реакция с двумя субстратами

CH3
N
Физическая химия биополимеров
Лаврик О.И.
НГУ-2012
O
6. Многосубстратные ферментативные реакции.
Уравнения, описывающие эти реакции.
Определение параметров в стационарном
режиме. Порядок присоединения субстратов.
Методы его определения
Простейший случай многосубстратной
реакции – реакция с двумя субстратами
Двусубстратная
реакция
Односубстратная
реакция
S1>>S2
Должен быт ь извест ен порядок
присоединения субст рат ов
Простейший случай многосубстратной
реакции – реакция с двумя субстратами
1. Последовательное
связывание
субстратов с образованием тройного
комплекса:
Простейший случай многосубстратной
реакции – реакция с двумя субстратами
Для схемы с последовательным связыванием
субстратов уравнение скорости реакции:
v=k3[ES1S2]
Для нахождения [ES1S2] в систему уравнений
добавляется уравнение материального баланса и
условия квазистационарности:
E0 = [E] + [ES1] + [ES1S2]
d[ES 1 ]
0
dt
d[ES1S2 ]
0
dt
Простейший случай многосубстратной
реакции – реакция с двумя субстратами
DE = k-1k-2+k2S2k3+k-1k3
DES1 = k1S1k3+k1S1k-2
DES1S2 = k1S1k2S2
;
;
v=
k 3E 0 D ES1S2
D E  D ES1  D ES1S2
k 3E 0
=
k3
(k -2  k 3 ) k -1 (k -2  k 3 )
1


k 1S1
k 2S2
k 1S1 k 2 S 2
Для определения параметров реакции из экспериментальных
данных это уравнение можно линеаризовать :
E0
(k -2  k 3 ) k -1 (k -2  k 3 )
1
1
=




v
k 3 k 1S1
k 3 k 2S2
k 3 k 1S1k 2S2
0 
1
S1

2
S2

12
S1S 2
Определение величин коэффициентов φi
Накопление продукта реакции во времени при
различных концентрациях S1 и S2=const, или
наоборот, при различных концентрациях
S2 и S1=const.
Определение величин коэффициентов φi
a=φ0+φ2/S2
b=φ1+φ12/S2
Простейший случай многосубстратной
реакции – реакция с двумя субстратами
2. Произвольный порядок присоединения
двух субстратов в процессе образования
тройного комплекса:
v=
k 3E 0 D ES1S 2
D E  D ES1  D ES2  D ES1S 2
где DES1S2 – определитель узла графа, в котором происходит
образование продуктов реакции.
Методы определения порядка
присоединения субстратов
• Гель-фильтрация.
• Метод задержки в геле (gel retardation, или
electrophoretic mobility shift assay – EMSA).
• Тушение флуоресценции. Можно следить за
изменением интенсивности флуоресценции остатков
триптофана (Trp) в белковой молекуле фермента,
происходящим при комплексообразовании.
Интенсивность флуоресценции при образовании
комплекса с ферментом может изменяться и для
субстрата. В этом случае можно использовать аналог
субстрата, имеющий флуоресцентную метку.
Использование аналогов субстратов для
определения порядка присоединения
субстратов
• Аналоги субстратов выбираются таким
образом, чтобы они продолжали быть
субстратами, то есть участвовали в
каталитических стадиях ферментативного
процесса.
• В случае аналога субстрата кинетические
характеристики ферментативной реакции
(KM, kcat) могут измениться, для тех стадий,
в которых принимает участие данный
субстрат (его аналоги).
Определение порядка присоединения субстратов
Для исследования порядка присоединения субстратов
в реакции аминоацилирования, катализируемой
аминоацил-тРНК-синтетазами, были использованы
фторированные аналоги аминокислот, например:
Фенилаланин
Пара-фторфенилаланин
Метод конкурентных ингибиторов
Реакция аминоацилирования тРНК с
образованием фенилаланил-тРНК,
катализируемая фенилаланил-тРНКсинтетазой):
E + АТР + Phe
Е-Phe-АМР + ррi
Е-Phe-АМР + тРНКPhe
Е + Phe-тРНКPhe + АМР
Метод конкурентных ингибиторов
• Аминогруппа – при ее замене сродство субстрата к
ферменту резко падает
• Фенильная группа участвует в узнавании субстрата.
• Фенилаланинол (Phe-ol) – конкурентный ингибитор
фенилаланина в реакции аминоацилирования.
Kd (Phe)=10-6M
Kd (Phe-ol)=10-5M
Фенилаланин
Фенилаланинол
Метод конкурентных ингибиторов
1. Ингибитор образует
комплекс с ферментом
2. Ингибитор образует
тройной комплекс ES1I
Для установления порядка присоединения субстратов нужно решить
уравнения для схем 1 и 2, с помощью метода графов.