файл презентации проекта

«Исследования и разработки по
приоритетным направлениям развития
научно-технологического комплекса России
на 2014 – 2020 годы»
Руководитель проекта: с.н.с., к.с-х.н. Чернухин В.А.
 Приоритетное направление: Науки о жизни.
 Критическая технология: Биокаталитические,
биосинтетические и биосенсорные технологии.
 Плановое финансирование проекта: 8,75 млн. руб.
 Бюджетные средства: 3,5 млн. руб.,
 Внебюджетные средства: 5,25 млн. руб,, в том числе:
- в 2014 году в размере 1 250 000 (Один миллион двести пятьдесят
тысяч) рублей,
- в 2015 году в размере 4 050 000 (Четыре миллиона пятьдесят
тысяч)
 Исполнитель: Общество с ограниченной
ответственностью «СибЭнзайм»
Проект направлен на
 Расширение методологической базы для поиска и
клонирования генов новых ферментов.
 Связанной с этим поиском расширением
ферментной базы для эпигенетики, в частности,
онкодиагностики.
Цели проекта
1.
2.
3.
Поиск в коллекции природных штаммов энтеробактерий
продуцента новой МD-эндонуклеазы, кодируемой геном,
последовательность которого гомологична гену МDэндонуклеазы MteI.
Создание методами биоинженерии рекомбинантного
штамма-продуцента новой метилзависимой сайтспецифической ДНК-эндонуклеазы (МD-эндонуклеазы),
востребованной для использования в эпигенетике и
онкодиагностике.
Исследование полученной генетической конструкции,
технологических характеристик штамма-продуцента и
специфичности продуцируемой рекомбинантной МDэндонуклеазыi
Конечные продукты
 Рекомбинантный штамм-продуцент новой
метилзависимой сайт-специфической
эндонуклеазы (MD-эндонуклеазы)
 Препарат фермента, выделенного из него.

Новый фермент должен позволять детектировать
эпигенетические изменения генома, проявляющиеся
как определённый узор метилирования ДНК, что делает
его важным инструментом в эпигенетике и
онкодиагностике.
Обоснование принципов детекции
опухолевых клеток с помощью нового
фермента.
Предлагаемый принцип получения
рекомбинантных штаммов-продуцентов новых
MD-эндонуклеаз
 За основу поиска взята первичная структура
белковой последовательности MDэндонуклеазы MteI (узнаёт метилированную
последовательность 5’-GCGCNGCGC-3’).
 В базе данных ищутся гомологи в геномах
энтеробактерий:




Находятся консервативные последовательности
Разрабатываются праймеры для ПЦР
Проводится ПЦР-скрининг
Амплифицированные фрагменты встраиваются в
плазмиду pUC19.
_____________________
 Почему энтеробактерии?
 В разных группах энтеробактерий есть
высококонсервативные последовательности,
гомологичные MteI?
 MteI – сайт-специфическая ДНК-
эндонуклеаза, расщепляющая только С5метилированную ДНК и не расщепляющая
метилированную.
Была собрана коллекция энтеробактерий –
97 штаммов из природных источников
 Высев на чашку со
средой Эндо
 Поиск эрвиний в
опухолях растений
Создан нетрудоёмкий метод быстрого
минипрепаративного выделения
геномной ДНК из энтеробактерий.
 Для выделения
достаточно 1/10-1/2
спичечной головки
биомассы, которую
можно взять с
отдельного клона на
чашке Петри.
 На выделение тратится
менее 2 часов.
