Федеральная целевая программа

Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Соглашение
14.625.21.0005 от 25.08.2014
на период 2014 - 2016 гг.
Тема: Разработка конкурентоспособного способа
получения янтарной кислоты микробиологическим
синтезом из возобновляемого сырья для
производства биоразлагаемых пластиков и
дефицитных химикатов
Руководитель проекта: исп. директор БРЦ ВКПМ
Синеокий С.П.
Науки о жизни
Участники проекта
Получатель субсидии: Федеральное государственное унитарное предприятие
"Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных
микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика")
• Основные направления деятельности - Проведение фундаментальных, прикладных и
поисковых научных исследований , НИР и ОКР в области биотехнологии. Разработка новых
биотехнологических процессов для использования в различных отраслях промышленности,
сельского хозяйства, производство и реализация биотехнологической продукции и др.
•Опыт аналогичных проектов – участие исполнителей в 15 проектах за последние 5 лет
Индустриальный партнёр: Компания "ОРЦ УФА“ (Республика Башкортостан)
осуществляет внебюджетное софинансирование проекта, входит в группу компаний «Разгуляй».
Основные виды деятельности ООО "ОРЦ Уфа" и группы компаний «Разгуляй» : оптовая
торговля сельскохозяйственным сырьем и c/х животными , растениеводство, животноводство,
переработка с,х продукции.
Роль индустриального партнера в проекте - масштабирование разрабатываемой технологии,
организация опытно-промышленного производства янтарной кислоты.
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
2
Цели и задачи проекта
•1 Разработка основ конкурентоспособного процесса биоконверсии растительного
сырья в янтарную кислоту, используемую в качестве субстрата для синтеза широкого
спектра промышленно-ценных органических соединений, включая биоразлагаемые
полимеры.
•2 Получение высокопродуктивных и технологичных рекомбинантных дрожжевых
штаммов- продуцентов янтарной кислоты, позволяющих получать янтарную кислоту без
промежуточного образования солей в ходе ферментации.
•3 Получение высокопродуктивного штамма-продуцента ферментного препарата
термостабильной альфа-амилазы.
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
3
Ожидаемые результаты проекта
•В рамках проекта будет разработана и апробирована на пилотной установке
биотехнология получения янтарной кислоты на основе использования рекомбинантых
кислотоустойчивых дрожжевых штаммов-продуцентов Yarrowia lipolytica, позволяющих
осуществлять аэробную ферментацию при низких значениях рН без промежуточного
накопления солей янтарной кислоты в культуральной среде. Предуcматривается также
конструирование рекомбинантного продуцента янтарной кислоты на основе
кислотоустойчивого дрожжевого штамма S.pombe, позволяющего осуществлять
микроаэрофильную ферментацию янтарной кислоты при низких значениях рН
культуральной среды.
•Проект включает также конструирование рекомбинантного бациллярного продуцента
термостабильной альфа-амилазы, используемой для ферментативного гидролиза
крахмала в технологиях получения сахаров, используемых в качестве субстрата в
ходе ферментации янтарной кислоты.
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
4
Перспективы практического использования
•Результаты работ могут быть использованы для создания перспективных
промышленных биотехнологий для крупнотоннажного производства янтарной кислоты с
использованием в качестве субстрата продуктов глубокой переработки зерна.
Создаваемая биотехнология должна обеспечивать конкурентоспособность
биотехнологического производства янтарной кислоты, используемой в качестве
субстрата для получения промышленно-ценных продуктов органической химии.
•Масштабное биотехнологическое производство этих органических кислот позволит
существенно расширить возможности переработки зерна в продукцию с высокой
добавленной стоимостью; создать новую конкурентоспособную технологическую
платформу для получения широкого спектра ценных органических соединений, в т.ч.
биоразлагаемых полимеров. Разработка и внедрение подобных технологий позволит
получить существенный экономический и социальный эффект, станет важным этапом
развития отечественной «белой биотехнологии».
