Слайд 1 - Компания Адвенсум
advertisement
Основные задачи, решаемые лабораторией клеточных технологий, и принципы ее организации Руководитель отдела научно-исследовательских биотехнологий компании «Адвенсум» Никоненко Татьяна Александровна, к.б.н. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Культивирование клеток - метод, позволяющий сохранять жизнеспособность клетки и выращивать клетки, ткани, небольшие органы (или их части) животного, включая человека, или растения вне организма на/в питательной среде. Культура клеток представляет собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Получение первичной культуры клеток Первичная культура клеток клетки, получаемые из тканей или биологических жидкостей животного/человека и поддерживаемые в культуре до первого субкультивирования (пересева). Первичная культура кардиомиоцитов неонатальных крыс. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Первичная культура клеток. • На I этапе получения первичной культуры происходит стерильное удаление фрагмента ткани животного и его механическая или ферментативная (трипсином или коллагеназой) дезинтеграция. • Мелкие кусочки прикрепляются к поверхности чашки благодаря собственной адгезивности, наличию насечек на чашке или с помощью сгустка плазмы. • В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов, и клетки, мигрирующие из эксплантатов, могут использоваться для пассирования. (Таким образом, например, можно получать культуру клеток дермы - фибробластов. ) • Клетки образующейся при этом суспензии оседают, прикрепляются и распластываются на поверхности стекла или пластика. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Первичная культура клеток. Прикрепление к субстрату • • • • • Большинство клеток млекопитающих могут расти только будучи прикреплёнными к субстрату: к другим клеткам (т.н. клеткам фидерного слоя), к различным матриксам (коллагену, ламинину, фибронектину и т.п.), к стеклу или к пластику. Хотя для определенных целей используют также культивирование клеточной суспензии. Прикрепление клетки к субстрату. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Субкультивирование первичной культуры. Субкультивирование первичной культуры. После того, как первичная культура достигнет состояния монослоя, она может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения - т.е. пересеяна или субкультивирована. Для суспензионных культур в случае субкультивирования достаточно только разведения. Процесс образования монослоя можно наблюдать в инвертированный микроскоп. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Рассев и кормление клеточной культуры. Как определить, что клеточную культуру пора рассевать? • клетки образуют плотный монослой • индикаторный краситель Phenol Red (феноловый красный)меняет цвет с ярко-красного в свежей среде до желто-оранжевого в среде с культивируемыми в течение некоторого времени клетками Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Пересев и оценка жизнеспособности клеточной культуры. • В процессе пересева после трипсинизации можно оценить состояние клеточной культуры: подсчитать общее количество клеток, и в их числе мертвые и живые клетки. • Для этих целей существует простой метод подсчета клеток в гемоцитометре (камере Горяева) или в автоматизированных счетчиках клеток. • Принцип подсчета: в клеточную суспензию добавляют равный объем 0,1%-ного трипанового синего - он окрашивает только мертвые клетки. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Создание клеточных линий - ограниченных и постоянных • Клеточная линия - культура однородных клеток, обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками. • Ограниченные клеточные линии живут определённое количество пассажей, а потом культура отмирает. • Ограниченная клеточная линия может также "трансформироваться " и превращаться в постоянную клеточную линию. • Пока неясно, возникают стволовые клетки постоянной культуры в ходе пассирования или они предсуществуют в замаскированной форме в популяции клеток ограниченной линии. Также можно предположить мутационную природу их появления (хромосомные перестройки, траслокации, частичное или полное неспаривание или точечные мутации). Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Трансформация и дифференцировка клеточной культуры. Перерождение клеток характеризуется следующими особенностями: • • • • • морфологическими изменениями (мельчание или укрупнение, уменьшение адгезивной способности, увеличение ядра); укорочением клеточного цикла (время удвоения уменьшается до 12 часов, обычно 36 - 48); уменьшением зависимости клеток от добавления сыворотки; нетребовательностью к качеству субстрата; увеличением потенции к образованию опухолей. Среди множества трансформированных клеточных линий одной из самых известных является HeLa. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Транспортировка и хранение клеточной культуры. • • Незамороженые клетки можно транспортировать в виде монослоя либо в сосуде, содержащем лишь следы культуральной среды, либо в сосуде, полностью наполненном средой. Сосуды должны быть прочно закупорены во избежание испарения среды, и внешняя температура при транспортировке не должна выходить из диапазона 10-37С. Этот метод транспортировки пригоден только для небольших расстояний. Для транспортировки на большие расстояния культуры клеток замораживают в жидком азоте, а транспортируют их замороженными в твердой углекислоте. Поскольку клетки обладают низкой жизнеспособностью при температуре сухого льда, то сразу после получения их следует использовать или перезаморозить в жидком азоте. Хранение клеточных культур в осуществляется в жидком азоте в специальных емкостях - сосудах Дьюара. Основные этапы работы в клеточной лаборатории I Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов Забор крови, тканей, костного мозга, биологических жидкостей II Выделение, культивирование, дифференцировка клеток III IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии Культуральный бокс – основная единица организации пространства клеточной лаборатории Боксовое помещение представляет собой: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. изолированную комнату; с несорбирующими пыль моющимися покрытиями; имеющую предбоксник; обеспеченную необходимым общим и специальным освещением; системами приточной и вытяжной вентиляции; холодным и горячим водоснабжением; подводами газов и сжатого воздуха. Схема организации помещения культурального бокса 1 2 3 4 5 6 1 - ламинар II класса биологической безопасности 2 - СО2-инкубатор 3 - шкаф с посудой и пластиком для культуральных работ 4 - стол с инвертированным световым микроскопом 5 - холодильник с культуральными средами и реагентами для клеточных работ 6- предбоксник с рабочей одеждой Организация пространства клеточной лаборатории Ламинарный шкаф • • Функции: Обеспечение стерильности и предотвращение контаминации при работе с клеточными культурами • 1. Включение/ выключение потока воздуха. 2. Включение/ выключение света или ультрафиолета. 3. Регулировка скорости потока стерильного воздуха с задней стенки ламинара. 4. Лампа дневного света и ультрафиолетовая лампа. 5. Задняя стенка с фильтром, через которую осуществляется подача стерильного воздуха (поток стерильного воздуха идет в лицо работающему). 6. Стол ламинара с металлической поверхностью (протирается перед работой спиртом, на ночь включается ультрафиолетовая лампа). • • • • • Организация пространства клеточной лаборатории СО2 инкубатор СО2 инкубатор • 1 - двойная дверь, 2 - панель управления подачей СО2 3 - многофункциональное цифровое табло 4 - ручка переключения регулируемых параметров 5 - панель управления регулируемыми параметрами (температура); Cтрелка указывает на баллоны с СО2. • • Функции: поддержание влажности (внутрь инкубатора ставится емкость с водой с обеззараживающими добавками, например медным купоросом) Поддержание уровня СО2 При выращивании клеток в посуде типа чашек Петри и пластиковых планшетов клеткам необходим 5 5% содержание СО2. Поддержание температурного режима (37 градусов Цельсия) • • Организация пространства клеточной лаборатории Микроскоп инвертированный Микроскоп инвертированный - это оптический микроскоп, у которого объектив располагается под наблюдаемым предметом, а конденсор - сверху. Такой микроскоп позволяет рассматривать объект снизу. В биологии и медицине с помощью таких микроскопов изучают культуры клеток, прикрепленные ко дну культуральной посуды. Инвepтиpoвaнныe микpocкoпы идeaльны для caмoгo шиpoкoгo pядa иccлeдoвaний: в физиoлoгии, Новое в организации пространства клеточной лаборатории - автоматизированные системы для наращивания клеточных линий Соединяют в себе функционал ламинарного шкафа + инкубатора + микроскопа для наращивания клеточных культур в автоматическом режиме Автоматизирует • одновременное наращивание нескольких десятков клеточных линий с разными протоколами культивирования, для исследований и скрининга • наращивание аутологических клеточных продуктов от нескольких десятков пациентов • пересев и сбор клеток в асептических условиях без риска перезаражения • транзиторную трансфекцию • одновременную инкубацию нескольких сотен культуральных планшетов / флаконов • подсчет количества и жизнеспособности клеток • работу с многослойными флаконами • рассев клеток в планшеты для последующего скрининга Востребованы: • • • • • • в сложных программах культивирования клеточных линий в онкологических программах, при исследовании стволовых клеток, при изучении токсичности разрабатываемых фармпрепаратов (преклинические испытания) в наработке клинического материала при проведении II и III фазы клинических исследованиваний в коммерческом производстве аутологических продуктов клеточной терапии Основные этапы работы в клеточной лаборатории I Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов Забор крови, тканей, костного мозга, биологических жидкостей II Выделение, культивирование, дифференцировка клеток III IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП I – забор материала и пробоподготовка Системы забора крови Гомогенизаторы тканей Центрифуги Холодильники Стерилизаторы Фильтрационные системы Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП II – выделение, рассев, дифференцировка, наращивание первичных культур и линий клеток Ламинарные шкафы (II класса биологической защиты ) СО2 инкубаторы Холодильники Центрифуги ультрацентрифуги Инвертированные микроскопы Счетчики клеток Культуральный пластик, среды, расходные материалы Автоматизированные системы для выделения/ наращивания клеток Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Системы наблюдения за живыми клетками в культуре Микроскопы