Проведение биоиформационных
исследований и разработка праймеров для
проведения ПЦР-скрининга
Enterobact1 (1) --------------MSAREAYRQYREAVTACKDIFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG
Enterobact2 (1) --------------MSAREAYRQYREAVTACKGIFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG
Enterobact3 (1) --------------MSAREAYRQYREAVTACKGIFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG
Enterobact4 (1) ---------------MHVKHIGSIEKRWLLAKAFFARGGNVTGDYGEHLVKQLYG
MteI (1)
MTEPSLPFDPTALTVRQLLAAHVAILDELTRRGLIRTRNSPLGDLAETLAVRAYG
Enterobact1 (42) GELLPNSHKSADVRLDDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN
Enterobact2 (42) GELLPNSHKSADVRLGDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN
Enterobact3 (42) GELLPNSHKSADVRLGDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN
Enterobact4 (41) GELLPNSHKSADVRLSDGTLLQVKTRVNKTQLG------GIRSWDFDYLIGIQLN
MteI
(56) GTLAPNSEKSFDLTAADGRRIQVKARLVDPGDKRSQTFSAFRSFDFDAAVFVLFD
Enterobact1 (91) DDAEVMLAVRVPVDVCRQIAG-YASHDNKFVIHLNGVLLKTPGVENVTEEFQSV
Enterobact2 (91) DDAEVMLAVRVPVDVCRQIAG-YASHDNKFVIHLNGVLLKTPGVENVTEEFQSV
Enterobact3 (91) DDAEVMLAVRVPVDVCRQIAG-YASHDNKFVIHLNSVLLKTPGVENVTEEFQSV
Enterobact4 (90) EDAEVVMAVRVPVGICRQIAG-YASHDNKFVIHLNGVLLKTPGVENVTEEFRQCN
MteI
(111) TRSYDLLWARELTSDDVAVLGRRTEHVRATAITVRAVRAAGADVTEQLRRAYDQV
Enterobact1 (144) ---Enterobact2 (144) ---Enterobact3 (144) ---Enterobact4 (144) P--MteI
(166) DEPR
Выравнивание аминокислотных последовательностей
Enterobact1 (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAAG
Enterobact2 (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAGG
Enterobact3 (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAGG
Enterobact4 (1) ----GTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGGCTGCTTGCAAAG
Consensus (1) ATGAGTGCACGTGAAGCATATCGGCAGTATCGAGAAGCGGTGACTGCTTGCAAGG
Enterobact1 (56) ACATTTTT-GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTACGGTGAACATCTCGTAA
Enterobact2 (56) GCATTTTT-GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA
Enterobact3 (56) GCATTTTT-GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA
Enterobact4 (52) GCATTTTTTGCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA
Consensus (56) GCATTTTT GCCCGAGGTGGTAATGTCACTGGTGATTATGGTGAACATCTCGTAA
Enterobact1 (110) AGCAACTTTATGGTGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTCAG
Enterobact2 (110) AGCAACTTTATGGCGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG
Enterobact3 (110) AGCAACTTTATGGCGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG
Enterobact4 (107) AGCAACTTTATGGGGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG
Consensus (111) AGCAACTTTATGGCGGTGAATTATTGCCAAACTCCCATAAAAGCGCCGATGTAAG
Выравнивание
высококонсервативных
нуклеотидных
последовательностей
последовательнсотей
Enterobact1 (165) ATTAGACGATGGCACGCTGTTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA
Enterobact2 (165) ATTAGGCGATGGCACGCTATTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA
Enterobact3 (165) ATTAGGCGATGGCACGCTATTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTG
Enterobact4 (162) ATTAAGCGATGGGACGCTGTTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA
Consensus (166) ATTAGGCGATGGCACGCTGTTGCAGGTCAAAACCAGAGTCAATAAAACCCAGTTA
Enterobact1 (220) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG
Enterobact2 (220) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG
Enterobact3 (220) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG
Enterobact4 (217) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGCATTCAGCTTAATGAAG
Consensus (221) GGCGGAATTCGCTCCTGGGATTTCGATTACCTGATCGGTATTCAGCTTAATGACG
Enterobact1 (275) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC
Enterobact2 (275) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC
Enterobact3 (275) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC
Enterobact4 (272) ATGCCGAAGTAGTGATGGCAGTTCGTGTCCCTGTGGGTATTTGTCGCCAAATTGC
Consensus (276) ATGCCGAAGTCATGTTGGCAGTTCGTGTCCCTGTAGATGTTTGTCGCCAAATTGC
Enterobact1 (330) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATGGCGTGCTTCTT
Enterobact2 (330) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATGGCGTGCTTCTT
Enterobact3 (330) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATAGCGTGCTTCTT
Enterobact4 (327) CGGATATGCCAGCCACGATAACAAATTTGTGATTCATCTCAATGGCGTGCTTCTT
Consensus (331) CGGATATGCCAGCCATGATAACAAATTTGTGATCCATCTTAATGGCGTGCTTCTT
Enterobact1 (385) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAATCCCTAA
Enterobact2 (385) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACCGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAA------Enterobact3 (385) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAA------Enterobact4 (382) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTC-GTCAATGTAATCCTTAA
Consensus (386) AAAACGCCTGGCGTAGAAAACGTCACTGAAGAGTTTCAGTCAGTGTAATCC TAA
Высококонсервативные
гомологи обнаружены в
родах Escherichia, Klebsiella,
Cronobacter , Erwinia.
