Молекулярная генетика и иммунохимия

Молекулярная генетика
и иммунохимия
Основные иммунохимические понятия
Антигены
–
вещества,
способные
вызвать
специфические
иммунологические реакции в организме, в том числе биосинтез
специфических АТ. Способность АГ вызывать иммунный ответ называется
иммуногенностью, а способность образовывать комплексы с АТ –
антигенностью.
На поверхности молекулы сложного АГ можно выявить функциональные
группы или остатки, обуславливающие антигенную специфичность –
антигенные детерминанты или эпитопы. Число эпитопов на поверхности
молекулы определяет валентность АГ.
Низкомолекулярные вещества, не способные вызывать образование АТ, но
после конъюгирования с высокомолекулярными носителями, приобретающие
иммунногенные свойства, называются гаптенами (пептидные и стероидные
гормоны, лекарственные препараты, АБ, олигосахариды и олигонуклеотиды).
Способность АТ образовывать высокоспецифичные прочные комплексы с
различными веществами и возможность получения АТ в необходимых
количествах являются основой иммунохимических методов анализа.
Т.к. АГ в крови активирует сразу несколько типов В-лимфоцитов, которые содержат
рецепторы различной степени специфичности по отношению к исходному АГ, такой
иммунный ответ называется поликлональным, а АТ – поликлональными.
Сыворотку животного, содержащую специфические к данному АГ АТ называют
антисывороткой.
Принципиально важным является то, что поликлональные АТ даже против однойединственной антигенной детерминанты гетерогенны как по структуре активного
центра, так и по физико-химическим свойствам.
Для создания АТ одного вида – моноклональные АТ – используют гибридомную
технологию: из организма иммунизированного животного выделяют лимфоциты,
которые гибридизируют с миеломными клетками. Образующиеся клетки называют
гибридомами.
Метод разделения сложных веществ на простые компоненты
• В настоящее время требуется детальный химический анализ разнообразных
смесей и биологических объектов. Решение этой задачи невозможно без
применения достаточно эффективных методов разделения сложных смесей.
Среди таких методов доминирует хроматография. Бурно развиваясь в последнее
десятилетие, этот метод открыл возможность разделения смесей, содержащих
десятки и сотни компонентов, их количественный и качественный анализ,
препаративное выделение индивидуальных веществ.
• Принципы хроматографии весьма универсальны, благодаря чему она оказалась
пригодной для изучения объектов самой разной природы, от нефти и газов
атмосферы до белков и даже
вирусов.
Растворитель, перемещающийся
относительно сорбента, называется
подвижной фазой (в некоторых случаях
элюентом)
Адсорбент (сорбент,наполнитель
колонки) удерживается в колонке
фильтрами, он неподвижен и
поэтому называется неподвижной
фазой.
Вид
Особенности
Гель-фильтрация
Неподвижная фаза представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул, точно такой же, как и
жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Принцип разделения: молекулы пробы проникают внутрь
заполненных растворителем пор сорбента и задерживаются там на разное время. Если молекула имеет очень
большой размер, то она вообще не проникает в поры и проскакивает через колонку не удерживаясь. Поры
сорбента имеют разброс по размерам. Более мелкие молекулы пробы задерживаются в части пор, потом
вымываются из них растворителем. Они через колонку пройдут медленнее, чем первые. Таким образом
обеспечивается разделение частиц по размерам.
Ионообменная
хроматография
В основе разделения лежит обратимый обмен ионов между неподвижной ионообменной и жидкой подвижной
фазой. Различие в сродстве ионов образца к ионообменной неподвижной фазе приводит к разделению.
Задержание происходит за счет электростатического взаимодействия разнозаряженных ионов. На гранулах
находятся ионогенные группы. Фракционирование компонентов смеси веществ обусловлена различием в
значениях их суммарных зарядов. Чем больше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного
компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль
колонки. Диссоциацию можно контролировать выбором рН и ионной силы элюента.
Аффинная
хроматография
Взаимодействие между молекулами биополимеров и сорбентом осуществляется за счет сил биологического
сродства. Одного из «партнеров» химически закрепляют на матрице биоаффинного сорбента. Условия
биологического взаимодействия изменяют путем ведения в элюент солей, мочевины, детергентов,
конкурирующих молекул или изменением рН.
Адсорбционная
хроматография
