Молекулярный контроль биосинтеза бета

Молекулярный контроль
биосинтеза бета-лактамных
антибиотиков»
Некоторые этапы исследования и индустрии
бета-лактамных антибиотиков
1929
Открытие
пенициллина
1941-1943 Разработка технологий
ферментации P.chrysogenum
1945, 1955 Открытие
цефалоспорина
1987-1991
Первые работы по
генетической инженерии
P.chrysogenum, A.chrysogenum
1945 Нобелевская
премия по медицине Флеминг, Флори, Чейн
1964 Нобелевская
премия по химии,
Дороти Ходжкин
2001 Промышленное
производство 7-АДЦК с
помощью рекомбинантного
штамма P.chrysogenum
1960-1980-ые
Селекция
промышленных
штаммов –
продуцентов
2008
Расшифрован геном
P.chrysogenum
Индустрия бета-лактамных
антибиотиков сегодня
Крупнейший сектор мировой биотехнологической промышленности
Объем рынка ~US$ 10 млрд, ~ 50 % мирового рынка антибиотиков.
Основное производство – Европа, Китай, Корея, Индия..
Рынок пенициллинов – 3,5 млрд долларов, мировое производство – 35 000
тонн. Основные компании – производители: DSM (Нидерланды), BristolMyers-Squibb (США), Glaxo-Smith Kline (США), Biochimie/Hoechst (Германия),
North-China Pharma Works (Китай)
Рынок цефалоспоринов – 7 млрд долларов, мировое производство –
цефалоспорин С – 4300 тонн, 7-АЦК ~ 2200 тонн, 7-АДЦК ~ 2000 тонн.
Основные компании – производители: Antibioticos SpA (Италия, Испания),
Fujisawa (Япония), Bristol-Myers-Squibb (США), Glaxo-Wellcome
(Великобритания), Biochimie/Hoechst (Германия), Cheil Jedang (Корея)
Классификация бета-лактамных
антибиотиков
Группа
Парентеральные
Пероральные
Пенициллины
Чувствительные к
b-лактамазам
Ампициллин, Карбенициллин,
тикарциллин, мезлоциллин,
азлоциллин, пиперациллин,
Бензилпенициллин
Амоксициллин, ампициллин, Кариндациллин,
Феноксиметилпенициллин
Устойчивые к b-лактамазам
Метициллин, оксациллин, нафциллин Клоксациллин, диклоксациллин
Комбинированные препараты,
включающие ингибитор b-лактамаз
Тикарциллин/клавуланат,
ампициллин/сульбактам,
пиперациллин/тазобактам
Амоксициллин/клавуланат
Цефазолин, цефалотин, цефапирин
Цефалексин, цефрадин, цефадроксил
Цефалоспорины
Первого поколения
Второго поколения
Третьего поколения
Четвертого поколения
Карбапенемы
Монобактамы
Цефамандол, цефуроксим, цефоницид,
цефоранид,
Цефокситин, цефотетан, цефметазол
Цефтриаксон, цефотаксим,
цефтизоксим, Цефтазидим,
цефоперазон
Цефепим, Цефквином
Имипенем/циластатин
Азтреонам
Цефаклор, цефуроксим аксетил, цефиксима,
цефпрозил, цефподоксима, лоракарбеф
Нет
Нет
Нет
Нет
Этапы селекции промышленных штаммов
P.chrysogenum и A.chrysogenum
100-300 mg/ml
ATCC11550
М-8650
СВ-344
CK-101
2-5 mg/ml
CW-19, C-10
ЦБИ-104
P.chrysogenum
84-3-87
(SIPI, CN)
KFCC10785
CJCorp, KR
А3,2, А7, B, C
(Antibioticos)
А.chrysogenum
20-35 mg/ml
«До-геномные» представления о генетических и
биохимических изменениях у промышленных
штаммов P.chrysogenum
 У супепродуцентов тандемно амплифицирован кластер генов биосинтеза пенициллина pcbAB, pcbC and penDE, хотя нет линейной зависимости между числом копий и уровнем
продукции.
