Е. В. Саватеева-Попова Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт- Петербург

реклама
Новая глава в нейробиологии:
некодирующие РНК
и эпигенетические механизмы
формирования памяти
Е. В. Саватеева-Попова
Институт физиологии им. И.
П. Павлова РАН, СанктПетербург
Pavlov Institute of Physiology,
St. Petersburg
Pavlov’s lab in Koltushi and monument to Gregor Mendel
Martin Heisenberg
Наука должна быть
инфекционной
Если что-то имеет смысл,
то только в свете
поведения


Недавние открытия в нейробиологии и
генетике – не только переворот в
традиционных представлениях, но и слияние
казалось бы разных наук
При попытке понять механизмы
синаптической пластичности - long term
potentiation (LTP) и long term depression (LTD)
лежащих в основе обучения и памяти, нам
приходится обращаться к большому спектру
чисто генетических проблем:
 Нейрон-специфичная транскрипция,
 Эпигенетическое ремоделирование хроматина,
 транспорт mRNAs из сомы для локальной
трансляции в удаленных сайтах аксонов и
дендритов


Long-term potentiation (LTP) –
основополагающая экспериментальная
модель формирования разных по
продолжительности стадий памяти
Выделяют по крайней мере три
последовательных, но различных по
механизмам фазы, для развития которых
используются разные компартменты нервной
клетки и разные уровни регуляции
генетических процессов
Molecular mechanisms that contribute to the regulation of the
three sequential stages of (LTP/LTD)
I. Early
Phase
III. Late
Phase
II. Intermediate
Phase
~2 hours
~6 hours
molecular
mechanisms
protein
modification
(eg. phosphorylation)
mRNA editing,
stability, translation
and splicing
cellular
requirements
translation
independend
translation dependent/
transcriptoin independend
duration
~10 hours+
transcriptional
regulation and
epigenetic modification
transcription
dependent



Эпигенетические изменения –
ацетилирование хроматина и метилирование
ДНК - необходимы для регуляции сложных
сетей экспрессии генов при формировании и
сохранении памяти
Специфически генетическая задача изучения
организации хроматина и его
ремоделирования –привела к постановке
нового популярного вопроса “How many
remodelers does it take to make a brain?”
(Brown et al., 2007)
Возникла проблема иерархической
организации генетического материала в ядре
нервной клетки
Как положение гена в
динамичной трехуровневой
иерархической системе 1.
2.
3.
последовательность ДНК –
конформация хроматина –
пространственная организация ядра –
определяют его активность и
сказываются на когнитивных
способностях животных и человека?
Какую роль выполняет актин, если он
сопрягает все иерархические уровни
организации генома?
Chromosome
structure
RNP
assembly
Actin
Transcription
Актин в ядре:


Transport

Nucleus
Cytoplasm

Cytosceleton
компонент комплексов
ремоделирования хроматина
выстилает ядерную
мембрану, определяя точки
прикрепления хромосом и
образование ядерных пор
входит в состав RNP
комплексов
взаимодействует со всеми
тремя РНК полимеразами
эукариот
Cascade of actin remodeling
AMPAreceptor
Glutamate
KYNA
Feed-back regulation
of receptor functioning
Rho
NMDAreceptor
ROCK
Rac
neureguli
n
LIMK1
PAK1
Dia
Stress
Heat
Shock
PIP
F actin
agnostic
cofilin
Ca2+
А
А
D
Т
P
P
profilin
nucleators
Barbed
(+) end
Chromatin
remodeling
(SW12/SNF2)
Induction of
recombination
А
Т
P
А
D
P
А
D
P
G actin
Activation of
transcription
(SRF-factor)
А
D
P
А
D
P
Pointed
(-) end
Remodeling of dendritic
spines
(synaptic plasticity,
learning/memory)
Synthesis of
neurotrophic
factors
A Novel Model for an Older Remodeler:
The BAF Swap in Neurogenesis
0
Aigner et al., Neuron 55, 2007
Комплекс ремоделирования хроматина BAF,
также называемый SWI/SNF, состоит из
каталитической субъединицы (Brg/Brm) ,
дополнительных субъединиц BAF250,
BAF170, BAF155, BAF60, BAF57, BAF47и
актина
Специфичные для нервных клетокпредшественников и стволовых клеток при
их пролиферации комплексы npBAF
содержат две дополнительные
субъединицы, BAF45a и BAF53a (показаны
красным)
Регуляция нейрогенеза
Во время дифференцировки нейронов они
заменяются на гомологичные нейронспецифические белки BAF45b/c, и BAF53b
(зеленым), формируя постмитотический
нейрон-специфичный комплекс nBAF.
Combinatorial assembly of neurons:
from chromatin to Dendrites
de la Torre-Ubieta and Bonni Trends in Cell Biology, 2008,18, 48-51
Нейрональная активность –
ток ионов Са через потенциалзависимые каналы или NMDA
рецепторы –
вызывает ремоделирование
хроматина и регулирует
морфогенез дендритов
BMP gradients steer nerve growth cones
by a balancing act of LIM kinase and Slingshot
phosphatase on ADF/cofilin
Wen et al., The Journal of Cell Biology, Vol. 178, No. 1, July 2, 2007 107–119
Для конуса роста 4–8-часнейронов
BMP7 действует как аттрактант,
активируя LIMK1-каскад.
Для конуса роста 12-час нейронов,
BMP7 действует как репеллент,
используя
Ca2+ зависимый сигнальный путь,
инициируемый TRP каналами.
Кофилин – общая мишень обоих
путей при локальной регуляции
актинового цитоскелета
What proteins are the interacting partners
of LIMK1?
BMPR2
YWHAZ

