Молекулярные особенности опухолевых стволовых клеток и их
реклама
XV международная научная школа имени А.С . Саенко «Современные проблемы радиобиологии» 18 -22 мая 2015 Молекулярные особенности опухолевых стволовых клеток и их чувствительность к повреждающим воздействиям Профессор, д.б.н. Е.Ю. Москалева Стволовые клетки (СК) - это клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в другие типы клеток. СК характеризуются наличием трех главных свойств: 1. СК асимметрично делятся, то есть при делении СК вместо образования 2-х одинаковых дочерних клеток одна дочерняя клетка становится коммитированной (commit – поручать, вверять), способной стать более специализированной, а другая – остается неспециализированной СК; 2. СК способны к самообновлению, т.е. репопулируют (пролиферируют без дифференцировки) на протяжении неопределенно длительного периода времени или даже в течение всей жизни организма (long-term subset); 3. СК могут дифференцироваться в специализированные типы клеток (по крайней мере, в клетки 2-х различных фенотипов), проходя стадию прогениторных клеток (progenitor - предшественник) из так называемого краткосрочно существующего пула неспециализированных коммитированных СК (short-term subset). Схема получения эмбриональных стволовых клеток 5-дневный эмбрион состоит из 200-250 клеток трофоэктодермы ВКМ содержит 30-34 клетки. Фидерный слой – митотически инактивированные мышиные фибробласты. Маркеры ЭСК SSEA-3 и SSEA-4 Oct-4 GSTM-2, TRA-1-60, TRA-1-81 Теломераза Щелочная фосфатаза Перспективы – биомедицинская инженерия Некоторые маркеры стволовых клеток и их функции Маркер CD34, CD133, интегрины Известная или предполагаемая функция Прикрепление клеток к субстрату Bcl-2, теломераза, Выживаемость и повышение устойчивости АВС-транспортеры, клеток альдегиддегидрогеназа c-kit Рецептор фактора СК (SCF) Musashi 1 Ассимметричное деление клеток, обновление СК Нестин Промежуточные эмбриональные филаменты р27 Kip1 Ингибирование циклин-зависимых киназ р63 Гомолог р53 АВС-транспортеры и их роль в стволовых клетках Высокое содержание разных АВС-транспортеров (ABCB1 - Pgp170, АВСG2 - BCRP, ABCB5) в СК обеспечивает: • удаление цитотоксических препаратов и токсинов из СК, что определяет их устойчивость к повреждающим агентам • секрецию регуляторных состояние покоя (Gо) СК факторов, поддерживающих • СК не включают флуоресцентные красители Hoechst 33342 и родамин-123, что позволяет выделять популяцию СК с помощью проточной цитофлуориметрии при использовании флуориметров-сортировщиков клеток АВС-транспортеры (ATP-Binding Cassete transporters) Семейство трансмембранных белков, которые осуществляют транспорт различных молекул через клеточные мембраны с использованием энергии, выделяющейся при гидролизе АТФ АВС-транспортеры, определяющие устойчивость клеток к различным препаратам Ген Белок Химиотерапевтические препараты и другие вещества, удаляемые из клеток АВС-транспортерами ABCA2 ABCA2 Эстрамустин ABCB1 PGP/MDR1 Колхицин, дигоксин ABCC1 MRP1 Доксорубицин, даунорубицин, винкристин, этопозид, колхицин, камппотецин, метотрексат, родамин ABCC2 MRP2 Винбластин, цисплатин, доксорубицин, метотрекат, сульфинпиразон ABCC3 MRP3 Метотрексат, этопозид ABCC4 MRP4 6-Меркаптопурин, 6-тиогуанин и его метаболиты, метотрексат, цАМФ, цГМФ ABCC5 MRP5 6-Меркаптопурин, 6-тиогуанин и его метаболиты, цАМФ, цГМФ ABCC6 MRP6 Этопозид ABCC11 MRP11 5-Фторурацил, цАМФ, цГМФ ABCG2 MXP/BCRP* Митоксантрон, топотекан, доксорубицин, даунорубицин, иринотекан, иматинит, метотрексат доксорубицин, этопозид, винбластин, паклитаксель, РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СК С УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ Wnt Лиганд отсутствует Лиганд связался с рецептором Убиквитилирование и деградация β-катенина Экспрессия генов подавлена Экспрессия генов активирована РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СК С УЧАСТИЕМ БЕЛКОВ HEDGEHOG Механизм репрессии процесса транскрипции при отсутствии белков Hedgehog: - прямой регулятор процесса транскрипции – белки семейства GLI; - SUFU протеолитически отщепляет N-конец комплекса GLI; - подавление активности GLI кроме того осуществляется комплексом фосфорилириующих его ферментов. Механизм активации транскрипции в присутствии белков Hedgehog : - связывание Hh-лиганда с рецептором PTCH1; - интернализация образовавшегося комплекса; - невозможность дальнейшего выведения эндогенного лиганда. - рецептор SMO активирует фермент серин-треонинкиназу; - серин-треонинкиназа фосфорилирует и ингибирует комплекс ферментов, подавляющих комплекс GLI; - серин-треонинкиназа ингибирует также SUFU, способствуя накоплению полноразмерного GLI- комплекса в ядре; - GLI-комплекс активирует процесс транскрипции с целевых Hh-генов. СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ NOTCH • Лиганды и рецепторы Notch являются трансмембранными белками I типа. • Рецепторы Notch встроены в мембрану клетки в виде гетеродимеров с одним трансмембранным доменом. • Их экстраклеточные домены содержат от 29 до 36 повторов, аналогичных ЭФР, и связывают специфические лиганды (Delta, Serrate, Lag-2) на поверхности соседних клеток. • Цитоплазматические домены участвуют в формировании сигнала, передаваемого в ядро клетки. • При связывании с лигандом рецептор Notch разрывается металлопротеиназой или γ-секретазой в области трансмембранного домена и внутриклеточный домен транслоцируется в ядро, где он участвует в активации транскрипции соответствующих генов–мишеней. • Фармакологические ингибиторы γ-секретазы вызывали блокаду сигнальной системы Notch, остановку клеточного цикла, апоптоз и дифференцировку клеток медулобластомы. Клональная теория возникновения опухолей Опухоль возникает из одной трансформированной клетки. Злокачественные опухолевые клетки характеризуются: 1) способностью к неограниченной пролиферации, нерегулируемой с помощью обычных рост-регулирующих механизмов; 2) приобретают способность внедряться в нормальные ткани и разрушать их и способны образовывать метастазы. Накопление мутаций Трансформированная клетка Неограниченная пролиферация Опухоль Инвазия Метастазирование Опухолевые стволовые клетки (ОСК): способность к самовоспроизведению (красная стрелочка), асимметричному делению и развитию опухоли. ОСК ПК ОСК ПК ОСК ОСК ПК ОСК ПК ПК ПК ПК ОСК ПК ПК ПКПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ОСК ПК ПК ПК ОСК ПК ПК ПК ПК ПК ПКПК ОСК ОСК ПК ПК ПК ПКПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ОСК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК ПК Рост опухоли, метастазы Гибель опухолевых клеток Сколько ОСК (туморогенных клеток) в опухолевой массе? Какие клетки мишень для лечения? Возникновение регионарной стволовой клетки в результате слияния стволовой и дифференцированной клетки. СК Стволовая клетка РСК Регионарная (тканевая) стволовая клетка Слияние Дифференцированная клетка Гибридная клетка Основные постулаты теории опухолевых стволовых клеток ·В каждой опухоли присутствует фракция ОСК, способных индуцировать опухоли при введении иммунодефицитным мышам. ·ОСК имеют определенные поверхностные маркеры, что позволяет успешно и воспроизводимо выделять их из общей массы опухолевых клеток с помощью проточной цитофлуориметрии или различных вариантов иммуноселекции. • Опухоли, развивающиеся из ОСК, содержат смешанную популяцию туморогенных и не туморогенных клеток, соответствующую гетерогенному клеточному составу исходной опухоли. Маркеры опухолевых стволовых клеток в различных солидных опухолях человека. Опухоль Маркер ОСК Ссылки Рак молочной железы CD 44+ CD24-/low Lin- Al-Hajj M., 2003 Опухоли головного мозга CD 133+ Singh S.K. , 2003, 2004; Hemmati H.D., 2003; Galli R., 2004 Опухоли головы и шеи CD44+ (плоскоклеточная карцинома) Prince M.E., et al, 2007 Рак поджелудочной железы CD44+ CD24+ ESA+ Li C. et