Клинические лабораторные исследования тканевых маркеров в опухолях костей Н.Е.Кушлинский
advertisement
Клинические лабораторные исследования тканевых маркеров в опухолях костей Н.Е.Кушлинский И.В.Булычева Ю.Н.Соловьев Е.А.Тен И.В.Казачок Е.Ю.Руссо А.Н.Махсон РАМН (27 сентября 2011г.) «Биологические маркеры – это количественно определяемые биологические параметры, которые как индикаторы определяют норму, патологию и результат лекарственного лечения» (Biomarkers Difinitions Working Group, USA) На протяжении всего ХХ века исследователи пытались сформулировать конкретные признаки, которые отличают опухолевые клетки и ткани от их нормальных предшественников, поскольку прогресс в данной области представляет основу для: диагностика опухолей оценка прогноза выявление мишеней «таргетной терапии» диагностика кардио-, гепато-, нефро-, нейротоксичности обнаружение рецидива оценка функционального состояния органов и систем Однако, по мнению основоположников молекулярной онкологии профессоров D.Hanagan и R.Weinberg, «это занятие оказалось довольно затруднительным и связано с огромным разнообразием биологических проявлений новообразований». Но, тем не менее, к настоящему времени удалось выделить и классифицировать несколько тенденций, подкрепленных данными биохимических и молекулярно-биологических исследований. (Cell.-2000.-Vol.100.-p.57-70). Устойчивость к ингибиторам роста Избегание имунного ответа Включение репликативного бессмертия Постоянные сигналы пролиферации Воспаление, стимулирующее опухоль Дерегуляция энергетических процессов Устойчивость к апоптозу Мутации и генетическая нестабильность Активация инвазии и метастазирования Индукция ангиогенеза Новообразования костей составляют от 1 до 2% всех новообразований человека. В России по данным на 2010 г. саркомы костей составили около 1% в структуре всех злокачественных опухолей. Остеосаркома составляет около 50% всех злокачественных опухолей костей. Локализация опухолевого процесса при остеосаркоме в зонах роста длинных трубчатых костей. Остеосаркома обнаруживается в 15-18 лет, в 2 раза чаще выявляется у мужчин. В 95% остеосаркома метастазирует в легкие. “Болезнь всегда ведёт к смерти. Мировая литература содержит лишь немногочисленные безупречно доказанные случаи длительного излечения больных остеогенной саркомой. Если больной с диагнозом “остеогенная саркома” выздоровел, скорее всего следует подумать не была ли допущена диагностическая ошибка” Профессор С.А.Рейнберг (60-е годы ХХ столетия) Clinical Practice Guidelines in Oncology (National Comprehensive Cancer Network) В диагностике опухоли кости в консилиуме участвуют нескольких специалистов: ОНКОЛОГ (хирург) ПАТОЛОГОАНАТОМ РЕНТГЕНОЛОГ ХИМИОТЕРАПЕВТ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПЕВТ КЛИНИЧЕСКИЙ БИОХИМИК ГЕНЕТИК Обследованные группы больных новообразованиями костей Нозологический вариант опухоли Число больных Пол Возрастные группы (годы) Средний возраст Мужской Женский 11-20 21-30 31-40 41 и > (годы) 266 173 93 164 69 16 18 18,00,6 Хондросаркома 88 58 30 16 13 20 39 34,53,8 Саркома Юинга 73 49 24 50 20 3 — 17,10,5 Злокачественная фиброзная гистоицитома 32 17 15 8 11 6 7 26,02,3 Гигантоклеточная опухоль кости 84 40 44 10 42 28 6 32,02,4 Всего: 568 358 211 251 165 73 70 Остеосаркома ГСПС, свободный Те и ИСА в крови подростков мужского пола пубертатного периода, больных остеосаркомой и в контроле ГСПС Свободный Те ИСА 120 100 нМ/л 80 % 60 40 20 0 14 15 16 17 Возраст, годы Остеосаркома Контроль 18 Полипептидные гормоны у больных остеосаркомой