Аналитическое ультрацентрифугирование

Аналитическое ультрацентрифугирование
1913.
A.
Думанский
предложил
использовать
ультрацентрифугирование для определения размеров
коллоидальных частиц.
1923. T. Сведберг и Д. Николс сконструировали первую
ультрацентрифугу, содержащую оптическую систему для
анализа частиц в поле ультрацентрифуги. Годом позже
Сведберг наблюдал уменьшение поглощения у вершины
центрифужной кюветы для раствора гемоглобина.
В 1926 Сведберг провел первое измерение молекулярных
весов
гемоглобина
и
овальбумина
методом
седиментационного равновесия, а в 1927 году он
определил молекулярный вес гемоглобина сочетанием
методов седиментации и диффузии.
Сведберг пришел к
пророческому выводу, что белки
представляют макромолекулы, состоящие из большого
числа атомов, соединенных ковалентными связями.
Parent
F1
Золотые годы ультрацентрифуги (1960-1980)
Забвение (1980-1995),
Возрождение (1995- 2005)
F2
1
Роторы ультрацентрифуги
Ротор в аналитической ультрацентрифуге способен вращаться при
скоростях до 50 000 об/мин. Он должен выдерживать большие
гравитационные напряжения. Так при скорости
60 000 об/мин
гравитационное поле ультрацентрифуги достигает 300 000 g . При этих
условиях масса 1 г имеет кажущийся вес 300 кг.
2
Кюветы ультрацентрифуги
1. Одно-секториальная ячейка
2. Би-секториальная ячейка.
3. Би-секториальная ячейка с наслаиванием или границе-образующая
ячейка
C=0
Наслаиваемый
растворитель
C0
3
Оптические системы регистрации в ультрацентрифуге
C0
t1
(b)
Concentration gradient dc 2 /dx
(a)
0
Concentration c 2
t2

0
0
t1
t2

0
 
x=0
Distance
Оптика поглощения
 
 
x=0
Distance
 
Интерферометрическая
оптика
Шлирен4
оптика
Два типа экспериментов в ультрацентрифуге
5
Два типа экспериментов в ультрацентрифуге
Скоростная
седиментация
Седиментационное
равновесие
Угловая скорость
Большая
Маленькая
Анализ
Как функция
времени (3 часа)
Равновесие
(после 24 часов)
Макромолекула
Движется
В равновесии
Измерения
Анализ
седиментирующей
границы
Распределение
молекул в кювете
Вычисляемые параметры
Форма
макромолекулы и
ее масса
Масса
макромолекулы
6
Уравнение Ламма
Уравнение Ламма описывает процессы транспорта в ультрацентрифуге. Оно
получается введением дополнительного члена в первое уравнение Фика.
Jx = –D[dC/dx] + uC(x)
поскольку u = sω2x
Jx = –D [dC/dx] + sω2xC(x)
Диффузионый и седиментационный вклады
Идеальный процесс
Процесс в ультрацентрифуге
(dC/dt)r = –1/r {d/dr [ω2r2s C – Dr (dc/dr)t]}t
7
Уравнение Ламма не имеет аналитического решения!!!!
Определение коэффициента седиментации из профиля
движущейся границы. Рутинная мода: s and D четко определены.
M
ni
i
scus

2
s=
(1/ 
)
dlnrm/
dt
d
i
B
oundaru
ln r mi d
r=0

S
rmdi
R
adi
us(cm
)
T
m
i
e(
sec)
Скорость движущейся границы определяется скоростью изменения ее радиальной координаты во
времени drb/dt.
u = drb/dt = ω2rs
После интегрирования
ln rb(t)/rb(t0) = ω2s(t-t0)
Наклон ln rb(t)/rb(t0) против (t-t0) дает ω2 s и, следовательно, s
8
Уравнение Ламма
1d
 dC 