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
5
Состояние выполнения запланированных
индикаторов
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Число публикаций по результатам исследований и разработок в научных
журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки"
(WEB of Science), не менее 2. Выполнение: подготовлены к публикации 2 статьи
Число патентных заявок, поданных по результатам исследований и разработок, не
менее 1. Выполнение: подготовлена 1 заявка на патент
Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей участников проекта, не менее 33,4 %. Выполнение: 51,6 %
Объем привлеченных внебюджетных средств – 15 млн.руб. Ход выполнения на
ноябрь 2015 - 12,29 млн.руб.
Средний возраст исследователей – участников проекта, не более 46 лет.
Выполнение: 41,8 лет
Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и
достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта
организация - исполнитель проекта, не менее 1. Выполнение: 1
Использование при выполнении ПНИ уникальных научных установок – 1.
Выполнение: 1
Использование при выполнении ПНИ научного оборудования центров
коллективного пользования научным оборудованием – 1. Выполнение:1
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
6
Результаты исследовательской работы,
полученные в 2015 г.
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
7
Пункты КП этапа проекта
• 3.1 Проведение анализа влияния внесенных модификаций в геном S.pombe на
изменение метаболизма клеток и синтез янтарной кислоты;
• 3.2 Конструирование
S.pombe;
рекомбинантного продуцента янтарной кислоты на основе
• 3.3 Разработка процесса ферментативного гидролиза крахмала получаемого при
глубокой переработке зерна и оценка степени гидролиза;
• 3.4 Проверка эффективности использования полученных сахаров для ферментации
янтарной кислоты;
• 3.5 Оптимизация условий культивирования продуцента янтарной кислоты Y. lipolytica на
минеральной среде на основе пролонгированной ферментации при низких рН;
• 3.6 Сравнение эффективности выделения янтарной кислоты из культуральной жидкости
с помощью следующих методов: а) прямой кристаллизацией из бесклеточных
упаренных растворов; б) с использованием ионного обмена; в) с переводом в
диэтиловый эфир янтарной кислоты;
• 3.7 Масштабирование лабораторного процесса получения янтарной кислоты на основе
модифицированного рекомбинантного штамма–продуцента дрожжей Y. lipolytica;
• 3.8 Проведение дополнительных маркетинговых исследований рынка янтарной кислоты;
• 3.9 Проведение дополнительных маркетинговых исследований рынка полимеров и
других промышленно-значимых химических соединений на основе янтарной кислоты;
• 3.10 Отработка режимов глубокой переработки зерна на модельной установке.
• 3.11 Проведение пуско-наладочных работ модельной установки;
• 3.12 Отработка режимов ферментации на модельной установке.
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
Пути синтеза янтарной кислоты в дрожжах
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
9
Этапы создания штамма - продуцента
Конструирование
плазмиды
Внесение модификации в геном штамма S.
pombe
Проведение анализа внесенной
модификации на изменение
метаболизма клеток
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
10
Мишени для модификации
1. Усиление восстановительной
ветви ЦТК:
Интеграция чужеродных генов с
оптимизацией кодонов для дрожжей S. pombe
и модификацией белковой
последовательности для локализации
ферментов в цитоплазме:
-
MDH из Rhizopus oryzae
FUM из Rhizopus oryzae
FRDg из Trypanosoma brucei
FRDm из Trypanosoma brucei
2. Инактивация основных/или всех
PDC генов на пути превращения
пирувата в этанол:
- PDC1
- PDC2
- PDC3
- PDC4
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
3. Увеличение потока пирувата на
оксалоацетат:
Усиление транскрипции гена PYC
дрожжей
S. pombe