женщин в разные периоды менструального цикла ГР (нг/мл) ЛГ (Ед/л) ФСГ (Ед/л) Пролактин (нг/мл) Остеосаркома 4,81,6 4,31,8 5,00,6 10,54,0 Контроль 2,71,3 6,81,3 6,41,5 10,43,2 Остеосаркома 4,10,7 4,00,8 3,80,7 21,53,7 Контроль 2,90,5 5,21,2 4,30,6 8,64,0 Фаза менструального цикла Фолликулярная Лютеиновая Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека Опухоли Рецепторы обнаружены (%) РЭ РА Молочная железа 79 34 Матка 69 55 Яичники 77 50 Влагалище 56 Гортань 69 52 Простата 58 77 Желудок 48 30 Прямая кишка 31 Печень 40 73 Поджелудочная железа 0 100 Легкие 16 0 Почки 5 100 Меланома 25 8 46-62 36-52 САРКОМЫ КОСТЕЙ Рецепторы андрогенов в прогнозе общей выживаемости больных остеосаркомой 120 Выживаемость, % 100 РАРА+ 80 60 40 20 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Месяцы P*vs**<0.05 Прослеженность - 94% (n=125) Рецепторы эстрогенов и общая выживаемость больных остеосаркомой в условиях адъювантной терапии 120 Выживаемость (%) 100 80 **РЭ+ *РЭ- 60 40 20 0 0 6 18 Время (месяцы) 36 60 P*vs**<0.05 Прослеженность - 94% (n=125) Метаболизм андрогенов в тканях-мишенях Эстрогены 3 Андрост-4-ен-3,17-дион 3 Тестостерон 1 2 2 1 5a-андростан-3,17-дион 5 Дигидротестостерон 4 4 Андростерон Изо-андростерон 1 5 5a-андростан-3a,17b-диол 1 5a-андростан-3b,17b-диол Ферменты: 2 - 5a-редуктаза 3 - ароматаза Гидроксистероидоксидоредуктазы: 1 - 17b-; 4 - 3a-; 5 - 3b-; 6 - 6a-; 7 - 7a-, 7b- 6,7 Триолы Метаболизм андрогенов в опухолях костей Тестостерон 5a-редуктаза Дигидротестостерон 3a-гидроксилаза 3b-гидроксилаза 3a-диол 3b-диол Х (обнаружено впервые) Активности ферментов в опухолях 5a-редуктаза ХОНДРОСАРКОМА 3a-гидроксилаза 3b-гидроксилаза САРКОМА ЮИНГА САРКОМА ЮИНГА Гигантоклеточная опухоль Гигантоклеточная опухоль Гигантоклеточная опухоль Остеосаркома Хондросаркома Остеосаркома Саркома Юинга Остеосаркома Хондросаркома Система VEGF VEGF-B167 VEGF-B186 PLGF-1,2 VEGF-A121 VEGF-A145 VEGF-A165 VEGF-A189 VEGF-A206 VEGFR-3 Raf PI3-K Проницаемость сосудов VEGF-C VEGF-D VEGFR-2 VEGFR-1 Akt/PKB VEGF-E p38MAPK Выживание эндотелиальных клеток MEK Миграция эндотелиальных клеток ERK Пролиферация эндотелиальных клеток Активаторы ангиогенеза Ингибиторы ангиогенеза Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) Эндостатин Плацентарный фактор роста (PlGF) Ангиостатин Факторы роста фибробластов (FGF) 16 кДа фрагмент пролактина Трансформирующие факторы роста a и b Ламинин Эпидермальный фактор роста (EGF) Фибронектин Инсулиноподобные факторы роста (IGF) Тромбоспондин Тромбоцитарный фактор роста эндотелиоцитов (PDECGF) Тромбоцитарный фактор-4 (PF-4) Фактор некроза опухолей (TNF, низкие дозы) Фактор некроза опухолей (TNF, высокие дозы) Интерлейкины (IL-1, IL-3, IL-6, IL-8) Интерлейкины (IL-12) Колониестимулирующие факторы Интерфероны Ангиогенин (Ang) Ингибиторы тканевых металлопротеиназ Активатор плазминогена урокиназного типа Ингибиторы активаторов плазминогена (uPA) (PAI-1, PAI-2) Содержание VEGF в опухолях Тип опухоли Экспрессия VEGF (%) Рак молочной железы 58 Рак толстой кишки 55 Немелкоклеточный рак легкого 52 Рак яичников 65 Саркома мягких тканей 40 Хондросаркома 90 Остеосаркома 56 Рак почки 60 Гиперэкспрессия VEGF в опухоли коррелирует с плохим прогнозом Ингибиторы ангиогенеза, направленные на подавление активности проангиогенных факторов Препарат Механизм эффекта Бевацизумаб (Авастин) Рекомбинантные человеческие моноклональные антитела к VEGF. Сорафениб (Нексавар) Мультитаргетный тирозин-киназный ингибитор. Подавляет активность: PDGFR-B – рецептор