исследовательского класса с манипуляторами Системы сверхточной лазерной микродиссекции Программнотехнические комплексы для автоматизации научных исследований в области генетики Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП IV – замораживание и хранение Криозамораживатели Криохранилища Сосуды Дьюара Морозильники низкотемпературные Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Программно-технические комплексы для автоматизации научных исследований биологических объектов в области генетики Выполняют задачи • автоматического выделения ДНК/РНК из различных образцов • проведения оценки качества образцов нуклеиновых кислот • проведения ПЦР • изучения генетических полиморфизмов • генетической трансформации и изучения функций генов • снятия изображений и анализа данных Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Цитометр NyONE и Cellavista (Synentec GmbH, Германия) Возможности применения: •Клонирование единичной клетки •Анализ слияния •Подсчет клеток •Анализ клеточной пролиферации •Тест на жизнеспособность клеток •Оптимизация культуральной среды •Эффективность трансфекции •Определение CD маркеров, антител, секреции клетки Используется для проведения научных и скрининговых исследований : в научно-исследовательских лабораториях (стволовых клеток, онкологии, токсикологии) в лабораториях клеточной терапии в лабораториях онкологических клиник ( при создании противоопухолевых дендритных вакцин) в лабораториях ЭКО (контроль развития эмбрионов) в лабораториях регенеративной медицины в фармакологических лабораториях. Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Цитометры JULI BR и JULI FL (NanoEnTek, Корея) Формат расходных материалов – слайды-камеры Возможности применения: •Визуализация живых клеток •Мониторинг роста клеток •Анализ клеточной миграции, слияния клеток •Контроль качества клеточной культуры •Развитие стволовых клеток •Оптимизация культуральной среды •Эффективность трансфекции •Все тесты проводятся in vivo •Целевая аудитория: научно-исследовательские лаборатории лаборатории клеточной терапии лаборатории онкологических клиник токсикологические лаборатории ЭТАП IV – замораживание и хранение Приборы для криоконсервации и криохранения. -- Программные замораживатели -- Клеточные криохранилища с функцией программного замораживания клеточного материала -- Автоматизированные хранилища биоматериала и проб нуклеиновых кислот (до -80оС) (Brooks/) -- Низкотемпературные холодильники для хранения биологического материала, (до -80оС) - Аппарат для подготовки стволовых клеток к криоконсервации Coolmix Расходные материалы - контейнеры для обработки и хранения замороженного клеточного материала Целевая аудитория: Клеточные лаборатории лаборатории клеточной (аутологической/ донорской) терапии; клиники регенеративной медицины банки пуповинной крови; клеточные банки. ЭТАП IV – замораживание и хранение Низкотемпературные хранилища Brooks Biostore II (-80°C). Brooks ‐80°C BioStore II — это автономная, полностью автоматизированная система хранения и извлечения образцов, способная поддерживать температуру биоматериала на заданном уровне в течение всего срока хранения. Система предназначена для хранения: -тканей, -плазмы, -сыворотки, -цельной крови, -нуклеиновых кислот, -фармсубстанций. Хранилище модульного типа вмещает от 1,5 до 5,5 млн. пробирок объемом 0,5 мл. Целевая аудитория: -биобанки Регенерация миокарда Пример актуального исследования, проводимого в клеточной лаборатории Клеточные процессы, связанные с регенерацией миокарда, долгое время считались невозможными. Однако недавно было установлено, что во всех возрастных периодах сердце содержит пул делящихся малодифференцированных клеток - предшественников кардиомиоцитов. В терминальной стадии ХСН, а также при острых состояниях миокарда, например при инфаркте, количество таких клеток значительно увеличивается. Эти клетки были названы резидентными кардиальными прогениторными клетками и охарактеризованы по экспрессируемым маркерным белкам. Резидентные прогениторы кардиомиоцитов в эндомиокардиальном биоптате пациента с дилатационной кардиомиопатией. C-kit- маркер стволовых клеток (локализация на мембране) Nkx2.5 – маркер ранней дифференцировки кардиомиоцитов (локализация внутри ядра) наложение c-kit и Nkx2.5 окрашивание на DAPIлокализация клеточного ядра Регенерация миокарда Пример актуального исследования, проводимого в клеточной лаборатории Резидентные прогениторные клетки могут быть лучшими кандидатами для применения в клеточной терапии сердца, так как они являются тканеспецифичными, прекоммитированными и обладают большой способностью к дифференцировке. Получение резидентных прогениторов кардиомиоцитов из эндомиокардиальных биоптатов (ЭМБ) пациентов, их наращивание и дифференцировка в культуре дает возможность вводить эти клетки тем же пациентам, что поможет избежать побочных эффектов, связанных с использованием неаутологичных клеток. Дальнейшая дифференцировка этих клеток в зрелые кардиомиоциты могла бы привести к улучшению функциональных характеристик миокарда при развитии хронической сердечной недостаточности. (Фотографии были любезно предоставлены доктором О.В. Степановой, НИИКК, РКНПК, Москва.) БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ! Руководитель отдела Научно-исследовательских биотехнологий Никоненко Татьяна Александровна, к.б.н.