В основе - физическое взаимодействие обусловленное дисперсионными и электростатическими силами между
молекулами пробы, элюента и сорбента. Дисперсионные взаимодействия имеют неполярную природу. Дипольдипольные взаимодействия, называемые обычно ориентационными, могут происходить лишь между молекулами,
обладающими постоянным дипольным моментом. Очень важный в хроматографии тип полярного взаимодействия
- образование водородных связей. Эти взаимодействия достаточно сильны и приближаются по силе к энергии
слабой химической связи. Подавляющая часть органических соединений разделяется методами адсорбционной
жидкостной хроматографии. Разделяемые вещества находятся в виде молекул, поэтому этот метод часто
называют молекулярной жидкостной хроматографией.
Распределительна
я хроматография
Подвижная и неподвижная фазы представлены 2 несмешивающимися или частично смешивающимися
жидкостями. Распределение вещества между фазами происходит в соответствии с растворимостями исходной
смеси. Чем выше сродство компонента к нерастворимой фазе, тем медленнее он мигрирует вдоль колонки.
АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
• АФХ имеет потенциально очень
высокую избирательность, что
позволяет извлекать из смеси
биовеществ компоненты,
представленные в ничтожно малых
относительных количествах.
• Адсорбция осуществляется за счет
биоспецифических взаимодействий
между молекулами.
Компоненты аффинного сорбента
•
МАТРИЦА
Требования: нерастворимость, гидрофильность, жесткость, химическая стабильность, отсутствие неспецифической
адсорбции, наличие химических групп для ковалентных связей с нуклеофильными группами лигандов и спейсеров,
крупнопористый характер матриц.
•
агароза (сефароза) 4%,
ПААГ,
целлюлоза и т.д.
СПЕЙСЕР (активация матрицы)
Лиганды нередко представлены лабильными биополимерами, во избежании их денатурации в процессе посадки на
матрицу, ее нужно предварительно активировать. В результате на матрице образуются электрофильные группы,
образующие ковалентные связи с нуклеофильными группами лиганда.
бензохинон,
бромциан (для сефарозы),
оксираны (для полисахаридных матриц),
трихлортриазин,
дивинилсульфат и т.д.
• ЛИГАНД
Всем лигандам свойственна определенная биоспецифичность- индивидуальная (сродство 2х мол-л: AG-АТ) или
групповая (лиганд связывается с целой группой родственных мол-л: никотинадениннуклеотид взаимодействует со
всеми ферментами, для которых он является коферментом. Применяют, если стоит задача не только очистки, но и
разделения нескольких веществ, наделенных сродством к одному лиганду.
белок-АG (для очистки АТ),
белок-рецептор (для связывания гормонов),
лектины (способны агглютинировать эритроциты или др.клетки, отбирая их по классам :опухолевые
или эмбриональные),
КоА,
нуклеозидфосфаты,
лизин и полилизин (очистка плазминогена и тромбина,хроматографическое разделение рРНК)
Таким образом, сорбент имеет
следующее содержание:
Подготовка и проведение аффинной
хроматографии
• Перед проведением эксперимента необходимо:
1. Выбрать сорбент (диктуется биоспецифичностью интересующего исследователя
вещества).
2. Выбрать необходимую концентрацию лиганда (для очистки ферментов
необходимая концентрация лиганда – 10^-3 М и выше.
3. Выбор буфера (диктуется стремлением сохранить нативность очищаемого белка и
максимально уменьшить неспецифическую сорбцию других компонентов смеси).
4. Выбор элюента и метода элюции (в качестве промывки используется тот же
буфер, что и при посадке препарата на сорбент, элюент подбирается исходя из
известных свойств и строения очищаемого вещества и сорбента).
• Постановка эксперимента:
1. Колонка заполняется сорбентом и промывается 2-3 объемами буфера, затем 2-3
объемами раствора, который будет осуществлять элюцию веществ, и снова
уравновесить буфером.
2. Нанести образец на колонку и промывать со скоростью в 2 раза ниже, чем
скорость промывки «пустой» колонки.
3. Отмыть колонку элюентом (со скоростью в 2 раза выше, чем скорость
прохождения препарата), собирая элюент на выходе.
4. Следить за показателями детектора. Как только детектор вновь показывает 0концентрацию веществ в элюенте, начать промывку колонки рабочим буфером.
5. После окончания хроматографии колонку регенирировать, элюат поместить в
диализный мешочек в забуференную воду.
6. Через сутки диализа измерить OD (оптическую плотность) элюата при длине
волны в 280 и 260 нм, расчитать концентрацию белков по формуле:
С=1,55*ОД280 – 0,76*ОД260 (мг/мл)
II. Иммунохимические методы, основанные на
принципе преципитации. Иммуноэлектрофорез.