al, 2007 Меланома - суспензионная культура - прикрепляющаяся культура - прикрепляющаяся культура CD20 CD133+, ABCG2+ CD133+, ABCB5+ Fang D., 2005 Monzani E., 2007 Frank N.Y., 2005 Рак предстательной железы CD44+/α2β1high/CD133+ Collins Рак толстой кишки CD133+ Dalerba P., 2007; O'Brien C.A., 2007 Рак печени CD133+ Ma S., 2007 A.T., 2005, 2006; Lawson1 D.A., 2007; Miki J., 2007 Методы выделения опухолевых стволовых клеток 1. Проточная цитофлуориметрия 2. Магнитная иммуноселекция 3. Обогащение популяции опухолевых клеток ОСК с помощью селекции по устойчивости к противоопухолевым препаратам 4. Обогащение популяции опухолевых клеток ОСК при культивировании в виде 3D-культур ВЫЯВЛЕНИЕ ОСК СРЕДИ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЛИНИИ MCF7 КАК СУБПОПУЛЯЦЯ КЛЕТОК CD44+CD24 -/low И КАК СУБПОПУЛЯЦИЯ SP Отсортированные клетки CD44+CD24 -/low Дифференцировка через 72 часа культивирования Takahashi А. et. al., 2014 ВЫЯВЛЕНИЕ ОСК СРЕДИ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЛИНИИ MCF7 КАК СУБПОПУЛЯЦИ SP Дифференцировка отсортированных клеток SP через 72 часа культивирования Takahashi А. et. al., 2014 Модели исследования туморогенности ОСК человека Иммунодефицитные мыши SCID (severe combined immunodeficiency mouse) – отсутствуют Т- и В- лимфоциты NOD-SCID (Nonobese Diabetic SCID) – отсутствуют T-, B- и NK-лимфоциты Dick J.E. et al, Stem. Cells.,1997 Al-Hajj M. et al, PNAS, 2003 Популяция клеток с фенотипом CD44+/CD24–/low линии MCF7 индуцирует большее число опухолей, чем клетки с фенотипом CD44+/CD24+ Тип использованных клеток MCF-7 CD44+ CD24–/low MCF-7 CD44+ CD24+ Количество введенных клеток Частота появления опухолей Время появления опухолей, недели 2 000 0/4 24 20 000 8/8 5-8 200 000 4/4 3-5 2 000 0/4 24 20 000 1/8 9 200 000 2/4 6-10 Tanaka H. et. al, 2009 Количественная оценка размера фракции туморогенных клеток опухолей человека в моделях с использованием ксенотрансплантации • Модель NOD-SCID – эффективность развития опухолей зависит от времени исследования: (вводили менее 10 000 клеток) 8 недель – 1/837000 клеток формирует опухоль 32 недели – 1/111000 клеток формирует опухоль • Модель NOD-SCID-IL2rg-/- - пальпируемые опухоли обнаруживались через 8 – 12 недель (вводили 8 клеток) в среднем – 1/9 клеток (1/5 – 1/21) Quintana E. et al., 2008 Количественная оценка размера фракции туморогенных клеток опухолей человека при аутологической трансплантации 59 больных раком на терминальной стадии Выход опухолей - 16/59 • • • 36 случаев аденокарциномы яичника – 12/36 19 случаев плоскоклеточной карциномы – 4/10 4 случая саркомы - 0/4 Опухолевые клетки вводили подкожно во фронтальную поверхность бедра в количестве от 104 до 108 Латентный период - менее 8 недель; TD50 - 106 - 107 опухолевых клеток по Baumannm., 2009. Механизмы резистентности опухолевых стволовых клеток 1.Высокое содержание АВС-транспортеров ABCB1/Pgp170, АВСG2/BCRP, ABCB5 обеспечивает: •удаление противоопухолевых препаратов из ОСК и устойчивость к повреждающим агентам •удаление флуоресцентных красителей Hoechst 33342 и родамин-123 из ОСК и формирование неокрашенной популяции клеток (side population), что позволяет анализировать и выделять популяцию ОСК 2. Высокая активность систем репарации ДНК и антиоксидантных систем обеспечивает высокую устойчивость ОСК к действию ионизирующего излучения 3. Высокая активность альдегиддегидрогеназы обеспечивает высокую устойчивость ОСК к действию алкилирующих агентов РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ ОСК Радиоустойчивость ОСК в солидных опухолях обнаружена • При раке молочной железы (Woodward WA,2007; Phillips TM, 2006, Матчук О.Н., 2013; Замулаева И.А., 2014) • При глиоме (Bao S, 2006; Kang M , 2008) • При медулобластоме (Hambardzumyan D, 2008) • При меланоме (Кондрашева И.Г., 2009; Матчук О.Н., 2013) • При раке верхних дыхательных путей (Замулаева И.