  
r  dr
 dt  r
 2 2
 dC   
 r sC  Dr  dr   

 t  t

Метод
“средней
точки”
Вклад седиментации сравним с
вкладом диффузии (M< 100 кДа)
Вклад седиментации намного больше
вклада диффузии ( M> 500 кДа)
absorbance [OD]
1
0
9
-1
Решение уравнения Ламма при различных граничных условиях
Граничные условия
Решениe
Седиментация +
диффузия
Аналитическое решение не
существует
Только седиментация
Точное решение
существует
c0
t1
t2
Plateau
Boundaru
x
Только диффузия
Вклад седиментации
сравним с вкладом
диффузии
Точное решение
существует
Метод ван Холде-Вайшета
Метод Стаффорда
Численные решения
(программа SEDIT)
10
Fc + Fb + Fd = 0
mω2r (1 – ρ0 ) = fu
s ≡ u/ω2r = M (1 –  ρ0)/NA f
Отношение скорости частицы к ее центрифужному ускорению
называется константой седиментации, s. Ее размерность секунда.
s = 2S
11
-1
-1
-1
absorbance [OD]
0
1
0
6
6.5
6
6.5
7
absorbance [OD]
1
absorbance [OD]
0
1
поглощение [OE]
-1
-1
0
absorbance [OD]
0
1
-1
поглощение [OE]
1
0
поглощение [OЕ]
1
поглощение [OE]
Реальные седиментограммы белков и их смесей
1
0
-1
7
6
6.5
6
7
1
0
-1
6.5
12
7
Реальные седиментограммы белков и их смесей
Белок в изолированном состоянии
в буфере + глицерин
0
Бычий сывороточный
альбумин
1
0
-1
-1
1
6
6.5
absorbance [OD]
поглощение [OE]
1
0
absorbance [OD]
1
-1
поглощение [OE]
Белок в изолированном состоянии
0
Бычий сывороточный альбумин
+ глицерин
-1
6
7
6.5
Смесь трех белков
-1
6
6.5
7
1
1
absorbance [OD]
карбонгидраза + бычий
сывороточный альбумин
0
absorbance [OD]
0
-1
-1
0
1
поглощение [OЕ]
1
Смесь двух белков
поглощение [OE]
7
0
Aпо-цитохром с + карбонгидраза
+ бычий сывороточный альбумин
-1
6
6.5
13
7
Численные решение уравнения Ламма для полидисперсных систем
(dC/dt)r = –1/r {d/dr [ω2r2s C – Dr (dc/dr)t]}t
1 d  2 2
 dC 
 dC   

     r s( M )C  D( M )r 
 
dt
r
dr
dr

r

t  t
 
Решение такого уравнения относится к числу некорректно поставленных задач.
Программа SEDFIT (P. Shuck)
Проблема устойчивости:
Добавление стабилизирующего (регуляризационного) члена
Наложение физически разумных ограничений на решение
Проблема однозначности (вычисление молекулярной массы):
s( M )  D( M )
M (1  0 ) M (1  0 )

RT
f
Фиксированные параметры: парциальный удельный объем, плотность растворителя
14
Подгоночные параметр: f
0 .7
0 .6
C(S)
0 .5
0 .4
Изолированный БСА
S a p p = 4 .3 4 S
0 .3
(М=66.4 кДа)
0 .2
0 .1
Д им ер
0
3
4
5
6
7
8
9
10
Коэ фф ициент седим ентации, ( S)
1
S 2 = 4 .1 8 S
C(S)
Смесь БСА (66.4 кДа) и
карбоангидразы (М= 30 кДа)
S 1 = 2 .6 7 S
0 .5
0
2
3
4
5
6
7
Коэ фф ициент седим ентации, (S )
1 .5
S 1 = 1 .1 9 S
S 2 = 2 .6 7 S
Смесь БСА (66.4 кДа),
S 3 = 4 .2 2 S
C(S)
1
карбоангидразы (М = 30 кДа)
0 .5
и апоцитохрома (М = 13.8 кДа)
0
1
2
3
4
5
Коэ фф ициент седим ентации, (S )
6
7
15
Седиментограмма смеси двух белков, состоящей из сывороточного альбумина (M=66.3
КДa) и овальбумина. (M=42.7). Отношение молекулярных масс двух белков равно 1.55
Программа SEDFIT позволяет разрешать белки в смеси,
отличающиеся по молекулярной массе не менее, чем в два раза.
16

M
iniscus
2
s=
(1/ 
)
dlnrm/di dt
B
oundaru
ln r mi d
r=0

M
iniscus
Boundaru
s=(1/ )2dlnrm/di dt
ln r mi d
r=0
S
rmdi
Radius(cm)
Time(sec)