CFL1



PXN
DSTN

LIMK1


PARK2
LATS1


PAK4
LOXL2
BMPR2 Bone morphogenetic
protein receptor, type II
(serine/threonine kinase)
CFL1 Cofilin 1 (non-muscle)
DSTN Destrin (actin
depolymerizing factor)
LATS1 LATS, large tumor
suppressor, homolog 1
(Drosophila)
LOXL2 Lysyl oxidase-like 2
Drosophila Dmloxl-2)
PAK4 P21 protein (Cdc42/Rac)activated kinase 4
PARK2 Parkinson disease
(autosomal recessive, juvenile)
2, parkin, Drosophila
PXN Paxillin
YWHAZ Tyrosine 3monooxygenase/tryptophan 5monooxygenase activation
protein, zeta polypeptide
Drosophila gene leonardo,
affects olfactory learning)
LIMK1 isoforms in D.melanоgaster
Isoform С
Isoform D
LIM1, LIM2 и PDZ domains inhibit the LIMK1 activity in vivo
(Birkenfeld, Betz, Roth, 2001; Edvards, Gill, 1999)
LIM
PDZ
Required for protein-protein
interactions and are often located
in the same molecule with PDZ
Interaction modules, key players in
signal trunsduction, recognize the
proteins of the receptor families (NMDA
NR2/D, AMPA, GluR2, mGluR5, beta-AR,
melatonin) and ion channels (Shaker K+,
voltage-gated Na+, N-type Ca2+)
A new paradigm for
developmental biology
Mattick JS Journal of Experimental Biology 210, 1526-1547 (2007)

В последние 3 года наблюдается взрыв исследований в
направлении, противоречащем устоявшейся молекулярногенетической парадигме:

обнаружено, что лишь 1.2% генов эукариот кодируют белки,
остальная же часть генома генерирует различные классы
некодирующих, нкРНК. Согласно с «Новой Парадигмой» (Mattick,
2007), уже известные классы нкРНК и те, что еще предстоит
обнаружить, в норме и патологии обеспечивают регуляцию
экспрессии генов, кодирующих белки

Взаимодействие двух «миров» – РНК и белков – основа гибкой
взаимосвязи генов с окружающей средой, что необходимо для
функционирования нервной системы (Mercer et al., 2008)