 У суперпродуцентов более развиты микротельца - компартменты биосинтеза penG
 У суперпродуцентов инактивирован путь катаболизма фенилуксусной кислоты - экзогенного
предшественника, боковой цепи бензилпепнициллина – точковая мутация в гене
микросомального цитохрома P450 (pahA )
Геном Penicillium chrysogenum
Транскриптомика P. chrysogenum
Поиск с помощью микрочипов дифференциально-транскрибируемых генов у двух
штаммов: Wis 54-1255 – умеренный, лабораторный продуцент, расшифрован геном
DS17690 - промышленный продуцент, в условиях продукции penG.
Функциональные категории
генов
1. Рост и метаболизм
Число генов с
экспрессией
DS17690>
Wis54-1255
Число генов с
экспрессией
DS17690
< Wis54-1255
106
75
6
1
13
4
4. Пероксисомальные
2
4
5. Метаболизм бета-лактамов
4
2
2. От предшественников к penG
3. Секреция penG
6. Метаболизм фенилуксусной
кислоты
6
7. Клеточная дифференцировка и
морфология
14
8. Другие
156
Всего
307
0
11
174
271
Протеомика P. chrysogenum
Сравнение цитозольных протеомов трех штаммов Penicillium chrysogenum
NRRL 1951 – дикий тип, Wis 54-1255 – умеренный, лабораторный продуцент,
расшифрован геном, AS-P-78 - промышленный продуцент
Идентифицированы 950 белков,
дифференциально представленных у трех
штаммов в условиях вегетативного роста
Jami MS, Barreiro C, García-Estrada C,
Martín JF. Proteome analysis of the penicillin
producer Penicillium chrysogenum:
Characterization of protein changes during the
industrial strain improvement. Mol Cell
Proteomics. 2010
Изменения метаболизма P.chrysogenum по
данным сравнительного протеомного анализа
Прогрессивно усилены у умеренного продуцента и промышленного штамма:
Биосинтез цистеина – аминокислота-предшественник пенициллина,
Биосинтез NADPH – необходим для синтеза пенициллина, 10 молей NADPH на 1 моль пенициллина
Уровень ферментов энергетического обмена – цикл трикарбоновых кислот, пентозофосфатный путь.
Ответ на окислительный стресс – адаптация к условиям ферментации.
Прогрессивно снижены по сравнению со штаммом дикого типа:
Факторы вирулентности, белки деградации клеточных стенок, ферменты деградации пенициллина,
Ферменты биосинтеза других вторичных метаболитов – терпеноидов, порфиринов, пигментов
Без изменения: Путь деградации фенилуксусной кислоты, альтернативные пути биосинтеза бета-лактамов –
мишени для дальнейшего манипулирования.
Итоги сравнительного
транскриптомного и протеомного
анализа P.chrysogenum
Penicillium chrysogenum – отличная модель для понимания глобальных
изменений метаболизма, генной экспрессии, сигнальных путей,
приводящих к усилению продукции целевого вторичного метаболита у
грибов
Усиление продукции пенициллина в ходе селекционных программ по
улучшению промышленных штаммов – следствие интенсивной
реорганизации метаболизма, основными факторами при этом являются
энергетическая нагрузка, редокс метаболизм и доступность
предшественников
Помимо цитозольных белков важно идентифицировать и
исследовать также мембранные транспортеры, обеспечивающие
импорт предшественников и экспорт целевых продуктов.
«Обратная генетика» P.chrysogenum
A.chrysogenum – нокдауны и нокауты
У A.chrysogenum и P.chrysogenum есть функционально-активная система РНКинтерференции – экспериментально показано на модели сайленсинга гетерологичного DsRed
Геном P.chrysogenum - есть ортологи Dicer и Argonaute
 На P. chrysogenum проведен нокдаун белка ku70 (фактор негомологичной
рекомбинации) – на порядок возросла эффективность гомологичной рекомбинации
В полученном штамме P2: KU70i проведен нокаут гена Pcdcl2 – гомолог
Dicer’ – нет сайленсинга при нормальной внешней морфологии штамма.
Индуцируемый нокдаун гетерологичного
гена DsRed на P.chrysogenum
Цефалоспорин С – основной
предшественник для получения
полусинтетических беталактамных антибиотиков
• Мировое производство (2008 год) –
• 6000 тонн цефС и его производных
• >50 наименований полусинтетических
цефалоспоринов I-IV поколений
• Мировой рынок – 7 млрд $
Acremonium chrysogenum –
продуцент цефалоспорина С
ATCC11550 – «дикий тип» , Бротцу, Сардиния,
1942 год
№26/8 –
суперпродуцент цефС,
Бартошевич, 1994 г.
Стратегии метаболической инженерии
для A.chrysogenum
Основаны на знании основного пути биосинтеза цефС
Оптимизация «узких мест» биосинтеза
Синтез предшественников, кофакторов
Блокирование побочных реакций и путей деградации
Улучшение физиологии и энергетического обмена
Транспорт предшественников и конечных продуктов
Инженерия ферментов – есть пространственные структуры
всех ферментов биосинтеза цефС
Инженерия новых метаболических путей и новых продуктов
Промышленные штаммы Acremonium chrysogenum уступают
в 2-3 раза по продуктивности промышленным штаммам
Penicillium chrysogenum, Нет амплификации кластера
генов биостнтеза цефС, следовательно, вместо долгой
селекции…..
….можно попробовать повысить продукцию цефС за
счет оверэкспрессии одного или нескольких генов…
Ген
Штамм
Эффекты
Год
Фирма
cefEF
ATCC11550
(«дикий тип»)
+15% CPC
1989
Elli Lilly
cefG
C10 (умеренный
продуцент)
+120%-210%CPC
1997
University of Leon
cefD1+cefD2
C10
+80% CPC
2004
University of Leon
cefT
C10
+120% CPC
2002
University of Leon
cefT
DS49834 (пром)
+70% ad7-accca
2008
DSM, University Groningen
cefG+pcbAB
+pcbC+cefEF
B,C (промышленные)
+X% CPC???
-8% DAC,DAOC
2004
Antibioticos
cefG
84-3-87 (пром)
+70% CPC
2010
Shanghai IPI
cefG+vgb
84-3-87 (пром)
+90% CPC
2010
Shanghai IPI
pacCD
Wis54
+300% PenG
2004
DSM
pacCD
DS49834/cefT?
(пром)
+X% ad7-accca????,
рост на сахарозе
2008
DSM
Экологически-чистые способы получения
7- аминодезацетоксицефалоспорановой к-ты с
помощью рекомбинантных штаммов
A.сhrysogenum и P.chrysogenum
DSM=>
<=Antibioticos
7-АДЦК
7-АЦК
~2000 т в год
~2200 т в год
Предшественник для
получения
полусинтетических
цефалоспоринов
орального
применения
Предшественник для
получения
большинства
полусинтетических
цефалоспоринов
150 $/кг
120 $/кг
Биосинтез пенициллинов
и цефалоспоринов
DAOC синтетаза (cefEF)
IPN эпимераза
(cefD1, cefD2, )
ACV синтетаза (acvA/pcbAB)
DAOC синтетаза (cefEF)
IPN синтаза (ipnA/pcbC)
DAC ацетилтрансфераза
(cefG)
IPN ацилтрансфераза (aatA/penDE)
Пенициллин G, V, DF, F, K
Транскрипционный контроль
биосинтеза бета-лактамов у грибов
Модель активации РасС
сигнал об
изменении
рН среды
цитоплазма
каскад усиления Раl белков
ядро
транспорт через
ядерную пору
автопротеолиз
автоактивация
ген расСу
(«открытая» конформация)
автопротеолиз
сигнальный
протелоиз
(процессированная
форма)
(«закрытая»
конформация)