S
rmdi
R
adius(cm
)
T
im
e(
sec)
30S M=0.9 106 Да
50S M=1.5 106 Да
17
Анализ очень гетерогенных систем
Для анализа таких систем используется переменная скорость вращения ротора.
Speed
Time at
s* (at 6.5 cm)
(rpm) each speed (s) (svedbergs)
------------------------------------------0-6000
15
~500.000
6.000
600
4220
9.000
600
1300
13.000
600
550
18.000
600
250
25.000
600
125
35.000
600
62
50.000
3600
31
50.000
3600
7.6
50.000
3600
4.4
50.000
3600
3.0
50.000
3600
2.3
Профиль констант седиментации для Limulus
polyphemus гемоцианинового раствора (2мг/мл).
Ротор фиксировался на скоростях 12, 18, 25, 35,
and 50 тысячах об/мин в течение ~20 мин,
исключая самую высокую скорость. (Stafford and
Braswell 2004).
18
Седиментационные коэффициенты биологических
макромолекул
Коэффициенты седиментации биологических макромолекул очень малы. За
единицу седиментации принята 1×10–13 сек. В честь Теодора Сведберга он
называется 1S .
Седиментационные коэффициенты биологических макромолекул измеряются
при разных условиях (температура, ионные и солевые условия) и приводятся к
так называемым стандартным условиям ( вода и 20 градусов Цельсия) .
s20, w  sexp
1    20, w exp
1   exp  20, w
где s20,w - седиментационный коэффициент приведенный к стандартным
условиямi , sexp - экспериментально измеренный, ηexp – вязкость
растворителя при экспериментально измеренной температуре, T(oC),
η20,w – вязкость воды при 20oC, ρ20,w – плотность воды при 20oC, ρexp –
плотность растворителя при данной температуре T(oC)
 – парциальный удельный объем молекулы..
19
Молекулярная масса из седиментационных и диффузионных данных
s ≡ u/ω2r = M (1–  ρ0)/NA f
D = RT/f
s/D = M(1 –  ρ0)/RT
M = s /D RT /(1 –  ρ0)
Первое уравнение Сведберга
(fD = fs) ?
Пример вычисления молекулярной массы:
A macromolecule with  = 0.74 cm3/g is sedimented in H2O at 20oC;
sedimentation coefficient so20w is 14.2 S, diffusion coefficient Do20w = 5.82 x 10-7
cm2/s. Calculate molecular mass.
0
13
7
s 20
RT
14
.
2

10
(
8
.
31

10
)293
W
M 0

 227кДа
7
20
D20W 1    0 5.82  10 (1  0.74  0.998)
Молекулярные массы M, константы седиментации, s20,w, и парциальные удельные объемы ΰ
биологических макромолекул, начиная от маленьких пептидов (пептид I, 2 kDa) и заканчивая
большими олигомерными белками (гемоцианин, 9 MDa).
Peptides and Proteins
1. Small synthetic peptide I
2. Small synthetic peptide II
3. Small synthetic peptide III
5. Lipase5
6. Insulin (dimer)
7.Cytochrome C
8. Ribonuclease A (bovine pancreas)
9. Lysozime (chicken egg white)
10. α-Lactalbumin (bovine milk)
11 . Myoglobin
12. Papain
12. α-Chymotrypsin
13. Chymotrypsinogen A (bovine
pancreas)
14. Elastase
15. Subtilizin BPN
16. Carboanhydrase
17. Riboflavin-binding protein
18. Carboxypeptidase
19. Pepsin
Molecular mass
(in Da)
Sedimentation
coefficient
(in Svedberg units)
Partial specific volume ΰ
(in cm3/g)
2049
2777
3505
6669
11466
12400
13.683
14305
14.180
17.836
23.350
25.000
25.767
0.37
0.45
0.52
1.14
1.60
1.80
1.78
1.91
1.92
1.98
2.42
2.40
2.58
0.706
0.715
0.720
0.7137
0.744
0707
0.696
0702
0.704
0.741
0.723
0.736
0.736
25.900
27.537
30.000
32.500
34.472
34.160
2.60
2.77
3.0
2.76
3.2
2.88
0.73
0.731
0.735
0.720
0.725
0.725
21
Peptides and Proteins
20. β-Lactoglobulin A, dimer (bovine milk)
21. β-lactoglobulin
22. Kinesin motor domain construct K366
23. Albumin ovum
24. Bovine serum albumin
25. Hemoglobin
26. Anthax protective antigen
26. Tropomiosin
27. Lactate dehydrogenase (dogfish)
28. β-Lactoglobulin A, octamer(bovine milk)
29. GPD, apo (bakers yeast)
30. Aldolase (Byron Mw)
31. Malate syntetase
32. Catalase (bovine liver)
33. Glutamate dehydrogenase (bovine liver)
34. Fibrinogen
35. Apoferritin
36. Apoferritin (Byron, horce spleen)
36. Urease
37. Miosin
38. Glutamate dehydrogenase
39. Hemoglobin
40. Hemocyanin
Molecular
mass
(in Da)
Sedimentation
coefficient
(in Svedberg units)
Partial specific
volume
(in cm3/g)
36.730
35.000
41.404
44.000
66.300
64.500
85.000
93.000
138.320
146.940
142.870
156.000
170.000
248.000
312.000
330.000
467.000
502.000
482.700
570.000
1,015.000
3,500.000
8,950.000
2.87
3.08
3.25
3.6
4.50
4.60
5.01
2.6
7.54
7.38
7.60
7.40
8.25
11.3
11.4
7.6
17.6
18.3
18.6
6.43
26.6
58.9
105.8
0.751
0.75
0.733
0.74
0.735
0.749
0.762
0.71
0.741
0.751
0.737
0.742
0.735
0.730
0.749
0.706
0.750
0.728
0.742(
0.728
0.73
0.747
0.728
22
Форма макромолекул из седиментационных данных
s ≡ u/ω2r = M (1–  ρ0)/NA f
f0 = 6π η0 (3M/4π NA)1/3
S20w 1/3 /(1 –  ρ0) = M 2/3 /6π η0 NA 2/3(3/4π)1/3
s ~ M2/3
3
10
0
 1/3
S20,W  