Многие иРНК, в частности, кодирующие субъединицы
рецепторов NMDA, GluR локализуются в дендритах, и их
зависимая от нкРНК локальная трансляция осуществляется в
ответ на нейрональную активность, создавая основу для
синаптической пластичности при формировании средне- и
долгосрочной памяти.
The Genetic Signatures of
Noncoding RNAs
Mattick JS, PLoS Genet. 2009 5(4)
The Eukaryotic Genome as an RNA Machine
Amaral et al., SCIENCE VOL 319 28 MARCH 2008
Schematic showing known and putative
extracellular signaling pathways mRNA (blue)
and ncRNA (red) are (a) transcribed in the
donor cell
Упаковка РНК в пузырьки и их транспорт
(b) для выведения в межклеточное
пространство;. (d) Пузырьки сливаются с
клеткой-мишенью, высвобождая свое
содержимое; (e) РНК может либо
транслироваться в клетке-доноре или
выполнить регуляторную функцию для
(f) эпигенетических модификаций
хроматина; I(g)сигналы внеклеточных
РНК (siRNAs или miRNAs могут
передаваться через плазматическую
мембрану посредством специфических
рецепторов, таких как Sid-1; (h) в клеткереципиенте это может приводить к
ингибированию трансляции или
деградации мРНК
ncRNA
Описание
miRNA
MicroRNAs (miRNAs) маленькие (21–23 nt) одно-цепочечные РНК,
регулирующие экспрессию генов за счет частичной
комплементрности пар оснований со специфическими мРНК . Это
ингибирует трансляцию и в некоторых случаях приводит к
деградации мРНК
siRNA
Small interfering or silencing RNAs (siRNAs) маленькие двуцепочечные РНК tкоторые посредством РНК-интерференции
(RNAi) осуществляют down-регуляцию специфического гена,
содержащего комплементарную последовательность. Это
приводит к эпигенетическим изменениям экспрессии гена-мишени
snoRNA
Small nucleolar RNAs (snoRNAs) маленькие (w70–240 nt) РНК
управляющие метилированием и псевдоуридилированием рРНК и
других РНК. SnoRNAs содержат фнтисенс-последовательность (10–
20), комплементарную последовательности мишени рядом с
основанием для модификации
long
ncRNAs
Long ncRNAs длинее, чем 200 nt с малой возможностью
кодировать белки или полным ее отсутствием. Регулируют
экспрессию генов за счет разных механизмов
piRNAs
Piwi-interacting RNA (piRNA) маленькие (27–30 nt) РНК, половых
клеток дрозофилы и позвоночных . Осуществляют модификацию
хроматина и подавление экспрессии транспозонов.
RNAi pathways in Drosophila
(a) siRNA-путь антивирусной защиты.
Dicer-2 разрезает dsRNA до siRNAs,
которые включаются в состав
Argonaute-содержащего RISC
комплекса, направляющего РНК на
деградацию
RISC - RNA-induced silencing complex
Ago - белок Argonaute, каталитическое
ядро RISC-комплекса, связывается с
короткими РНК и часто проявляюет
RNase H-подобную активность
RNAi pathways in Drosophila
miRNA-путь
Первичные miRNAs после
транскрипции при действии Drosha
и Dicer-1 превращаются в зрелые
miRNAs, поступающие в RISCкомплекс. Его связывание с мРНК
совместно с другими факторами
подавляет трансляцию
ферменты Dicer и Drosha– члены
семейства RNaseIII,нарезающи[dsRNA на короткие
РНК
RNAi pathways in Drosophila
Пинг-понг модель «молчания» транспозонов
(TE) в линии половых клеток. Aubergine и
Argonaute-3 (Argonautes семейства
Piwi)поочередно расщепляют смысловую и
несмысловую нити –транскриптов
транспозонов, направляемые действием
piRNAs . Предположительно, piRNAs
участвуют в сборке гетерохроматина, тем
самым обеспечивая «молчание» попадающих
в гетерохроматин генов
Predicted secondary structure of putative miRNA precursors and organization of miRNA gene
clusters
Mourelatos Z et al. Genes Dev. 2002;16:720-728
©2002 by Cold Spring Harbor Laboratory Press
miR-134 в регуляции трансляции LIMK1
в зависимости от уровня BDNF


При отсутствии BDNF
трансляция LIMK1
блокируется miR-134
опосредованно через
сайленсинг комплекс (SC),
что ведет к уменьшению
шипиков дендритов.
В присутствии BDNF
активируется трансляция
LIMK1 и рост шипиков
дендритов (Schratt et al.,
(2006). A brain-specific
microRNA regulates dendritic
spine development. Nature,
439, 283–289 ).
Нейротрофические факторы, высвобождаемые
при синаптической пластичности регулируют
локальную трансляцию.