тромбоцитарного фактора роста В; VEGFR-2 и VEGFR-3; RAF-1 – ключевой фермент сигнального пути RAS-RAF-MEK-ERK; c-KIT – трансмембранный тирозинкиназный рецептор фактора роста; Ген ret. Сунитиниб (Сутент) Мультитаргетный тирозин-киназный ингибитор. Подавляет активность: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3; PDGFR-A, PDGFR-B; c-KIT; Ген ret. Схема биосинтеза простагландинов и лейкотриенов Фосфолипиды (мембрана) Фосфолипаза А2 Липоксигеназа Лейкотриены Арахидоновая кислота Циклооксигеназа Тромбоксан-синтаза ПГН2 ПГ-редуктаза ПГ-оксоциклаза TxA2 TxB2 ПГF2a ПГЕ-изомераза Простациклин ПГЕ2 6-кето-ПГFa Метастазирование остеосаркомы в 1-й год наблюдения у пациентов, леченных адриамицином перед операцией, и уровни ПГЕ2 12 10,1 Метастазы в легких обнаружены, % Концентрация ПГЕ2 (пг/г ткани) Содержание ПГЕ2 в остеосаркоме и доброкачественных опухолях кости 10 8 6 2,9 4 100 90 80 98 70 60 50 40 30 20 2 10 Остеосаркома 17 0 Доброкачественные опухоли >=9,0 нг/г ткани <9,0 нг/г ткани Метастазирование остеосаркомы и ПГЕ2 в опухоли 120 Выживаемость, % 0 100 <=9.0 нг/г ткани >9.0 нг/г ткани 80 60 40 20 0 0 6 12 Месяцы 18 24 36 Сигналы активирующие p53 и его эффекты Недостаточность нуклеотидов Ультрафиолетовое излучение Ионизирующее излучение Онкогенные сигналы Гипоксия Блокирование транскрипции p53 Остановка клеточного цикла Восстановление ДНК Блокирование ангиогенеза или Физиологическое старение клетки Возврат к пролиферации Апоптоз р53 в опухоли и выживаемость больных остеосаркомой (Kaplan-Meier) (Kaplan-Meier) 100% Общая выживаемость, % 90% 80% Медианы 49,4 мес. 18,3 мес.. 70% 60% 50% р=0,04 40% 30% 20% 10% 0% 0 20 40 60 80 100 120 сроки наблюдения, мес. 140 160 р 53 р 53 + Безрецидивная выживаемость, % 100% 90% 80% Медианы 24,5 мес. 10,8 мес. 70% 60% 50% р=0,1 40% 30% 20% 10% 0 20 10 40 30 60 50 80 70 100 90 сроки наблюдения, мес. 110 р 53 р 53 + Про-апоптотические сигналы опосредованные Bcl-2 белками Выживание клетки Про-апоптотический эффект Про-апоптотический эффект Bcl-2 Bim Bcl-XL Puma Bcl-w tBid tBid Mcl-1 Noxa A1 Про-апоптотический эффект Bax Bak АПОПТОЗ Частота выявления Ваx в опухоли больных хондросаркомой р=0,0001 100% 90% 80% 70% 60% 50% 84,2% Вах(+) Вах(-) 100,0% 40% 30% 20% 10% 15,8% 0% Доброкачественные хрящеобразующие опухоли Хондросаркома Среднее значение Частота выявления 40% р=0,2 37,5% 30% 20% 15,4% 12,5% 10% 80% р=0,05 70% 57,1% 60% 48,3% 50% 40% 36,0% 30% 20% 0,0% 10% 0% G1 G2 G3 G4 Степень злокачественности опухоли Т1 Т2 Т3 Критерий распространенности Т Безрецидивная выживаемость больных хондросаркомой с учетом выявления Вах в опухоли Безрецидивная выживаемость, % 100% 80% 60% p=0,01 40% 20% 0% 0 10 20 30 40 50 60 70 сроки наблюдения, мес. 80 Вах (-) Вах 10%- 40% Вах > 40% LPA тромбин SRC TGF-α CBL EGF PLC Эпирегулин Β-целлюлин PI3K HB-EGF АмфиNRG-1 NRG-2 NRG-3 NRG-4 Цитокины регулин SHC SHP2 P21-GDP NCK VAV GRB-2 GAP GRB-7 CRK JAC RAC SOS P21-GTP PAK HER1 RAF AKT HER2 PKC BAD S6K ABL JNKK MEK JNK MAPK JUN HER3 SP1 MYC FOS ELK ERG1 STAT HER4 АПОПТОЗ МИГРАЦИЯ РОСТ АДГЕЗИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ Частота выявления РЭФР в опухолях костей Опухолеподобные поражения Уровни РЭФР в опухолях костей 39 Гигантоклеточная опухоль 59 ЗФГ 65 58 Саркома Юинга 55 Хондросаркома 62 Остеосаркома 0 10 20 30 40 50 60 70 РЭФР+ опухоли (%) (фмоль/мг белка) Безрецидивная выживаемость больных остеосаркомой с учетом уровня РЭФР в опухоли 120 *РЭФР>150 фмоль/мг 100 80 **РЭФР- 60 ***10<РЭФР<150 фмоль/мг 40 20 0 0 300 600 900 