Особенности регуляции транскрипции у прокариот и эукариот
advertisement
Регуляция транскрипции у прокариот и эукариот А.В. Кульбачинский Лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов Институт молекулярной генетики РАН Структура ДНК пары оснований аденин-тимин гуанин-цитозин сахаро-фосфатная цепь Структура ДНК Т Каждая цепь ДНК имеет направление С А ДНК-белковые взаимодействия Узнавание пар нуклеотидов аминокислотами T-A Узнавание специфической ДНК регуляторными белками helix-turn-helix C-G Расположение генов в геноме Плазмида pBR322 Геном Pseudomonas aeruginosa • Гены располагаются в разных цепях ДНК • Между генами есть промежутки транскрипция ДНК РНК трансляция белок репликация Структура РНК Особенности транскрипции • Начало и окончание синтеза в специальных участках – промоторах и терминаторах • Инициация синтеза РНК без затравки • Использование рибонуклеозидтрифосфатов • Копирование одной из цепей ДНК (матричная цепь) • Направление синтеза от 5’- к 3’-концу РНК • Синтез всей молекулы РНК сразу нематричная ДНК 5’ 3’ 3’ РНК 5’ матричная ДНК РНК-полимераза 3’ 5’ Транскрипционный цикл Инициация Терминация Элонгация Регуляторные факторы действуют на всех стадиях транскрипции РНК-полимераза бактерий Холофермент 3 Кор-фермент 4 2 TTGACA -35 2 2 1 TATAAT TATAAT -10 Основные элементы промотора (-10 и -35) узнаются -субъединицей Плавление ДНК осуществляется за счет контактов -субъединицы с нематричной цепью ДНК в районе старта транскрипции Структурная модель промоторного комплекса -35 σ4 σ2 -10 σ1 Активный центр Главный канал σ3 ДНК РНКП T. aquaticus Murakami et al., 2002 • РНК-полимераза по форме напоминает клешню • ДНК связывается в главном канале • Активный центр – в глубине молекулы Трехмерная структура РНК-полимеразы •Регуляторные белки •Малые молекулы •Антибиотики Nudler, 2008 РНК-полимераза – сложная молекулярная машина, состоящая из многих структурно-функциональных элементов: - взаимодействие с ДНК и РНК - синтез РНК (присоединение нуклеотидов) - связывание регуляторных факторов Регуляция инициации транскрипции у прокариот Оперон - группа генов, транскрибируемых в составе одной РНК; регулируются совместно и обычно обладают общей функцией. Большинство бактерий содержат несколько -субъединиц, которые отвечают за узнавание разных типов промоторов и транскрипцию различных групп генов (регулон). Escherichia coli: 70 – гены “домашнего хозяйства” 32 – тепловой шок 38 – стрессовые условия 54 – азотный обмен Регуляция инициации транскрипции у прокариот Активация Репрессия оператор активатор репрессор индуктор индуктор оператор Белок-регулятор – связывается в промоторной области и влияет на инициацию транскрипции Оператор – участок связывания регуляторного белка Индуктор – молекула (клеточный метаболит - лактоза, галактоза), контролирующая связывание активаторов и репрессоров с операторами Активаторы обычно привлекают РНКП к промотору Репрессоры – мешают связыванию РНКП с промотором Примеры транскрипционных факторов Helix-Turn-Helix bZip Номеодомен Zn-finger Pazos et al., 2012 Регуляция инициации транскрипции у прокариот СAP – catabolite activator protein cAMP (синтезируется в отсутствие глюкозы) TGTGA ACACT Взаимодействие с -субъединицей РНКП TCACA AGTGT Активация катаболитных оперонов Регуляция инициации транскрипции у прокариот 1. Связывание белка-активатора 2. Удаление белка-репрессора СAP R Активация специфического оперона R R индуктор Регуляция элонгации транскрипции у прокариот Паузы и скорость транскрипции: - узнавание специфических сигналов в РНК и ДНК - действие регуляторных факторов • Воздействие на активный центр РНК-полимеразы • Закрывание-открывание главного канала РНК-полимеразы Регуляция элонгации транскрипции у прокариот Синтезируемая РНК способна образовывать различные вторичные структуры, что имеет важное регуляторное значение тРНК Механизмы