- Интеграция PEPCK из Actinobacillus
succinogenes с оптимизацией кодонов для
дрожжей S. pombe
-
- SthA из Escherichia coli с
оптимизацией кодонов для дрожжей
S. pombe
4. Сохранение баланса: NAD/NADH
5. Усиление транспорта
янтарной кислоты:
- Усиление транскрипции гена MAE1
дрожжей
S. pombe или инсерция второй копии
гена
ФЦП ИР
2014-2020
11
Развитие векторной системы для дрожжей S. pombe
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
12
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
13
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
14
Анализ влияния гетерологичных генов на синтез
янтарной кислоты и потребление глюкозы
Исследуемые штаммы S. pombe, содержащие гетерологичные гены:
17A-RoFUM FRDg-opt
17B-RoFUM FRDg-opt
17A –RoFUM FRDm
17B-RoFUM FRDm
17-RoMDH RoFUM
17-RoMDH
Родительские штаммы:
285-Δura4
17-2 (Δpdc3Δura4)
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
15
Потребление глюкозы и мальтозы
рекомбинантными штаммами S. pombe
Потребление глюкозы в зависимости
от времени культивирования
Потребление мальтозы в зависимости
от времени культивирования
30
25
24
часа
20
30
часов
15
10
5
Потребление мальтозы, г/л
Потребление глюкозы, г/л
30
25
24
часа
20
30
часов
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
Исследуемые штаммы
1
2
4
5
6
Исследуемые штаммы
Исследуемые штаммы S. pombe:
1 – 17A-RoFUM FRDg-opt
2 – 17B-RoFUM FRDg-opt
RoFUM 4 – 17-RoMDH
Контроль:
5 – 285-Δura4
6 – 17-2 (Δpdc3Δura4)
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
3
3 – 17-RoMDH
ФЦП ИР
2014-2020
16
Образование янтарной кислоты на глюкозе в
микроаэрофильных условиях
Потребление глюкозы на LB
0.8
100
0.7
Потребление глюкозы, г/л
Количество янтарной кислоты, г/л
Синтез янтарной кислоты на LB с
глюкозой (10%)
80
0.6
0.5
60
0.4
40
0.3
0.2
20
0.1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Исследуемые штаммы
48 часов
120 часов
1
2
3
4
5
6
Исследуемые штаммы
48 часов
7
8
120 часов
Исследуемые штаммы S. pombe:
1 – 17A-RoFUM FRDg-opt
2 – 17B-RoFUM FRDg-opt 3 - 17A –RoFUM FRDm
4 – 17B-RoFUM FRDm
5 – 17-RoMDH RoFUM
6 – 17-RoMDH
Контроли:
7 – 285-Δura4
8 – 17-2 (Δpdc3Δura4)
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
17
Потребление мальтозы на среде
LB
Синтез янтарной кислоты на
среде LB с мальтозой (10%)
100
0.8
80
100
Потребление мальтозы, г/л
1
80
60
0.6
60
40
0.4
40
20
0.2
20
0
0
1
2
3 4 5 6 7
Исследуемые штаммы
48 часов
8
0
1
2
3
4
5
6
7
Исследуемые штаммы
48 часов
Исследуемые штаммы S. pombe:
1 – 17A-RoFUM FRDg-opt
2 – 17B-RoFUM FRDg-opt
RoMDH RoFUM
6 – 17-RoMDH
Контроли:
7 – 285-Δura4
Содержание остаточной
глюкозы в ферментационной
среде
Количество глюкозы, г/л
Количество янтарной кислоты, г/л
Образование янтарной кислоты штаммами S. pombe
на мальтозе в микроаэрофильных условиях
8
3 - 17A –RoFUM FRDm
1
2
3 4 5 6 7 8
Исследуемые штаммы
48 часов 120 часов
4 – 17B-RoFUM FRDm
5 – 17-
8 – 17-2 (Δpdc3Δura4)
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
18
Характеристика фермента термостабильной альфа-амилазы,
продуцируемой сконструированным в данной работе рекомбинантным
штаммом B. subtilis
рН оптимум действия
фермента
Температурный оптимум действия
фермента
Биосинтез термостабильной альфа-милазы
штаммом-продуцентом в 10-литровом
ферментере
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
19
Гидролиз крахмала ферментами, полученными с
использованием бациллярного штамма-продуцента
термостабильной альфа-амилазы
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
20
Культивирование рекомбинантного штамма –
продуцента янтарной кислоты Y. lipolytica в оптимальных условиях:
периодический режим с начальной подтитровкой
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
21
Спасибо за внимание!
Докладчик:
Исполнительный директор БРЦ ВКПМ Синеокий С.П.
Соглашение №<номер> 14.625.21.0005
ФЦП ИР
2014-2020
22