1200 1500 P*vs**>0.05 P*vs***<0.004 P**vs***<0.05 (прослеженность 93%) Частота выявления ЭФР-подобных пептидов в остеосаркоме ЭФР+ ЭФР33,3% Общая выживаемость больных остеосаркомой с учетом наличия ЭФР-подобных пептидов в опухоли 120 66,7% Выживаемость (%) 100 80 *ЭФР+ **ЭФР- 60 40 20 0 0 300 600 900 Время (дни) 1200 1500 P*vs**<0.05 (Прослеженность - 98%) 100% 100% 90% 90% 80% 80% Медианы 49,3 мес. 21,7 мес. 70% 60% 50% 40% 30% р=0,01 20% Безрецидивная выживаемость, % Общая выживаемость, % Выявление Her-2/neu в опухоли и выживаемость больных остеосаркомой Медианы 31,3 мес. 8,7 мес. 70% 60% 50% 40% р=0,03 30% 20% 10% 10% 0% 0 20 40 60 80 100 120 140 160 сроки наблюдения, мес. Her-2 new (-) Her-2 new (+) 0% 0 20 10 40 30 60 50 80 70 100 90 сроки наблюдения, мес. 110 Her-2 new (-) Her-2 new (+) Препараты, влияющие на ЭФР-зависимые процессы в опухолевых клетках Принцип действия Влияние на синтез и секрецию факторов роста Препарат Тамоксифен Аналоги соматостатина Антисмысловые РНК Стадия изучения Исследование in vitro Клиническое использование без учета влияния на факторы роста Экспериментальная разработка Неспецифическое подавление взаимодействия факторов роста с рецепторами Сурамин Каррагенаны Сульфаты ламинарина Сульфаты декстрана Детально изучен механизм действия in vitro 1 фаза клинических испытаний Специфическое подавление взаимодействия лигандов с рецепторами ЭФР Моноклональные антитела к РЭФР: IgG2a-528, IgG1-225, IgG2a-425, ch225, m225, EMD 55900, RG83852 Экспериментальные исследования in vitro и in vivo Предклинические испытания 1 фаза клинических испытаний Препараты, влияющие на ЭФР-зависимые процессы в опухолевых клетках Принцип действия Препарат Стадия изучения Влияние на функциональную активность РЭФР Ингибиторы тирозинкиназы: генистеин, тирфостины Активаторы тирозинфосфатазы: О-фосфотирозин Исследование на культурах клеток и на опухолях, перевитых бестимусным мышам Направленный перенос цитотоксических агентов Рекомбинантные белки: a-ТФР-экзотоксин А Pseudomonas: TP40, PE35/TGF-a-KDEL, Cys-PE40; ЭФР-дифтерийный токсин:DAB389EGF Исследование на колониеобразующую и пролиферативную способность культур клеток, рост опухолей у бестимусных мышей Предклинические испытания Лиганды Рецепторы Система IGF IGFBP Протеазы Инсулин IGF-I IGF-II IR-A (инсулиновый рецептор) IGF-IR α α α α α α ββ ββ ββ IGF-IIR Гибридный рецептор IGFBP-1 IGFBP-2 IGFBP-3 IGFBP-4 IGFBP-5 IGFBP-6 PAPP-A PAPP-A2 MMP-1 MMP-2 Цистеиновая протеаза Плазмин Тромбин Кальций-зависимая сериновая протеаза MMP-3 PSA Сериновая протеаза Катепсин-L Направление терапии Применяемые препараты Исследования IGF-I и IGF-II Препараты уменьшающие биодоступность лигандов: Аналоги саматостатина Антагонисты гормона роста (GH) Рекомбинантные человеческие IGFBP Эффект в преклинических исследованиях остеосаркомы. Клинические исследования, фаза I – значимого эффекта не получено IGF-IR Антитела к IGF-IR – R-1507 Клинические исследования, фаза I – эффект у 4 из 8 больных саркомой Юинга Антитела к IGF-IR – AMG-479 Клинические исследования, фаза I – эффект при лечении саркомы Юинга Моноклональные антитела CP-751, 871 Клинические исследования, фаза I – частичный эффект при лечении саркомы Юинга R1501, AMG479, CP-751, 871 Клинические исследования, фаза II – проводятся в настоящее время Ингибиторы тирозинкиназного домена: NVP-AEW-541 и NVP-ADW-742 Преклинические модели сарком скелетной мускулатуры Тирозинкиназный домен IGF-IR Bart Rikhof et al., 2009 Частота выявления ММР-1 в хондросаркомах 100% 90% 80% 70% частота 