Системный скрининг наркотических и лекарственных веществ с

Системный скрининг
наркотических и
лекарственных веществ с
использованием твердофазной
экстракции
Катаев С.С., Крохин И.П. Дворская О.Н.
Москва, 2014
Методы анализа в СХО и ХТЛ
УФ-спектрометрия
ТСХ
ВЭЖХ-УФ
ГХ-МС
Общая схема скрининга
Ì î ÷à
Êðî âü
Î ðãàí û
Âî ëî ñû
ÒÔÝ
ï àòðî í û Evidex
SampliQ
Ýëþ àò 1
Ýëþ àò 2
Äåðèâàòèçàöèÿ
Äåðèâàòèçàöèÿ
Модельные соединения
Кислотного
характера
Слабоосновного
характера
Основного
характера
Амфотерные
Салициловая
кислота
Изониазид
Амфетамин
Морфин
Кеторолак
Диазепам
Амитриптилин
Бензоилэкгонин
Кокаин
Экгонин
Индометацин
Фенобарбитал
Эналаприл
Факторный анализ
Регулируемые факторы при проведении ТФЭ и уровни их варьирования
Кодированные уровни
Фактор
-1
0
1
4,8
5,4
6,0
объем буфера промывки, мл
1
2
3
концентрация уксусн.к-ты, моль/л
-
0,01
0,1
концентрация этанола, %
0
10
20
смесь Гексан :Этилацетат
2:1
3:1
4:1
концентрация метанола, %
-
50
100
рН 1/15М фосфатный буфер, pH
смесь ХМ:ИПС:NH3
2 :1 :0,1
3 :1 :0,1 4 :1 :0,1
Амфетамин
CH3
NH2
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
7 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=30,82123
ЗП: Var8
Var5(Q)
-2,72056
(6)Var6(L)
рКа = 9,94
LogP: 1,81
-2,58138
(5)Var5(L)
1,948355
Var1(Q)
1,169753
(7)Var7(L)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
ЗП: Var8
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=30,82123
110
1,029503
(1)Var1(L)
,768957
Var7(Q)
,7177218
Var4(Q)
108
-,620367
(3)Var3(L)
106
,4779833
(2)Var2(L)
104
,4382805
(4)Var4(L)
102
Var8
Var2(Q)
100
Var6(Q)
98
Var3(Q)
96
94
-1,
0,
Var6
1,
,3798498
-,356009
-,291411
,0156048
p=,05
Оценка эффекта (абсолютное значение)
Амитриптилин
N
CH3
H3C
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
7 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=29,84172
ЗП: Var8
Var5(Q)
-2,20844
Var1(Q)
2,156989
(4)Var4(L)
рКа = 9,24
LogP: 4,92
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
2,115945
(6)Var6(L)
-1,65885
Var3(Q)
-1,53998
Var7(Q)
ЗП: Var8
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
,9364485
(7)Var7(L)
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=29,84172
-,709964
Var8
82
(3)Var3(L)
80
Var2(Q)
78
Var4(Q)
76
Var6(Q)
74
(1)Var1(L)
,1548484
72
(5)Var5(L)
-,148911
(2)Var2(L)
70
-,523131
,438756
,3500972
-,241849
-,07001
p=,05
68
-1,
0,
Var4
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
Морфин
CH3
N
H
O
HO
OH
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
7 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=1145,509
ЗП: Var8
(7)Var7(L)
рКа = 8,26
LogP: 0,43
-3,33519
Var6(Q)
1,24707
Var3(Q)
,95167
(4)Var4(L)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
,9100117
(3)Var3(L)
ЗП: Var8
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
-,897425
(6)Var6(L)
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=1145,509
120
-,774028
Var4(Q)
100
80
Var2(Q)
-,580347
(1)Var1(L)
,5392129
Var7(Q)
Var5(Q)
60
Var8
40
20
-,733859
-,340931
-,287321
(2)Var2(L)
-,108555
Var1(Q)
-,101447
(5)Var5(L)
-,083319
p=,05
0
-1,
0,
Var7
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
NH2
Изониазид
NH
O
N
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
7 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=,5851853
ЗП: Var8
2Lна4L
-3,48303
Var3(Q)
рКа = 3,79
LogP: -0,89
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
ЗП: Var8
2,39506
Var2(Q)
-1,26204
Var1(Q)
-1,11483
Var7(Q)
1,08841
(3)Var3(L)
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=,719633
1,4
Var4(Q)
1,2
(6)Var6(L)
1,0
(7)Var7(L)
,9499432
-,841643
,6901371
,5843752
0,8
(1)Var1(L)
-,37584
0,4
(4)Var4(L)
-,355692
0,2
Var6(Q)
-,124737
0,0
(2)Var2(L)
-,095468
0,6
Var8
-0,2
p=,05
-0,4
-1,
0,
Var3
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
H3C
O
Диазепам
N
N
Cl
Карта Парето стандартизов анных эффектов ; Перемен.: Var8
7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=288,2843
ЗП: Var8
(3)Var3(L)
LogP: 2,96
рКа = 3,40
ЗП: Var8
1,130087
(6)Var6(L)
-1,11861
Var1(Q)
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
-2,98271
-1,60091
(7)Var7(L)
Var6(Q)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
ЗП: Var8
-3,91343
(4)Var4(L)
Var4(Q)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
-11,0604
Var3(Q)
-1,0773
,9862734
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=288,2843
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=288,2843