Три BDNF-регулируемых мРНК (discs
large homologue 2 (DLG2), Neurod2,
LIMK1, ключевой фермент
ремоделирования актина, содержат
консервативную последовательность в
3’UTR частично комплементарную miR134.
Локальная трансляция в аксонах,
необходимая для направленного
path-finding, аналогична LTP и LTD
Белки сигнального каскада
ремоделирования актина (кофилин)
 Молекулярные шапероны HSP27,
HSP60, HSP70, HSP90, grp75 и
grp78/BiP
 Белки, участвующие в патогенезе
нейродегенеративных заболеваний

Почему при синаптической пластичности
выгоднее использовать мРНК, а не белки?




Поскольку РНК может служить матрицей для теоретически
безграничной трансляции, выгоднее сохранять матрицы,
нежели неактивные белки
Регуляция белков на уровне трансляции мРНК по
сравнению с пост-трансляционной модификацией белков
является более гибкой, поскольку активность белка
регулируется произвольными последовательностями
мРНК, а не конститутивными доменами белка
Белки не всегда содержат информацию, необходимую для
их локализации
При локальной трансляции локальный сплайсинг мРНК
создает дополнительный уровень регуляции белков
Зачем использовать некодирующие
РНК?


Последовательность нуклеотидов в РНК
может определять большую точность и
специфичность взаимодействия, нежели
достигаемые изменением третичной
структуры белков
Поэтому нкРНК при функционировании
нервной системы являются устройством
связи между цифровой информацией
нуклеиновых кислот ядра и аналоговой
информацией клеточных белков
Current Rules
In the mammalian brain as elsewhere,
miRNAs subserve multiple
fundamental biological roles. Many
miRNAs are thought to interact
with thousands of different targets. Posttranscriptional RNA editing
may change mRNA target specifity.
Current Rules
One gene – different miRNAs
One miRNA – different genes
current needs of
the organism
individual
experience
Present view
synaptic plasticity
neurotrophic factors
(BDNF)
environmental
requirements
local translation in
dendrites of “dormanr”
mRNAs for LIMK1,
NMDAR, GluR
intermediate memory
remodeling of the spatial
structure of the nucleus
due to bringing together
heterochromatic
chromosomal regions
transport of
“dormant” mRNAs
in complex with
miRNAs
epigenetic chromatin
change for long-term
memory
“genome disorders”
deletion/duplication
syndromes
Для изучения этого нового, мало
исследованного феномена регуляции
посредством нкРНК требуются и новые
модели

Такой моделью могут служить спонтанные и
мутантные варианты локуса agnostic
дрозофилы с разной структурой гена LIMK1 и
необычной последовательностью ДНК рядом
с 3’UTR гена LIMK1, потенциально способной
генерировать новые нкРНК (Медведева и др.,
2008)
Localization of the agnostic locus
within the X-chromosome
11AB
in situ hybridisation on
polytene chromosomes of P40
(probe P[w+])
Df(1)112: 38.1-41.0
ts-lethality
Ca2+/calmodulin-dependent PDE activity
ether sensitivity/resistance
mitotic index of larval brain cells
defective oogenesis
Deletion mapping. The length of rectangles
[with the exception of microdeficiency
Df(1)112,
for
which
the
limits
of
recombinational mapping are presented]
indicate
the
X-chromosome
regions
spanned by deficiencies uncovering and not
uncovering
manifestations
of
mutant
phenotypes of the agnostic locus mutations
Am J Med Genet 2000 97(2):164-71
Donnai D, Karmiloff-Smith A.
Williams syndrome: From genotype through to the
cognitive phenotype




Williams syndrome arises due
to a contiguous gene deletion
at 7q11.23.
The WBS deletion is flanked by
large repeats containing genes
and pseudogenes
The deletions arise
spontaneously by inter- or
intrachromosomal crossover
events within misaligned
duplicated regions
Cognitive disabilities - gross
deficiencies in visual-spatial
processing arise due to LIMK1
hemizygosity
Иммунохимический анализ распределения LIMK1
по зонам мозга самок
220 C
290 C
CS
Df(1)112/CS
agnts3
Первичные антитела к LIMK1, разведение 1:500
вторичные конъюгированы с флюоресцеином (FITC), разведение 1:400
(goat LIMK1, donkey-anti-goat IgG-FITC, donkey serum, Santa Cruz)
Иммунохимический анализ
внутриклеточного распределения LIMK1 и
р-кофилина
 а,б – первичные
CS
agnts3
CS
agnts3
CS,ТШ
agnts3
ТШ
CS,ТШ
agnts3
ТШ