иммунологические методы основаны на
взаимодействии АГ с АТ
1 АГ + 1 АТ = преципитат
(эквивалентные взаимодействия)
Классический пример
взаимодействия АГ-АТ –
это реакция преципитации.
Для ее получения АГ в
возрастающих
концентрациях добавляют к
раствору АТ. Количество
осаждающихся
иммунных
комплексов
сначала
возрастает,
а
затем
падает.
Таким
образом
кривая преципитации имеет
три зоны.
Зона избытка АТ: количества АГ недостаточно для того, чтобы в реакцию
вступили все АТ; в супернатане определяются свободные антитела.
Зона эквивалентности: количества АГ достаточно для связывания всех
имеющихся АТ; свободные АГ и АТ в супернатанте отсутствуют.
Зона избытка АГ: количество АГ превышает необходимое для связывания всех
АТ, что ведет к снижению содержания АТ в преципитате. Это обусловлено
солюбилизацией комплексов АГ-АТ в следствии избытка АГ.
(по Оухтерлони, 1949г)
Предназначена для качественного определения АГ и АТ
например для определения числа АГ в различных жидкостях, для оценки
чистоты препаратов при выделении АГ, для сравнения известных АГ и АТ с
неизвестными, а также для наблюдения за ходом иммунизации животных –
продуцентов иммунной сыворотки
1. МАТЕРИАЛЫ
Для проведения двойной иммунодиффузии агаровый гель выливают на предметные
стекла, после застывания вырезают в нем лунки и заполняют их исследуемыми
растворами АГ и АТ. Растворы диффундируют в гель, и на той линии, где происходит
взаимодействие АГ и АТ , образуется линия преципитации. Ее можно наблюдать
визуально, если промыть гель (для удаления растворимых белков) и нанести на него
краситель, выявляющий белки, например, кумасси синий, амидо-черный 10В.
Технические характеристики:
агароза / агар – 1,5%, рН 7 – 8,6
толщина геля – 1,5 мм (микрометод) и 2 – 3 мм (макрометод)
расстояние между лунками - не < 4 и не > 10 мм
режим инкубации - 4, 20 и 37С
время инкубации – не < 24 часов до 6-7 дней
При оптимальном соотношением между АГ и АТ линия преципитации располагается почти посередине
между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунке
другого реагента.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ
1 – дуги преципитации, образованные АТ
и двумя исследуемыми АГ сливаются:
идентичность эпитопов АГ
2 – линии пересекаются, что указывает
на неидентичность АГ детерменант
3 – одна из линий длиннее другой
(“шпора”). Это указывает на частичную
идентичность АГ. Оба АГ имеют
некоторые
общие
детерменанты,
которые, соединяясь с АТ, дают
сливающиеся линии преципитации; но у
второго
АГ
имеются
также
детерминанты, которых нет у первого.
Т.е. у второго АГ больше реагирующих с
данной антисывороткой детерминант,
чем у первого.
(по Манчини, 1963г)
Дает возможность количественно определять АГ
1. МАТЕРИАЛЫ
В агаровый гель добавляют АТ, затем выливают его на предметные стекла и
оставляют для застывания. В застывшем геле вырезают лунки и вносят в них
стандартный объем различных по концентрации растворов АГ. Стекла оставляют
не менее чем на 24 часа.
Технические характеристики:
агароза / агар – 1,5%, рН 8,6
толщина геля – 1 мм
d лунки – 2 мм
содержание антисыворотки – 1-5%
2. Результаты
В течении этого времени АГ
диффундирует в гель и образует
с АТ растворимые комплексы
(при избытке АГ). Комплексы
продолжают
диффундировать,
связывая все больше АТ, пока не
будет
достигнута
точка
эквивалентности и не произойдет
осаждения
комплексов
с
образованием
кольца.
По
радиусу
зоны,
ограниченной
кольцом
преципитации,
определяют
ее
площадь.
Величина
площади
пропорциональна концентрации
АГ,
которую
вычисляют
с
помощью калибровочной кривой.
Таким
же
образом
можно
определять концентрацию АТ.
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ



Иммуноэлектрофоретические методы совмещают в себе
электрофоретическую миграцию в геле с последующей
преципитацией в нем (гель - агароза).
В результате электрофоретической миграции
происходит частичное разделение смеси антигенов,
т.к.скорость их миграции в геле зависит от суммарного
заряда при данном рН буферного раствора.
Явление иммунопреципитации в гелях широко
используется в целом ряде важных методик, которые
широко применяются для изучения антител.
Отрицательно заряженные молекулы быстро мигрируют
в гель, содержащий антитела, что ускоряет
преципитацию и сводит к минимуму латеральную
диффузию.
Применение иммуноэлектрофореза
►
Иммуноэлектрофорез в первую очередь представляет собой качественный
метод исследования антигенов и специфичности антител.
►
Исследование AG: - определение антигенного состава смеси (позволяет
определить природу примесей при очистке антигенов).
►
Анализ гетерогенности и гомогенности индивидуальных антигенов (широко
применяется при исследовании АG инфекционных агентив, белков плазмы
и др. биожидкостей человека и животных. Эффективно используется для
первичного скрининга при исследовании недостаточности
иммуноглобулинов и комплемента)
►
Исследование AT: - тест на определение специфичности антисывороток, в
качестве контроля применяются антисыворотки против суммарного пула
белков.
Принцип метода
иммуноэлектрофореза
1.
2.
3.
4.
5.
В пластине 1,5% агарозного геля
вырезают лунки и
расположенные между ними
канавки.
В лунки вносят р-ры AG и
накладывают на агарозу с
противоположных сторон
фитили, соединяющие ее с
электродным буфером в 2х
резервуарах.
После включения тока AG
начинают мигрировать из лунок
вдоль геля и разделяются.
По окончании электрофофреза в
канавки вносят антисыворотки.
AG и антисыворотки
диффундируют в геле навстречу
друг другу и в месте их
взаимодействия образуются
полосы преципитации.
III. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ
АНАЛИЗ (ИФА)










Метод ИФА был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми
группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции,van Weemen и
Schuur
в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США
ИФА характеризуется уникальной специфичностью и высокой
чувствительностью детекции ферментативной метки. Пределы
обнаружения
веществ данным методом вплоть
до 10-21 молей в образце.
Высокие результаты достигаются благодаря использованию
неограниченных
возможностей ферментов – биокатализаторов,которые позволяют
создавать
каскадные системы усиления различных химических сигналов.
I. Основные физико-химические свойства
ферментов
Ферменты представляют собой белки, катализирующие реакции, протекающие
в живых организмах.
Структура фермента.
В активном центре фермента, образованном сближенными и определенным
образом ориентированными в пространстве участками полипептидной цепи,
происходит химическое связывание субстрата и его химическое превращение.
Иногда в состав таких центров входят так называемые кофакторы –
низкомолекулярные органические вещества довольно сложного строения или
неорганические ионы.
Кофактор, прочно связанный с белковой глобулой (апоферментом) и остающийся в
неизменном состоянии после каталитического акта, называют простетической
группой (гем).
Ферменты, используемые в ИФА в качестве
меток
Требования:
 высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента,
позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;
 доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых
ферментных препаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность
после химической модификации при получении конъюгата с АГ или АТ;
 стабильность в оптимальных условиях взаимодействия АГ с АТ;
 простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
Наибольшее распространение среди ферментов в гетерогенном
удовлетворяющих перечисленным требованиям, получили:
1. Пероксидаза хрена
2. Щелочная фосфатаза
3. ß-D- галактозидаза
ИФА,
Этапы ИФА
I этап – сенсибилизация
II этап – Блокировка
III этап – Внесение
сыворотки
IV этап – Внесение
пероксидазного коньюгата
V этап – Внесение
субстратного буфера
ПОСТАНОВКА ИФА
I этап – сенсибилизация