(2)Var2(L)
75
120
70
100
65
60
80
55
50
Var8
Var8
40
-,793536
Var7(Q)
,7590853
(1)Var1(L)
45
40
20
Var2(Q)
(5)Var5(L)
60
-,841455
Var5(Q)
-,478768
,2747657
-,188796
35
0
30
p=,05
25
-20
-1,
0,
Var3
1,
-1,
0,
Var4
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
O
Кокаин
O
CH3
O
N
CH3
O
Карта Парето стандартизов анных эффектов ; Перемен.: Var8
7 3-х у ров нев ые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=70,73445
ЗП: Var8
(7)Var7(L)
-2,57267
(6)Var6(L)
LogP: 3,08
рКа = 8,97
-2,26632
6Lна7L
-1,84966
(4)Var4(L)
1,603629
Var6(Q)
-1,34233
(2)Var2(L)
-,887536
Var5(Q)
-,825949
(3)Var3(L)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
-,752386
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
ЗП: Var8
Var4(Q)
ЗП: Var8
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=75,65221
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=75,65221
85
Var3(Q)
80
Var7(Q)
80
75
Var2(Q)
75
-,550931
,3085229
,28126
,1471927
70
(5)Var5(L)
70
Var8
Var8
65
Var1(Q)
65
,0539816
,0110887
60
60
p=,05
55
55
-1,
0,
Var6
1,
-1,
0,
Var7
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
Бензоилэкгонин
O
OH
O
N
CH3
O
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
7 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=20,03085
ЗП: Var8
(3)Var3(L)
LogP: 2,72
10,32574
Var3(Q)
рКа1 =10,83
рКа2 = 3,35
5,147634
Var1(Q)
4,546913
1Lна7L
3,270436
(1)Var1(L)
-2,55396
1Lна3L
Var6(Q)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
(6)Var6(L)
ЗП: Var8
ЗП: Var8
-2,37778
-1,41524
-1,35724
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
План: 7 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=26,63954
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=26,63954
(2)Var2(L)
-1,18438
24
30
22
25
(7)Var7(L)
,734295
20
(4)Var4(L)
-,592696
15
Var2(Q)
,5445859
10
Var4(Q)
,4920235
5
Var7(Q)
20
18
16
Var8
Var8
14
12
,1409381
0
10
p=,05
-5
8
-1,
0,
Var1
1,
-1,
0,
Var3
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
Фенобарбитал
O
H3C
HN
O
N
H
O
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
5 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=220,5456
ЗП: Var8
Var1(Q)
LogP: 1,67
рКа1 = 7,63
рКа2 = 12,34
4,802759
(4)Var4(L)
-4,1881
1Lна3L
-2,3569
(3)Var3(L)
1,800597
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
ЗП: Var8
(1)Var1(L)
План: 5 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=240,2433
-1,65593
Var5(Q)
70
(2)Var2(L)
60
Var3(Q)
50
(5)Var5(L)
40
Var4(Q)
-,079063
Var2(Q)
-,04726
Var8
80
30
1,401403
-1,31259
,9298531
-,330302
p=,05
20
-1,
0,
Var4
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
O
Индометацин
OH
O
H3C
CH3
N
O
Cl
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
5 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=23,76171
ЗП: Var8
рКа = 4,18
LogP: 3,10
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
(3)Var3(L)
3,433756
1Lна3L
3,191309
1Lна5L
ЗП: Var8
План: 5 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=31,11419
-2,75613
Var5(Q)
1,865069
82
Var3(Q)
80
78
(4)Var4(L)
76
(2)Var2(L)
74
(5)Var5(L)
72
1,715517
1,610336
1,044784
-,917042
Var8
(1)Var1(L)
-,797559
70
Var1(Q)
68
66
Var4(Q)
64
Var2(Q)
62
-1,
0,
Var3
1,
-,740826
,3216552
-,117168
p=,05
Оценка эффекта (абсолютное значение)
Кеторолак
O
OH
N
O
Карта Парето стандартизованных эффектов; Перемен.: Var8
5 3-х уровневые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=99,13155
ЗП: Var8
(3)Var3(L)
LogP: 2,08
рКа = 4,47
6,682917
Var1(Q)
4,084743
Var3(Q)
3,501341
(1)Var1(L)
-2,17413
3Lна4L
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
(4)Var4(L)
ЗП: Var8
ЗП: Var8
2,12349
-1,60363
План: 5 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
План: 5 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=105,9526
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=105,9526
Var5(Q)
50
40
1,34267
45
35
(5)Var5(L)
40
-,862872
35
30
30
25
Var8
Var8
(2)Var2(L)
-,308065
Var2(Q)
,2273983
25
20
15
20
15
10
Var4(Q)
-,158021
5
10
0
p=,05
-5
5
-1,
0,
Var1
1,
-1,
0,
Var3
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
Салициловая кислота
OH
O
OH
Карта Парето стандартизов анных эффектов ; Перемен.: Var8
5 3-х у ров нев ые ф, 1 Блоки; Остаточн.SS=1,430394
ЗП: Var8
рКа1 = 13,70
рКа2 = 3,01
LogP: 2,06
Var3(Q)
-2,22027
(2)Var2(L)
-1,97929
Var2(Q)
-1,31485
(3)Var3(L)
Диаграмма маргинальных средних и дов ер. инт-лы (95,%)
1,170821
ЗП: Var8
План: 5 3-х уров нев ые ф, 1 Блоки , 62 оп.