транскрипция
трансляция
M. A. Penalva, 2002
Строение белков семейства РасС
сайт процессинга
NH2
сайт сигнальный протеазы
COOH
ДНК-связывающий домен
конформационный домен 1
Cys2His2 цинковый палец
(сайт узнавания GCCARG)
конформационный домен 2
активирующий домен
конформационный домен 3
11550
№26/8
коричневый,
желтый
кремовый
Рост при 280С (полная пластинчатая среда), дни
5-7
12-14
Размер колоний (полная пластинчатая среда), см
5-10
4-8
Наличие воздушного мицелия (полная пл. среда)
+
-
нормальное
редуцированное
мицелий,
конидии
артроспоры
200-250
9000+
Цвет колоний (полная пластинчатая среда)
Образование конидий на синтетической среде
Основная морфологическая форма при глубинном
культивировании на среде для ферментации, 72ч
Продукция цефалоспорина С, мкг/мл
11550, ферментация 72h
№26/8, ферментация 72h
мицелий
артроспоры
кодиниоспоры
10 мкм
прорастающий
мицелий
10 мкм
A
B
C
D
E
F
Сканирующая
электронная
микроскопия
клеток штамма
A.chrysogenum
АТСС11550
Сканирующая
электронная
микроскопия
клеток штамма
A.chrysogenum
№26.8
Подбор условий для эффективного
протопластирования штаммов A. chrysogenum
штамм
11500
26/8
++++
+++
++
+
-
фермент
время протопластирования
перед ДТТ
0 часов
1 часов
2 часа
3 часа
Zym 1 мг/ мл
Lyt 3 мг/ мл
++++
+++
+++
+++
++
Zym 2.75 мг/ мл
Lyt 3 мг/ мл
++++
+++
+++
+++
++
Zym 0.55 мг/ мл
Lyt 10 мг/ мл
++++
+++
+++
+++
++
Zym 2.75 мг/ мл
Lyt 10 мг/ мл
++++
+++
++
++
+
Zym 2.75 мг/ мл
Lyt 3 мг/ мл
++++
+++
+++
++
+
Zym 0.55 мг/ мл
Lyt 10 мг/ мл
++++
+++
+++
++
+
Zym 2.75 мг/ мл
Lyt 10 мг/ мл
++++
+++
+
-
-
типичный мицелий (для данного штамма A. chrysogenum)
начальная деградация мицелия, частичная сегментация и утончение гиф
сильная деградация мицелия, утонченные гифы
очень сильная деградация мицелия (на 85-90 %), практически нет оформленных гиф
полная деградация мицелия
использовано
в дальнейшей работе
Агробактериальная трансформация
 Растения
 Клетки млекопитающих
 Грибы (Saccharomyces cerevisiae, Magnaporthe grisea,
Fusarium oxysporum, Aspergillus awamori,
Calonectria morganii, Acremonium chrysogenum …)
10 мкм
A.tumefaciens AGL0
c кассетой для переноса pZEM5
Прорастающий мицелий
A.chrysogenum №26/8
Экспрессионные вектора для
A.chrysogenum
Схема эксперимента по
агробактериальной трансформации
A.chrysogenum
Создание векторной системы
для переноса в
Agrobacterium tumefaciens
Трансформация полученных
конструкций в
Agrobacterium tumefaciens
Выбор морфологической
формы A.chrysogenum для
АТМТ
Получение
конидий для
A.сhrysogenum
АТСС11550
Подготовка
препаратов
мицелия
Для A.chrysogenum
№ 26/8
Инкубация A.chrysogenum с Agrobacterium tumefaciens
Глубинное ко-культивирование
Культивирование на агаризованной
среде с фильтрами
Инактивация
Agrobacterium tumefaciens
Отбор трансформантов,
скрининг
Частоты агробактериальной
трансформации A.chrysogenum
ZeocinTM