А., 2014) РАДИОУСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК ФРАКЦИИ SP В КЛЕТКАХ МЕЛАНИМЫ ЧЕЛОВЕКА Кривые 1, 2 и 3 соответствуют 1, 2 и 3 суткам после облучения Кондрашева И. Г. и соавт, 2011 Содержание опухолевых стволовых клеток (популяция SP) в линиях меланомы человека через 72 часа после обработки доксорубицином или дакарбазином 12,5 Контроль Доксорубицин Дакарбазин Доля SP, % 12 10 8 6,8 6 3,5 3,3 3,2 4 2,0 2 0,7 0,4 0 Bro-B19 Mel-5 Mel-10 0,3 Нерешенные проблемы преодоления множественной лекарственной устойчивости в противоопухолевой терапии Во всех опухолях, в том числе в тех, которые не содержат традиционных маркеров резистентности, присутствует небольшая доля высоко резистентных опухолевых стволовых клеток Сохранение опухолевых стволовых клеток в организме после лечения - причина рецидивирования опухолей и появления метастазов Основная задача ближайших исследований - поиск способов удаления опухолевых стволовых клеток в процессе терапии ПУТИ ПРЕОДОЛЕНИЯ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ОСК ОБЛУЧЕНИЕ УСКОРЕННЫМИ ЧАСТИЦАМИ Ускоренные ионы углерода-12 в равной степени эффективны в отношении как опухолевых, так и ОСК • при раке толстой кишки (Cui X. et. al, 2011; • при раке поджелудочной железы (Oonishi K et. al.,2012); • при раке языка (Takahashi А. et. al., 2014). Нейтроны 14 Мэв в равной степени эффективны в отношении как опухолевых, так и ОСК • при облучении клеток меланомы (Матчук О.Н., 2012) Механизмы устойчивости опухолевых стволовых клеток к действию противоопухолевой терапии Противоопухолевые препараты Системы репарации ДНК Высокая активность систем Wnt, Hh, Notch Системы антиоксидантов ЦТЛ ? Опухолевая стволовая клетка Ионизирующее излучение Hsp70 и др. Hsp АВС-транспортеры Ингибиторы апоптоза АПОПТОЗ Роль нарушений в белках сигнальных путей, регулирующих активность СК, в происхождении опухолей и ОСК. Активация сигнальных путей Hedgehog (Hh), Notch и Wnt в опухолях Сигнальная система Notch Опухоль Острый Т-лимфобластный лимфолейкоз Эпидермоидная карцинома Нейроболастома Медулобластома Wnt Аденокарцинома толстой кишки Гепатоцеллюлярная карцинома Карцинома щитовидной железы Hh Базально-клеточная карцинома Медулобластома Мелкоклеточный рак легкого Рак поджелудочной железы Опухоли ЖКТ Рак предстательной железы Рак молочной железы Рак толстой кишки Рак печени Рабдомиосаркома Гепатоклеточная карцинома Множественная миелома Ингибиторы сигнальной системы Hedgehog Циклопамин Структурная формула салиномицина Салиномицин снижает фракцию SP в опухолевых клетках Меланома человека линия Mel-8 Контроль MFI, усл. ед. 266,7 SP 0,86 % Салиномицин MFI, усл. ед. 771,3 SP 0,14 % Верапамил MFI, усл. ед. 821,0 А SP 0,19 % Меланома человека линия Mel-10 Контроль MFI, усл. ед. 872,7 SP 0,08 % Салиномицин MFI, усл. ед. 999,8 SP 0,02% Верапамил MFI, усл. ед. 882,2 SP 0,04 % Б Структурная формула никлозамида Генымишени Генымишени Рецептор цитокинов Генымишени ЗАКЛЮЧЕНИЕ ОСК - клетки, определяющие рост и метастазирование опухоли. ОСК способны к неограниченной пролиферации, дают потомство гетерогенных клеток, в том числе ОСК. ОСК высоко устойчивы к химиотерапии и радиотерапии. При раке молочной железы субпопуляция опухолевых клеток с фенотипом CD44+CD24–/low и клетки, формирующие SP, обладают свойствами ОСК и способны индуцировать опухоли при трансплантации иммунодефицитным мышам линии NOD-SCID, идентичные исходной. В клинических исследованиях при раке молочной железы - не обнаружено корреляции между количеством клеток CD44+CD24–/low и клиническими данными (частота этих клеток – прогрессия опухоли) - обнаружена большая распространенность метастазов при опухолях с большим количеством клеток CD44+CD24–/low . ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ ТЕРАПИЯ ДОЛЖНА БЫТЬ НАПРАВЛЕНА НА ЭЛИМИНАЦИЮ ОСК ПРИ СОХРАНЕНИИ НОРМАЛЬНЫХ СК Терапевтические воздействия Опухоль Удаление опухолевых и ОСК Защита нормальных СК Благодарю за внимание !