терминации транскрипции -независимая терминация Паузы, Терминация -зависимая терминация Регуляция транскрипции у прокариот: аттенюация Промотор Аттенюатор Рибосома гены биосинтеза Trp РНКП Мало Trp: нет Trp-tRNA, пауза трансляции Много Trp: есть Trp-tRNA, нет паузы трансляции Регуляция транскрипции у прокариот: рибопереключатели (riboswitches) Vitreschak et al., 2002 В присутствии метаболита В отсутствие метаболита образуется структура терминатора транскрипции происходит синтез полноразмерной РНК Регуляция транскрипции у прокариот: рибозимы Рибозимы – молекулы РНК, обладающие каталитической активностью Консервативный элемент в 5’-концевой области гена glmS B. subtilis: В присутствии метаболита происходит активация рибозима и расщепление РНК Искусственный отбор функциональных молекул РНК и ДНК Const библиотека Const 3’ связывание амплификация 5’ NNNNNN разделение Аптамеры Сравнение транскрипции у прокариот и эукариот Про-Одна РНК-полимераза (5 субъединиц) Эу-Три РНК-полимеразы (10-14 субъединиц) -Уровень транскрипции -Уровень транскрипции определяется промотором определяется регуляторными (энхансеры) РНК-полимераза I –участками синтез рРНК РНК-полимераза II – синтез мРНК -Связь с трансляцией -Трансляция независима отсинтез транскрипции РНК-полимераза III – тРНК -Гены непрерывны -Гены состоят из экзонов и интронов, процессинг РНК -Каждая мРНК обычно кодирует несколько белков -Каждая мРНК обычно кодирует один белок -ДНК организована в хроматин Промоторы РНКП II эукариот Три типа промоторных элементов: – Основные промоторные элементы (-45 to +40) • Связывание главных транскрипционных факторов (GTF) – Проксимальные промоторные элементы (-1 kb to +200) • Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации или репрессии транскрипции (для больших групп генов) – Энхансеры/сайленсеры (десятки тыс.п.н.) • Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации /репрессии транскрипции (уникальны для данного промотора) Промоторы РНКП II эукариот энхансеры (сайленсеры) проксимальные элементы основной промотор Taatjes et al., 2004 Классы активаторов транскрипции: 1. Взаимодействуют с ДНК. 2. Передают активационный сигнал на РНК-полимеразу. 3. Изменяют структуру хроматина. Создание синтетических регуляторных систем Ввод - химические индукторы - регуляторные РНК - свет - механические воздействия Выход - окраска - флуоресценция - морфология клеток - жизнеспособность клеток Создание синтетических регуляторных систем Nandagopal and Elowitz, 2011 Создание синтетических регуляторных систем Системы с репрессорами / активаторами Weber et al., 2012 Создание синтетических регуляторных систем Изменение структуры / стабильности РНК Weber et al., 2012 Создание синтетических регуляторных систем Логические операции Silva-Rocha et al., 2008 Создание синтетических регуляторных систем Попытки создания стандартных функциональных элементов Shetty et al., 2008 Создание синтетических регуляторных систем Попытки создания стандартных функциональных элементов Shetty et al., 2008 Canton et al., 2008 Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы Larson et al., 2011 Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы • Свойства единичных молекул РНК-полимеразы различаются • Можно исследовать паузы, терминацию в реальном времени Larson et al., 2011 РНК-полимераза – молекулярная машина Pomerantz et al., 2005 Итак: 1. РНК-полимераза – основная мишень для регуляции экспрессии генов на стадии транскрипции различными факторами: - белками, - регуляторными РНК, - малыми молекулами, - антибиотиками 2. Использование существующих и создание новых регуляторных элементов позволяет контролировать активность РНК-полимеразы и уровень экспрессии генов в клетке и в бесклеточных системах 3. РНК-полимераза может быть использована в качестве молекулярной машины для перемещения объектов на наноуровне