G418
Штамм A.chrysogenum
Метод 1
11550
№26/8
11550
№26/8
2-5 * 102
1-2 * 101
6-8 * 101
-
1-3 * 103
5-7 * 101
3-5 * 102
-
Перенос колоний на
фильтрах
Метод 2
Глубинное культивирование
Анализ трансформантов
Стратегии создания рекомбинантных
штаммов A.chrysogenum c
улучшенными характеристиками
• Введение дополнительных копий биосинтетических
генов
• Усиление транспорта цефС из клетки
• Оптимизация транскрипции генов биосинтеза
• Усиление импорта предшественников биосинтеза
цефС
Транспорт цефС в A.chrysogenum
«ранние» гены
cefT
«поздние»
гены
Модель
пространственной
организации cefM и
сefT
cefT
Вектора экспрессии cefT
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
S
Маннопротеины
40%
GPI якоря
S
1-3 глюкан Трансмембранные
белки
50%
1-6 глюкан
8%
Хитин
2%
Белки КС A.chrysogenum
ATCC11550
24 ч 48 ч 120 ч
24 ч 48 ч 120 ч
#26/8
ATCC11550
#26/8
24 ч 48 ч 120 ч
24 ч 48 ч 120 ч
24 ч
SEP- белки
48 ч 120 ч
24 ч 48 ч 120 ч
GPI-белки
Структурные изменения КС у штамма A.chrysogenum суперпродуцента цефС связаны с резким снижением количества
ферментов, участвующих в поддержании ее структуры, отсутствием
фракции белков, ковалентно- связанных с полисахаридным матриксом КС.
Морфология и структура КС штаммов
A.chrysogenum
Чувствительность препаратов КС к действию гидролаз и детергентов.
Электронная микроскопия клеточных стенок
штамма АТСС11150 A. chrysogenum (А, Б, В)
и клеточных стенок штамма 26/8 A.
chrysogenum (Г, Д, Е, Ж, З). – на разных
стадиях роста.
Различия в морфологии и структуре
клеточных стенок штаммов ATCC11550 и
№26/8. затрагивают молекулярную
организацию КС и
в значительной степени зависят от условий
культивирования штаммов
Неорганические полифосфаты - источник
энергии при синтезе цефС
Падение уровня АТФ в штамме 26\8 в
условиях индукции синтеза цефС
Снижение содержания высокомолекулярных
фракций полиР2, полиР3 и полиР5 и
возрастание содержания
низкомолекулярной полиР1 при синтезе
цефС у A.chrysogenum.
Дифференциальная экспрессия
Н+АТРазы плазмалеммы у разных
штаммов A.chrysogenum
60
ATPase nmol/mkg/min
70,00
50
40
30
20
60,00
58,22
58,81
50,79
50,00
46,67
40,00
№26/8
11550
30,00
20,00
10,00
1,43
10
1,43
1,30
2,35
0,00
24
0
48
72
96
120
144
Динамика изменения активности Н+-АТФазы в
штаммах 26/8 (1,2) и АТСС 11550 (3,4) при
выращивании на крахмале (1,3) и на глюкозе (2,4)
48
72
96
часы
Различия в уровнях активности Н+АТФазы в штамме 26/8 и АТСС 11550
Штамм A.chrysogenum №ЦБИ-104 –
суперпродуцент цефС
Графическая модель биосинтеза цефалоспорина С в
аппарате вместимостью 10 л
углеводы, г/л
биомасса,%об.
рНх10
рО2
35
цефалоспорин С,мг/мл
100
120
30
100
25
70
80
60
50
60
40
40
30
Выход цефС, г/л
углеводы,биомасса, рН,а,
80
РО2, цефалоспорин С С
90
20
15
10
5
20
20
10
0
0
0ч
18 ч
36 ч
54 ч
72 ч
время
90 ч
108 ч
0
115 ч
№26/8
ЦБИ-104
DSM
Штаммы A.chrysogenum
CJ Corp