По итогам описанных биоинформационных
исследований был проведён дизайн трёх
праймеров (один прямой и два обратных):
 Entero direct
 Entero reverse 1
 Entero reverse 2
5' - ATGAGTGCACGTGAAGCATATC-3'
5'-TTAGGGATTACACTGACTGAAACTCTTC- 3'
5’- TTACACTGACTGAAACTCTTC -3’.
ПЦР-скрининг
 Фрагмент №17 был
встроен в
полилинкер pUC19
по сайту SmaI
 Полученная
плазмида получила
временное
обозначение pEsp17
Тестирование сайт-специфической MDнуклеазной активности в клоне № 17
М- маркёр 1 kb; 1 – 3 мкл лизата; 2 – 1 мкл лизата; 3 –
1/3 мкл лизата.
Анализ экспериментального образца –
препарата рекомбинантной плазмиды Esp17
согласно ПМ
 Клоны E.coli штамма XLGold, выросшие после
трансформации 0,1 мкл
препаратом плазмиды
 - Тестирование активности целевого
фермента в 5 трансформантах
(последовательные разведения лизата – 3, 1
и 1/3 мкл)
Анализ экспериментального образца –
биомассы штамма-продуцента согласно ПМ
1-6 – последовательные 2кратные разведения лизата в
реакционной смести,
содержащей
pHspAI10/(DriI+M.Fsp4H) в SEбуфере «W»;
7 – исходная
ДНКpHspAI10/(DriI+M.Fsp4H);
8 – ДНК фага λ;
9 – ДНК фага λ в SE-буфере
«Y», обработанная 1 мкл лизата.
Анализ экспериментального образца –
препарата MD-эндонуклеазы согласно ПМ
1-10
–
последовательные
разведения препарата Esp17 в 2
раза в SE-буфере «W» c ДНК
pHspAI10/(DriI+M.Fsp4H),
начиная от аликовоты 1 мкл на
20 мкл реакционной смеси;
11
ДНК
pHspAI10/(DriI+M.Fsp4H);
12 – ДНК фага λ;
13 - ДНК фага λ, обработанная 1
мкл Esp17; М – маркёр 1 kb.
Анализ сайт-специфичности Esp17 на
различных С5-метилированных ДНК
 1 – pMHpaII/DriI;
 2 – pMHpaII/DriI + Esp17;
 3 – pMHaeIII /DriI;
 4 – pMHaeIII I/DriI + Esp17;
 5 – pHspAI2;
 6 – pHspAI2/DriI + Esp17;
 7 – pHspAI10/DriI;
Выводы:
- полученный гомолог MteI
отличается от него способностью
расщеплять последовательность 5’GCNGC-3’ в плазмиде pFsp4HI3
(дорожка 12)
- Наряду с 5’-GCNGC-3’ расщепляет
по-видимому и другие
последовательности в
pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI)+ Esp17
 8 – pHspAI10/DriI + Esp17;
 9 – pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI);
 10 – pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI)+ Esp17;
 11 – pFsp4HI3/DriI;
 12 – pFsp4HI3/DriI + Esp17;
 13 – pBstMW2/DriI;
 14 – pBstMW2/DriI + Esp17;
 M – маркёр 1 kb.
Предварительные выводы:
 Новая рекомбинантная эндонуклеаза Esp17 отличается
от его гомолога MteI, узнающего 8-нуклеотидную
последовательность 5’-GCGCNGCGC-3’ и узнаёт и
расщепляет С5-метилированную последовательность 5’GCNGC-3’ и отличается от его гомолога MteI.
 Требуются дальнейшие экспериментальные
исследования по уточнению сайт-специфичности
данного фермента.
 Активность фермента в рекомбинантном штамме
достаточна для его промышленного производства.
 Полученные новые данные о структуре MDэндонуклеазы могут быть использованы для
усовершенствования методов поиска и клонирвоания
новых ферментов.