антитела к LIMK1,
вторичные
конъюгированы с FITC
в,г – первичные
антитела к р-кофилину,
вторичные
конъюгированы с
Rhodamin
Вестерн-блот анализ содержания двух
изоформ LIMK1 в головах самцов Canton-S и
agnts3
измерения интенсивности полос в программе GelAnalyzer (n=3, p≤0,05)
Video-registration of Drosophila
larval behaviour
The monitoring system consists

from chambers (B) to place the
larvae
Chambers are lighted up by
luminescent lamp (A)
Video camera (C) is installed over
the plates, and connected to the
computer (D)
Video data obtained by camera are
analyzed by special software, which
determines the larval position and
records the tracks of larval
movements (E)
Statistical analysis of all tracks is
performed to reveal distinguishes
(F)
Tracks before and after heat shock in wild
type and agnts3 larvae
CS females
CS females HS
agn females
50
50
45
45
40
40
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
agn females HS
0
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
Conditioned courtship suppression
paradigm
Stages of courtship in Drosophila melanogaster
Learning acquisition and memory retention
(conditioned courtship suppression
paradigm)
Iong-term memory
intermediate memory
250 C, adult
250 C, adult
HS adult
CS
CS
agnts3
agnts3
HS adult
#
Learning, 0 hr
Test immediately after 5-hrs long massive training in 5-day-old males
Memory, 3 hr
Test 2 days after massive training in 7-day-old males
Test 8 days after massive training in 13-day-old males
CS males
NERVE CELL BODIES
BRAIN STRUCTURE
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
w ithout inclusions
inclusions
NERVE CELL PROCESSES
1,0
0,8
0,6
0,4
BRAIN CONGO RED POSITIVE INCLUSIONS
0,2
0,0
w ithout inclusions
inclusions
agnts3 males
*
*
*
*
*
*
THUS WITHOUT HS
NERVE CELL PROCESSES
>>
NERVE CELL BODIES
>>
EYE FACETS
AFTER HS
EYE FACETS
>>
NERVE CELL PROCESSES
>>
NERVE CELL BODIES
Частота появления особей с Конго Ред
позитивными включениями в линиях CS и agnts3
в норме и при ТШ
100
% личинок с агрегатами
90
80
70
60
*
50
40
30
20
10
0
CS
agnts3 , ТШ
CS, ТШ
agnts3
agnts3, ТШ
agnts3
У agnts3 повышенное
содержание LIMK1 и рts3
agn , ТШ
кофилина приводит к сбоям
в динамике актинового
цитоскелета и
формированию амилоидных
агрегатов, в состав которых
вероятно входит актин.
Cytoskeletal Pathologies of Alzheimer
Disease
Bamburg and Bloom Cell Motil Cytoskeleton 2009 66(8):635-49
Due to the fact that the giant polytene
chromosomes can be found in larval tissues of
Drosophila, especially in salivary glands, it was
possible to create detailed and highly correlated
genetic, cytogenetic and molecular maps, down to
the nucleotide level (Kafatos et al, 1991). This was
the first step in Drosophila genome Project

Источником малых РНК является
гетерохроматин – ключевой фактор
эпигенетической регуляции генной
экспрессии, поведения хромосом,
функций нервной системы в норме,
патологии и в эволюционных
преобразованиях
Политенные хромосомы
слюнных желез дрозофилы
Х-хромосома
Район
интеркалярного
гетерохроматина 11АВ –
место локализации гена
для LIMK1
Частота эктопических
контактов в 2L-плече
Alleles of the agnostic locus
differently determine:
the chromosome architecture in the region
of the locus location;
 chromosome packaging;
 features of homologous and
nonhomologous pairing, implemented in
different rates of unequal recombination
 heterochromatic “gene silencing”