1   0
2/3
?
2
10
Fibrinogen
Myosin
10
Tropomiosin
Syntetic peptides
1
3
10
4
10
5
6
10
10
Molecular mass (Da)
7
10
8
10
23
Гомологичная серия гауссовых клубков:
белки в 6М гуанидингидрохлориде или в 8М мочевине
0.47
s0/(1 - ρ) = 0.286 n 0.47
24
ДНК: от жесткой палочки к гауссовому клубку
0
 1/3
S 20,W  


1  0
Клубок
2
10
Globular proteins
2/3
Палочка
DNA fragments
10
1
1
10
2
10
3
10
Molecular mass (kDa)
s=Ks M0.440 (5.4 кbp -170 кbp)
s=Ks M0.273 ( 200 kbp-5.4 кbp)
Сравнительное
гидродинамическое поведение
ряда глобулярных белков и
небольших фрагментов ДНК.
25
Рибосомные РНК и их фрагменты
100
0
S20,W
1 
 0
50
Фрагменты
Нативные большие
рибосомные РНК
0.47
10
Нативные малые
рибосомные РНК
5
10
2
10
10
3
4
10
Molecular mass (kDa)
26
Рибосомные частицы и РНК-белковые комплексы
Central domain
3
10
3' major domain
0
S 20,W
1 
 0
oso
Rib
l pa
ma
le s
r tic
5' domain
2/3
2
10
RN
P
p
com
3' minor domain
es
le x
“Beheaded” 30S
ribosomal subunit
Три домена 16S РНК
окрашены разным цветом
10
1
10
2
10
Molecular mass (kDa)
3
10
4
10
Сравнение гидродинамических характеристик РНКбелковых комплексов, моделирующих три основных
домена в 30S рибосомной частице, и 30S
рибосомной частицы с отрезанной “головой “.
27
“Безголовая” 30S
Седиментационное равновесие
.
(dC/dt)r = –1/r{d/dr[ω2r2sC – Dr(dc/dr)t]}t = 0
и следовательно
D(dC/dr)t – ω2rCs = 0
d ln(C)/d(r2/2) = 1/rC dC/dr ω2s/D = M(1 – ρ)ω2/RT
Тогда распределение молекул от мениска a до точки r будет
подчиняться экспоненциальному закону:
C(r) =C(a) exp{ω2M(1 – ΰρ0) (r2 – a2)/2RT},
а зависимость ln [C(r)] от r2/2 будет иметь вид:
28
Зависимость ln [C(r)] от r2/2 или x2 представлена на рисунке для
монодисперсного раствора (а) и полидисперсного раствора (b).
(a)
(b)
2
slope = M(1- 
 0 ) /RT
ln(c)
Ln(c)
2
slope = M(1- 
 0 ) /RT
x2
2
x
Средняя молекулярная масса основана усреднении числа или массы разных компонентов в
растворе. Так, если складывается число разных компонент ni, то такая молекулярная масса
называется среднечисленной, Mn, и определяется как
Mn = ∑Nimi/∑Ni== ∑nimi
Если складываются веса разных компонент mi, то такая масса называется
средневесоваой, Mw, и определяется как,
Mw = ∑Nim2i/∑Nimi=∑wimi
Пример для смеси двух молекул с массами 10,000 Da and 100,000 Дa
Mn= 55,000 Дa, тогда как Mw= 91 818 Дa
29

