Влияние полиморфизма С-262Т гена каталазы на устойчивость нормальных и опухолевых клеток к окислительному стрессу Комина Анна Владимировна специальность 03.03.04 «клеточная биология, цитология, гистология» Красноярск, 2014 Актуальность проблемы • Наличие однонуклеотидных полиморфизмов может отражаться на особенностях протекания процессов в клетках организма. • Полиморфизмы в генах ферментов антиоксидантной защиты приводят к изменениям в работе антиоксидантной системы. • Окислительный стресс является причиной большого количества заболеваний (атеросклероз, заболевания почек, гипертензии, нейродегенеративные расстройства и др.). • Полиморфизм С-262Т в промоторной части гена каталазы приводит к повышенному риску развития бронхиальной астмы, рака молочной железы и др. • Пероксид водорода, утилизируемый каталазой, участвует в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза. • Понимание молекулярно-генетических особенностей клетки позволит открыть возможности персонифицированной медицины. Цель работы - определить характер распределения полиморфизма С-262Т в промоторной части гена каталазы в популяции жителей Красноярского края и оценить влияние полиморфизма С-262Т на устойчивость нормальных и опухолевых клеток к окислительному стрессу. Задачи 1. Используя метод молекулярно-генетического анализа, исследовать распределение полиморфизма С-262Т в промоторной части гена каталазы в популяции жителей Красноярского края и среди пациентов с меланомой и плоскоклеточным раком кожи; 2. Измерить активность каталазы в физиологическом состоянии в эритроцитах у лиц с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы, используя метод спектрофотометрии; 3. Оценить изменение активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах и клетках меланомы в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода спектрофотометрии; в различных концентрациях, методом Задачи 4. Оценить выраженность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов и клеток меланомы в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 – 1000 мкмоль/л; 5. Определить уровень TSPO под воздействием окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в концентрациях 400 – 1000 мкмоль/л в зависимости от генотипа по каталазе. Объекты и методы исследования • Объекты исследования: эритроциты и мононуклеарные лейкоциты здоровых добровольцев (n = 103), клеточная культура меланомы линии Bro, биоптаты меланомы (n = 50) и плоскоклеточного рака (n = 50). • Методы исследования: клеточное культивирование, выделение нуклеиновых кислот, ПДРФ-анализ, ПЦР в реальном времени, спектрофотометрическое определение активности каталазы, флуоресцентная микроскопия. Полученные результаты 1. Распределение частот аллелей полиморфизма С-262Т гена каталазы в популяции жителей Красноярского края составляет 82% для дикого аллеля С и 18% для мутантного аллеля Т, что соответствует популяционным показателям европейских стран Рис. 1. Частота генотипов и аллелей полиморфизма С-262Т гена каталазы в лейкоцитах жителей Красноярского края, клетках меланомы и плоскоклеточного рака кожи ПКР CT 0,1 CC 0,9 Полученные результаты 2. У лиц с вариантом полиморфизма гена каталазы -262СС повышен риск развития меланомы кожи в 45,5 раз и плоскоклеточного ракам кожи в 4,2 раза по сравнению с лицами, обладающими вариантами полиморфизма -262СТ и 262ТТ Генотип каталазы в клетках меланомы линии Bro – -262СС Рис. 2. Электрофорез ДНК-фрагментов гена каталазы в клетках меланомы линии BRO после рестрикции эндонуклеазой EcoR V. 100bp — маркерная ДНК 100bp Ladder ; CT — образец с вариантом генотипа СТ; CC — образец с вариантом полиморфизма СС; Bro — образец ДНК меланомы клеточной линии Bro. Полученные результаты 3. Активность каталазы в эритроцитах лиц с вариантами полиморфизма гена каталазы -262СТ и -262ТТ достоверно ниже, чем у носителей дикого варианта -262СС. Активность каталазы, ммоль/мин·г белка 0.9 * * 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 СС СТ ТТ варианты генотипов Рис. 3. Активность каталазы в эритроцитах людей с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы. Звездочками отмечены достоверные различающиеся данные по критерию Крускала-Уоллиса при p < 0,05. Относительная активность каталазы, отн. ед. 