Asynapsis
Example of asynapsis
Differences in frequency of
asynapsis in individual
chromosomes
A/T- богатые районы рядом с геном LIMK1
дрозофилы могут служить для:
Генерации неравным кроссинговером делеционных и
дупликационных вариантов гена
Местом встройки транспозонов
(The National Centre for Biotechnology Information, NCBI)
Инсерция генетического материала в 3' UTR
.
гена LIMK1 у agnts3
Положение выбранных праймеров указано относительно последовательностей
ДНК, РНК и белка
возможные изменения в районе
локализации 3'-области гена limk1
гипотетическая шпилечная структура, сайт связывания miR-134 в 3'-UTR
Limk1, инсерция и возможное место ее встраивания, а так же
предполагаемая мРНК считывающаяся за стоп-кодоном.
Новые классы некодирующих РНК
Хотя у дрозофилы не обнаружены эндогенные siRNAs,
они могут быть производными длинных генов со
шпилечной структурой long hairpin RNA genes
(hpRNAs)
hpRNA путь дрозофилы – это гибрид между
каноническими факторами РНК интерференции (Dicer2, Hen1 известный как CG12367 м Argonaute 2) и
каноническим miRNA -фактором (Loquacious) для
генерации siRNAs. (Okamura et al., (2008). The
Drosophila hairpin RNA pathway generates endogenous
short interfering RNAs. Nature, 453, 803-6.
Identification and target
prediction of miRNAs
specifically
expressed in rat neural
tissue
You-Jia Hua et al, BMC Genomics
2009, 10:214
Current rules
One gene – different miRNAs
One miRNA – different genes
NAME OF
MIRNA
MicroInspector: a web tool for detection of miRNA
binding sites in an RNA sequence: 13 dme-miRs
dme-miR-316
dme-miR-9b
dme-miR-210
dme-miR-306star
dme-miR-275
dme-miR-184
dme-miR-954
dme-miR-973
dme-miR-990
dme-miR-306star
dme-miR-306star
dme-miR-1016
dme-miR-190
Insertion might
disrupt miR-target
The hair-pin itself might generate
mi-Rs: TargetscanFly
dme-miR-973: 25 conserved targets, with a total
of 27 conserved sites and 11 poorly conserved
sites
Function of target genes: signal transduction;
microtubule cytoskeleton organization; actin
filament-based process
dme-miR-1014: 388 conserved targets, with a
total of 419 conserved sites and 102 poorly
conserved sites
dme-miR-1014: 388 conserved targets, with a total of
419 conserved sites and 102 poorly conserved sites











Function of target genes:
calmodulin binding; GTP binding
small GTPase mediated signal transduction
Rho protein signal transduction
actin cytoskeleton
mRNA binding; mRNA 3'-UTR binding
RNA polymerase II
chromatin architecture
Epigenetics
axon guidance
olfactory behavior
Learning/memory
dme-miR-1014: 388 conserved targets, with a
total of 419 conserved sites and 102 poorly
conserved sites







Some well known target genes:
Cyclic-AMP response element binding protein
A Dmel\CrebA
Adenylyl cyclase 78C
dunce, 3',5'-cyclic-nucleotide
phosphodiesterase activity
Camta, Calmodulin-binding transcription
activator
Pde1c Phosphodiesterase 1c
Su(var)3-9
5-HT1B
Таким образом:

Возможно, что нарушения в 3’UTR у agnts3
сказываются на miRNA –зависимой регуляции гена
agnostic за счет дефектности комплементации между
мРНК для LIMK1 и miRNA

В норме связывние miRNA с 3’UTR мРНК
предотвращает терминацию транскрипции, вызывая
деградацию транскрипта

Этот предполагаемый дефект комплементации у
agnts3 может приводить к увеличению числа
транскриптов LIMK1, которые, в отличие от дикого
типа, более успешно пройдут через аппарат
трансляции
Ekaterina
Nikitina
Gennady
Zakharov
Learning/
memory
Computer
modeling
Dmitry
Molotkov
Molecular
biology
Julia
Dolgaya
Brain
histology
Alexander
Zhuravlev
Computer
modeling
biochemistry
Lab of
Neurogenetics
Alena Kamynskaya
Sound production
Professor
Andrey
Popov
Tatijana
Payalina
Larval
locomotion
Sound
production
Sechenov
Institute of
evolutionary
physiology
and
biochemistry
Anna
Medvedeva
Cytogenetics
Скачать