Парциальный удельный объем
Парциальный удельный объем молекулы есть изменение объема раствора
при внесении в него одной молекулы вещества
dV/dC = 
Он может быть >0, = 0 или <0 (Mg SO4)
На опыте он может быть определен путем серии измерений плотности
растворов, содержащих разную весовую долю молекул w
   0  w(1   0 )
где, ρ and ρ0 - плотности раствора и растворителя, соответственно.
1) Размерность парциального удельного объема см3/г.
2) Парциальный удельный объем молекулы не зависит от
объема, занимаемого ею в растворе. Парциальный удельный
30
объем белка мало меняется при денатурации.
Расчет величин парциальных удельных обьемов биологических макромолекул
Парциальные удельные
обьемы и молекулярные
массы аминокислот
М
ύ (см3/г)
Glycine
57
Alanine
71
Serine
87
Threonine 101
Valine
99
Leucine
113
Isoleucine 113
Proline
97
Methionine 131
Phenylalanine 147
Cystine
103
Tryptophan 186
Tyrosine
163
Histidine
137
Arginine
156
Lysine
128
Aspartic acid 115
Glutamic acid 129
Glutamine
128
Asparagine
115
0.64
0.74
0.63
0.70
0.86
0.90
0.90
0.76
0.75
0.77
0.61
0.74
0.71
0.67
0.70
0.82
0.60
0.66
0.67
0.60
Парциальные удельные
обьемы и молекулярные
массы сахаров
М
(см3/г)
Fructose
180
Fucose
164
Galactose
180
Glucose
180
Hexose
180
Sucrose (0.05 M) 342
Sucrose (0.15 M) 342
Sucrose (1 M) 342
Raffinose (25oC) 486
0.614
0.671
0.622
0.622
0.613
0.613
0.616
0.620
0.608
Средние величины
парциальных удельных обьемов
четырех типов биологических
макромолекул
(cm3/г)
Proteins
0.73 (0.70-0.75)
Carbohydrates 0.61 (0.59-0.65)
RNA
0.54 (0.47-0.55)
DNA
0.57 (0.55-0.59)
Рибосома!!
ΰ1.2-= ύ1м1/(м1+м2) + ΰ1м2/(м1+м2)
31
Парциальный удельный объем белка может быть
рассчитан из парциальных удельных объемов
составляющих его аминокислотных остатков по
аддитивной формуле (Cohn and Edsall, 1943)
ύ = ∑i ύ Wi / ∑i Wi
где Wi весовая доля, а ύi парциальный удельный
объем ith остатка.
Парциальный удельный объем белка в настоящее время
вычисляется по его химическому составу с помощью
программы SEDNTEP (Harpaz et al., 1994)
32
Седиментация в градиенте плотности
Равновесная седиментация
в градиенте плотности CsCl
(b)
(a)
(b)
50
-1
1.70
(Cs Cl)
(a)
CDNA(  gml )
Скоростная седиментация
в градиенте плотности сахарозы
1.70
CsCl
50
CsCl
1.70
xm
DNA
x
DNA
xb
xm
x
xb
Опыты Месселсона-Сталя по
доказательству
полуконсервативного механизма
редупликации ДНК
33
50
Опыты Месселсона-Сталя по механизму редупликации ДНК
Рассуждение
Эксперимент
(a)
Parent
(б )
F1
(в )
(г )
F2
F1
F2
(д )
Эксперимент
Клетки E. coli параллельно выращиваются на среде, содержащей легкий и
тяжелый изотопы азота 14N и 15 N. Затем клетки, выращенные на одной из
сред, переносятся на другие среды. Выделенная из клеток ДНК
анализируется методом равновесной седиментации в градиенте
плотности
34
F3