Var1(Q)
Замечание: Ст. Ош. средних в ычислены по SS ошибке=1,430394
1,011959
3,0
Var4(Q)
,6412385
2,5
Var5(Q)
2,0
-,57947
Var8
1,5
(1)Var1(L)
-,210404
1,0
(5)Var5(L)
,1976527
0,5
(4)Var4(L)
-,082154
0,0
p=,05
-0,5
-1,
0,
Var3
1,
Оценка эффекта (абсолютное значение)
CH3
Эналаприл
O
O
CH3
NH
O
N
O
OH
LogP: 2,43
рКа1 = 5,42
рКа2 = 3,17
Экгонин
HO
O
N
LogP: - 0,60
рКа1 = 11,43
рКа2 = 3,60
CH3
OH
Оптимизированная методика ТФЭ
Êî í äèöèî í èðî âàí èå
2 ì ë ýòàí î ëà
2 ì ë áóô åðà ðÍ 4,8
Çàãðóçêà î áðàçöà
ï ðåäâàðèòåëüí î
ðàçáàâëåí í î ãî
áóô åðî ì ðÍ 4,8 è
î òöåí òðèô óãèðî âàí í î ãî
Ï ðî ì û âêà
1 ì ë áóô åðà ðÍ 4,8
1 ì ë 10% ð-ðà ýòàí î ëà
Ýëþ èðî âàí èå 1
2 õ 2 ì ë ñì åñè
ãåêñàí -ýòèëàöåòàò (2 : 1)
Ýëþ èðî âàí èå 2
2 õ 2 ì ë ñì åñè
äèõëî ðì åòàí -èçî ï ðî ï àí î ë25% àì ì èàê (2 : 1 : 0,1)
Ì åòèëèðî âàí èå
Àöåòèëèðî âàí èå
Эффективность экстракции, % (n=6)
Соединение
0,1 М уксусн.к-та
Элюат 1 Элюат 2
Салициловая кислота
без уксусн.к-ты
Элюат 1
0,9 (90)
0,8 (91)
Кеторолак
46 (8)
27 (13)
Индометацин
97 (5)
101 (5)
Фенобарбитал
66 (9)
88 (8)
Диазепам
18 (40)
49 (20)
Элюат 2
61 (10)
Амфетамин
86 (4)
93 (5)
Изониазид
0,45 (12)
0,69 (33)
Амитриптилин
54 (4)
53 (14)
Кокаин
76 (6)
79 (6)
Бензоилэкгонин
60 (5)
48 (9)
Экгонин
н.д.
н.д.
н.д.
н.д.
Морфин
9 (12)
24 (19)
Эналаприл
94 (9)
78 (10)
Скрининг мочи
К 0,5 мл мочи прибавляют 250 мкл 1/15М
фосфатного буфера pH 6 и 25 мкл
-глюкуронидазы, флакон укупоривают и
выдерживают при 45 оС в течение 2 часов
Кондиционирование
патрона
2 мл этанола
2 мл буфера рН 4,8
Загрузка образца
(энзимный гидролиз и
центрифугированние)
Промывка
1 мл буфера рН 4,8
1 мл 10% р-ра этанола
сушка патрона 20 мин
Элюирование 1
2 х 2 мл смеси
гексан-этилацетат (2 : 1)
Элюирование 2
2 х 2 мл смеси
дихлорметан-изопропанол25% аммиак (2 : 1 : 0,1)
Вещества кислотного,
слабоосновного и
нейтрального характера
Вещества основного и
амфотерного характера
Дериватизация
Метилирование
Метилирование
Ацетилирование
Ацетилирование+
этерификация
BSTFA
180 мкл
ДСМО
20 мкл ТМАГ
30 мкл СН3I
500 мкл
ацетона
40 мкл СН3I
60 гр. С
60 мин
40 мкл
пиридина
60 мкл УА
Стадия 2:
20 мкл
ПФПола
60 мкл УА
60 гр. С
30 мин
100 мкл
BSTFA
80 гр. С
60 мин
Элюат 1
(режим СИМ)
Маркеры СК,
ТГК к-та
Элюат 1
(режим TIC)
Элюат 2
Элюат 2
+
БЭ,
Метболиты
золпидема
Элюат 1
Элюат 2
Спасибо
за
внимание!