60% 50% 84,6% 100,0% 40% 30% 20% p<0,0001 10% 15,4% 0% Доброкачественные хрящеобразующие опухоли Хондросаркома ММР1(+) ММР1(-) ММР-1 в хондросаркомах 40% 35% ММР1(-) частота 30% Содержание в % 37,5% р=0,18 20% 15,4% 12,6% 10% 0,0% G2 G3 р=0,16 30,0% 27,1% 26,4% 25% 20,0% 15% 0% G1 ММР1(+) G1 G4 Степень злокачественности опухоли G2 G3 G4 ММР1(+) ММР1(-) Содержание в % 60% 50,0% частота 50% р=0,027 40% 30% 20% 12,0% 31,3% р=0,4 30% 25,5% 23,3% 10% 0,0% 0% 20% Т1 Т2 Т3 Т1 Критерий распространенности Т Т2 Т3 Общая выживаемость, % 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% р=0,03 30% 20% 10% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Сроки наблюдения, мес. ММР1(-) ММР1(+) Безрецидивная выживаемость, % Общая и безрецидивная выживаемость больных хондросаркомой с учетом выявления ММР-1 в опухоли 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% р=0,049 20% 10% 0% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ММР1(-) ММР(+) Сроки наблюдения, мес. Многофакторный анализ общей и безрецидивной выживаемости выявил, что на отдаленные результаты лечения больных хондросаркомой влияют критерии Т и G, а также показатель ММР-1 в опухоли. У больных хондросаркомой G1-G2 степенями злокачественности наличие в опухоли ММР-1 снижало 3-летнюю безрецидивную выживаемость на 40%. Определение ММР-1 в ткани опухоли больных хондросаркомой может являться только дополнительным прогностическим фактором заболевания. Общая выживаемость, % 100% 90% 80% 70% 60% р=0,2 50% 40% 30% 20% 10% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 сроки наблюдения, мес. ММР9 менее 40% ММР9 более 40% ММР9=40% Безрецидивная выживаемость, % Общая и безрецидивная выживаемость больных хондросаркомой с учетом содержания ММР-9 в опухоли 100% 90% 80% 70% 60% 50% р=0,007 40% 30% 20% 10% 0% -10% 0 10 20 30 40 50 60 70 сроки наблюдения, мес. 80 ММР9 менее 40% ММР9 более 40% ММР9=40% У больных хондросаркомой кости с распространенностью Т2-Т3 и содержанием в опухоли ММР-9 более 40% снижало 3-летнюю безрецидивную выживаемость на 30%. Определение ММР-9 в хондросаркомах может служить дополнительным прогностическим фактором. Сравнение содержания t-PA, u-PA и PAI-1 в метастазирующих и неметастазирующих остеосаркомах Сравнение содержания t-PA, u-PA и PAI-1 в рецидивных и безрецидивных хондросаркомах Молекулярно-биологический «портрет остеосаркомы» (тканевые маркеры) РА+ Her-2/neu+ РЭРЭФР+ РГ- p53+ ЭФР- ПГЕ2 >9,0 нг/г ткани ЛССК кальмодулина >6000 нг/мг белка VEGF тестостерона >1,0 нмоль/мг белка tPA PAI-1 Показатели 5-летней безметастатической выживаемости больных остеосаркомой после комплексного лечения При III-IV степени лечебного патоморфоза Независимо от степени лечебного патоморфоза Больные без метастазов, % 120 Хирургическое лечение 100 72,3 80 48,2 60 40 20 7,0 0 0 1 2 3 4 Время после хирургического лечения (годы) 5 Основные свойства опухолевых клеток Ингибиторы циклин-зависимых киназ Устойчивость к ингибиторам роста Постоянные сигналы пролиферации Иммунологическая активация CTLA4mAT Избегание имунного ответа Включение репликативного бессмертия Ингибиторы теломераз Ингибиторы EGFR Воспаление, стимулирующее опухоль Дерегуляция энергетических процессов Селективные противовоспалительные препараты Аэробные ингибиторы гликолиза Устойчивость к апоптозу Проапоптатические ВН3 миметики Мутации и генетическая нестабильность Ингибиторы PARP Активация инвазии и метастазирования Индукция ангиогенеза Ингибиторы HGF\Met Ингибиторы VEGF Hanahan and Weinberg, 2011 (Cell 144, 4 March 2011)
