
Мерцательная аритмия
Тканевые протезы клапанов
сердца_______________________________
Механические клапаны
сердца
2,5 - 3,5
Уровни МНО:
•высокий - МНО от 2,5 до 3,5
•средний - МНО от 2,0 до 3,0
•низкий - МНО от 1,6 до 2,0
Периоды:
•нестабильный - до 6 недель от начала
приеме АНД
•стабильный - после 6 недель от начала
приема
Элиминация кумаринов из крови у
стариков замедлена:
МНО следует поддерживать на
уровне 1,4 - 1,7
Кожные некрозыв первые дни приема варфарина
(от 3 до 8 дня)-депрессия протеинаС:
тромбируются микрососуды в коже.
Ослабляют эффект АНД
•Повышенное поступление витамина К с пищей (вегетарианское питание, географические
особенности питания)
•Связывание АНД в кишечнике (холестирамин)
•Стимуляция активности системы цитохрома
Р450 в печени,повышающей метаболизм АНД
(медикаменты, хронический алкоголизм)
•Генетическая резистентность к АНД
•Снижение катаболизма факторов II,YII, IX, X,
протеинов С,S и витамина К (гипотиреоз)
Усиливают эффект АНД
•Недостаточное поступление витамина К с
пищей
•Недостаточная абсорбция витамина К в
кишечнике (малабсорбция, обструкция
желчевыводящих путей)
•Недостаточная продукция витамина К в
кишечнике (антибиотики)
•Взаимодействие с циклом витамина К (второе
и третье поколение цефалоспоринов)
•Повышение катаболизма факторов II,YII,IX.X,
протеинов C,S и витамина К (гипертиреоз)
Diagnostics
Коагучек® С
Портативный экспресскоагулометр
АНТИАГРЕГАНТЫ
АСПИРИН(ТРОМБОАС и др.) - ингибитор
циклооксигеназы (СОХ-1)
КЛОПИДОГРЕЛЬ (ПЛАВИКС), ТИКЛОПИДИН (ТИКЛИД) - блокаторы АДФ-рецепторов
СУЛОТРОБАН,ПИКОТАМИД - ингибиторы
тромбоксансинтетазы
ВАНИПРОСТ - блокатор тромбиновых
рецепторов
REO PRO, ИНТЕГРИЛИН - антагонисты
IIb/IIIa рецепторов
ИЛОПРОСТ, БЕРАПРОСТ - производные
простациклина
ТРЕНТАЛ,КУРАНТИЛ -комплексное действие
КОНТРОЛЬ ЗА АНТИАГРЕГАНТНОЙ ТЕРАПИЕЙ
ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ПО АГРЕГАЦИОННОЙ ФУНКЦИИ
ТРОМБОЦИТОВ.
При применении ПЛАВИКСА, ТИКЛИДА исследуется АДФ_агрегация.
При применении аспирина и его аналогов адреналин-агрегация.
Эффективной терапия считается при
снижении
показателей агрегатограммы в 3-4 раза
от исходных цифр.
Биологическая вариация.
CVi %-коэффициент внутрииндивидуальной
биологической вариации
CVG%-коэффициент межиндивидуальной биологической вариации
CVi %
CVG%
Тромбоциты
9,1
АЧТВ
2,7
Протромбиновое время 4,0
Фибриноген
10,7
ATIII
5,2
Фактор YIII
4,8
21,9
8,6
6,8
15,8
15,3
19,1
Целевые значения
В - целевое значение смещения средней арифметической от установленного значения,%
CV -целевое значение коэффициента общей
аналитической вариации,%
Тромбоциты
АЧТВ
ПВ
Фибриноген
ATIII
Фактор YIII
+ В%
8,9
3,4
3,4
7,2
6,1
7,4
+CV%
6,8
2,2
3,0
8,0
3,9
3,6
Предел допустимых значений
Тромбоциты
+В10% +CV10% +В20% +CV20%
13,1
АЧТВ
4,8
ПВ
4,8
Фибриноген
12,2
ATIII
8,5
YIII ф.
9,6
11,2
3,7
4,9
13,1
6,4
5,9
11,9
4,4
4,3
10,7
7,8
9,0
9,3
3,1
4,1
11,0
5,3
4,9