Вариант сэндвич ИФА
Планшет промыть 3 раза PBS на вошере
В лунки внести по 100 мкл посадочного коньюгата в концентрации 1-20 мкг/мл,
инкубировать ночь при комнатной температуре или 37°С.
После инкубации планшет промыть на вошере 3 раза PBS с 0,05% TWEEN-20 (PBST).
II этап – Блокировка


Блокирующий раствор (0,5% BSA в PBST) по 300 мкл в лунку
Блокировать 30 мин. при комнатной температуре
III этап – Внесение сыворотки



Разведение сыворотки на блокирующем растворе (0,5% BSA в PBST).
В лунку внести по 100 мкл сыворотки, инкубация 1 час при 37° в термостате (шейкере).
Отмывка 4 раза PBST по 250 мл на вошере.
IV этап – Внесение пероксидазного коньюгата



Конъюгат разводится на блокирующем растворе (0,5% BSA в PBST).
В лунку внести по 100 мкл конъюгата, инкубация 1 час при 37° в термостате (шейкере).
Отмывка 5 раз PBSТ по 250 мл на вошере.
V этап – Внесение субстратного буфера

В лунку внести по 100 мкл готового субстратного буфера, содержащего



тетраметилбензидин (ТМВ) или о-фенилендиамин (OPD) приготовленного по
соответствующей прописи.
Инкубировать 5-10 мин. в темноте.
Стоп-буфер – 2 N HCl по 50 мкл.
Показания снять на ридере при длине волны 450 нм (ТМВ) или 492 нм (OPD).
IV. Полимеразная цепная
реакция (ПЦР)
- процесс, протекающий в одной пробирке и состоящий из
повторных
циклов
амплификации
(размножения,
копирования)
специфической
последовательности
молекулы ДНК с целью получения достаточно большого
количества копий, которые могут быть выявлены
обычными методами
Компоненты
Праймеры – пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как
правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.
Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно
подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.
Последовательность ДНК, с которой начинается считывание информации – затравка.
Taq-полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3’-конца
второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности;
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – «строительный материал»,
используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК
дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ),
дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ)
Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих
оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН;
Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат,
который может содержать искомую ДНК, служащую мишенью для последующего
многократного копирования (например, ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНКмишени специфический продукт амплификации не образуется.
1
ЦИКЛ
1 этап – денатурация 93-95°С
2 этап – отжиг праймеров
50-65°С
3 этап – достраивание цепи
ДНК 72°С
2 ЦИКЛ
1 этап
2 этап
3 этап
АМПЛИКОН
Детекция в полиакриламидном геле
подтвердила наличие в амплификационных
смесях фрагмента 350 п.н. и 380 п.н.
710
490
404
328
350
380
Методы выделения ДНК
I. Метод фенольно-хлороформной экстракции
(предложил Мармур). Основан на ферментативном протеолизе с последующей
депротеинизацией и переосаждением ДНК этанолом.
Достоинства:
Возможность получать большие количества ДНК
Недостатки:
1. Трудоемок
2. Требуется работа с агрессивными и резко пахнущими веществами (фенол, хлороформ).
II. Выделение ДНК с помощью гуанидин тиоционата (GuSCN) с
последующей сорбцией ДНК на носителе (стекляные бусы, диатомовая земля и др.)
Достоинства:
Прост в исполнении, малостадийный метод
Недостатки:
1. Потеря ДНК в результате необратимой сорбции на носителе
2. Из-за большого количества стадий отмывки возможна как потеря ДНК, так и
перекрестная контаминация
III. Выделение ДНК с помощью ионообменников.
Метод основан на удалении примесей, включает две стадии (кипячение образца и сорбция
примесей на инообменнике).
Достоинства:
Метод включает только 2 стадии
Недостатки:
1. Не все примеси можно удалить с помощью ионообменников
2. Некоторые микроорганизмы не разрушаются при кипячении, что требует
дополнительных стадий очистки образца