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 200 вариант СС 400 600 [H2O2], мкмоль/л вариант СТ 800 1000 вариант ТТ Рис. 4. Зависимость активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах от концентрации пероксида водорода в культуральной среде. Значение активности каталазы в культуре без пероксида водорода принято за единицу Полученные результаты 4. В состоянии окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, в мононуклеарных лейкоцитах с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы не происходит значимого изменения активности данного фермента относительно физиологического значения независимо от концентрации пероксида водорода. Рис. 5. Зависимость активности каталазы в клетках меланомы клеточной линиии Bro от концентрации пероксида водорода в культуральной среде. Значение активности каталазы в культуре без пероксида водорода принято за единицу Полученные результаты 5. Мононуклеарные лейкоциты с генотипом ТТ в положении -262 промоторной части гена каталазы обладают меньшей устойчивостью к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода, чем мононуклеарные лейкоциты с генотипами СС и СТ. А Б В Г НК Рис. 6. Мононуклеарные лейкоциты при окраске акридиновым оранжевым/бромистым этидием. А – живые клетки; Б – клетки в состоянии раннего апоптоза; В – клетки на более поздних этапах апоптоза; Г – некротическая клетка (НК). СС * 80 60 40 20 * * 80 60 40 20 0 0 0 400 700 [H2O2], мкмоль/л ТТ 1000 * 100 Доля клеток, % * 100 * Доля клеток, % 100 Доля клеток, % СТ * * 80 60 40 20 0 0 400 700 [H2O2], мкмоль/л живые клетки апоптоз 1000 некроз 0 400 700 [H2O2], мкмоль/л 1000 Рис. 7. Сравнительное распределение долей живых, апоптотических и некротических клеток в культурах мононуклеарных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма С-262Т в гене каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. Звездочкой обозначены достоверные различия при p < 0,05 А Б В Рис. 8. Меланомные клетки линии Bro при окраске акридиновым оранжевым/бромистым этидием. А — живая клетка; Б — клетка в состоянии апоптоза; В — некротическая клетка. * Доля клеток, % 120 * 100 80 60 40 20 0 0 400 700 1000 [H2O2], мкмоль/л живые клетки апоптоз некроз Рис. 9. Сравнительное распределение долей живых, апоптотических и некротических клеток в культуре меланомы Bro в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. Звездочкой обозначены достоверные различия при p < 0,05. Полученные результаты 6. Меланома клеточной линии Bro не содержит мутаций в положении -262 в промоторной части гена каталазы и обладает чувствительностью к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода: при концентрации пероксида водорода 1000 мкмоль/л доля жизнеспособных клеток достоверно снижается. Полученные результаты 7. Экспрессия гена TSPO в мононуклеарных лейкоцитах в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, не коррелирует с концентрацией пероксида водорода. 8 7 RQ, отн. ед 6 1,4 2,5 5 4 3 2 1,2,3 5 1 4 3 0 0 200 400 600 [H2O2], мкмоль/л СТ1 СТ2 800 1000 СТ3 Рис. 10. Относительное количество мРНК TSPO к β-актину (RQ) в трёх образцах мононуклеарных лейкоцитов с полиморфизмом -262СТ в гене каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. Цифрами 1–5 отмечены значения, имеющие достоверные различия при p < 0,05. Рис. 11. Относительное количество мРНК TSPO к β-актину (RQ) в культурах мононуклеарных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма С-262Т в гене каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. Выводы 1. 2. 3. 4. 5. Распределение полиморфизма С-262Т гена каталазы в популяции жителей Красноярского края составляет 82% для дикого аллеля С и 18% для мутантного аллеля Т, соответствует распределению Харди-Вайнберга, что свидетельствует о генетической устойчивости популяции, совпадает с распределением данного полиморфизма в популяциях стран европеоидной расы. У индивидов, обладающих диким вариантом полиморфизма гена каталазы 262СС, повышен риск развития меланомы в 45,5 раз и риск развития плоскоклеточного рака в 4,2 раза по сравнению с лицами, содержащими в генотипе мутацию С-262Т в одном или двух аллелях. Активность каталазы в лейкоцитах людей с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы в состоянии окислительного стресса достоверно не изменяется, однако при оценке активности в эритроцитах в физиологическом состоянии, активность каталазы в клетках с генотипом 262СС) оказывается достоверно выше таковой для клеток с гомо- и геретозиготной мутацией (-262ТТ и -262СТ). Мононуклеарные лейкоциты, содержащие мутацию С-262Т в обоих аллелях гена, обладают меньшей устойчивостью к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода, чем аналогичные клетки с диким и гетерозиготным вариантами полиморфизма. Уровень TSPO в мононуклеарных лейкоцитах не связан с действием и концентрацией пероксида водорода. Спасибо за внимание