Цель исследования Оценить применение современных

Цель исследования
Оценить применение современных стандартов
лабораторной
диагностики
ревматических
заболеваний в реальной клинической практике по
данным лаборатории иммунологии и молекулярной
биологии ревматических заболеваний ФГБУ «НИИР
им. В.А. Насоновой» РАМН за 2012 г.
Общая характеристика больных
За 2012 г. обследовано 19895 больных, из них 13863 (70%) амбулаторно и 6032 (30%) стационарно
Диагноз
Ревматоидный артрит (РА)
Ювенильный артрит (ЮА)
Анкилозирующий спондилоартрит (АС)
Псориатический артрит (ПсА)
Реактивные артриты (РеА)
Остеоартроз (ОА)
Подагра
Системная красная волчанка (СКВ)
Болезнь Шегрена (БШ)
Системная склеродермия (ССД)
Синдром Рейно
OVERLAP
Системные васкулиты
Ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный артериит
Остеопороз
Другие заболевания
n
%
1865
193
584
124
22
416
111
897
47
589
4
32
7
2
5
1134
31,0
3,2
9,6
2,1
0,4
6,9
1,8
14,9
0,6
9,8
0,1
0,5
0,1
0,1
0,1
18,8
Характеристика лабораторных биомаркеров
За 2012 г. произведено 90364 иммунологических исследований
(в среднем по 4,5 анализа на 1 пациента).
63,6% (57338 анализов) составили серологические тесты, связанные с
определением аутоантител;
12,9% (11661 анализов) – белки острой фазы воспаления;
25,5% (21365 анализов)- другие биомаркеры (АСЛ-О, иммуноглобулины,
криоглобулины, комплемент, субпопуляции лимфоцитов, гормоны,
квантифероновый тест ).
Количество анализов аутоантител за 2012 г. (I)
Показатель
Антинуклеарные антитела (АНА)
Антинуклеарный фактор (HEp-2) (НРИФ)
Антинуклеарный фактор (срезы печени крыс)
Антинуклеарные антитела (АНА) (скрининг, ИФА)
Антитела к дсДНК
Антитела к Sm
Антитела к Ro/SS-A
Антитела к La/SS-B
Антитела к U1РНП
Антитела к центромере
Антитела к Scl-70
Антитела к Jo-1
Ревматоидный фактор (РФ) класса IgM
Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП)
Антитела к цитруллинированному виментину (АМЦВ)
Антинейтрофильные цитоплазматические антитела (АНЦА)
Антинейтрофильные цитоплазматические антитела (АНЦА-скрининг)
цАНЦА-аПР3
пАНЦА-аМПО
Антифосфолипидные антитела (АФЛ)
Антитела к кардиолипину (АКЛ) классов IgG/IgM
Антитела к β2- гликопротеину I (аβ2-ГПI) классов IgG/IgM
Волчаночный антикоагулянт (ВА)
n
27026
7772
1022
1274
5792
1328
2579
2399
1253
2165
1195
247
7027
8194
52
2550
610
1047
893
8353
4300
3030
1023
%
30,0
8,6
1,1
1,4
6,4
1,5
2,9
2,7
1,4
2,4
1,3
0,3
7,8
9,1
0,06
2,8
0,7
1,1
1,0
9,2
4,7
3,4
1,1
Количество анализов аутоантител за 2012 г. (II)
Показатель
Другие аутоантитела
Антитела к С1q
Прямая проба Кумбса
Антитела к гладкой мускулатуре (ASMA)
Антитела к микросомам печени и почек (LKM1)
Антитела к растворимому антигену печени/поджелудочной железы (SLA/LP)
Антимитохондриальные антитела (АМА-М2)
Печеночный иммуноблот (антитела к LKM1, LC-1, SLA/LP, M2, F-актину,
миозину, десмину, sp100, gp210)
Антитела к париетальным клеткам желудка
Антитела к глиадину
Антитела к гломерулярной базальной мембране (GBM)
Антикардиальные антитела
Антитела к тиреоглобулину
Антитела к тиреопероксидазе
n
%
4136
20
214
786
323
48
430
4,6
0,02
0,2
0,9
0,4
0,05
0,5
40
29
26
29
720
754
717
0,04
0,03
0,03
0,03
0,8
0,8
0,8
Количество анализов аутоантител за 2012 г. (III)
4,6%
АНА
9,2%
IgM РФ
2,8%
30%
АЦЦП
АНЦА
АФЛ
9,1%
Другие антитела
7,8%
Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа аутоантител,
реагирующих с различными компонентами ядра
Международные рекомендации по методам
клиническому значению антинуклеарных антител
определения
и
Антинуклеарный фактор (АНФ)
1. «Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА в
сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) с
использованием в качестве субстрата криостатных срезов мышиной или крысиной печени
(почек), либо клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека).
2. Применение стандартизованных HEp-2 клеток предпочтительнее, так как позволяет
существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы
свечения ядра. При тестировании АНА методом НРИФ их традиционно обозначают как
антинуклеарный фактор (АНФ).
3. Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального титра обнаружения
АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлюоресценции.
4. Характер свечения отражает присутствие различных типов АНА, в определенной степени
специфичных для ряда аутоиммунных РЗ.
Титры АНФ в норме и патологии
Норма < 1:40 при использовании
криостатных срезов печени или почек
лабораторных животных
Норма <1:160 при использовании
HЕp-2 клеток человека
Идентификация 95% больных аутоиммунными
ревматическими заболеваниями и здоровых лиц
АНФ-HЕp-2 в титре 1:40 выявляется у 25-30%,
1:80 у 10 – 15%,1:160 и выше у 5% здоровых людей.
Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин.
Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями
имеют титры АНФ ≥1:40 в 25-30% случаев.
Уровни позитивности АНФ-HЕp-2:
Низко позитивные титры:1:160
Умеренно позитивные титры: 1:320-1:640
Высоко позитивные титры: 1:1280 и более
E.M.Tan и соавт., Arthritis Rheum 1997;
40: 1 601-1611
ХАРАКТЕРИСТИКА АНФ
Тип свечения
Тип аутоантител
Связь с заболеваниями
Гомогенное
Антитела к ДНК (двух и
односпиральной), ДНП,
гистонам (H1, H2A,H2B, H3,
H4)
СКВ, лекарственная волчанка,
любые аутоиммунные
заболевания
Периферическое
(краевое)
Антитела к дс ДНК
СКВ
Крапчатое
Антитела к Sm, РНП, SSA/Ro,
SS-B/La, Jo-1
СКВ, СЗСТ, синдром Шегрена,
ПМ/ДМ
Сетчатое
крапчатое
Антитела к Scl-70
ССД (диффузная форма)
Дискретное
крапчатое
Антитела к центромере
CREST синдром, синдром Рейно
Нуклеолярное
Антитела к
РНК-полимеразе 1, PM/Scl,
U3РНП
ССД (диффузная форма)
Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения
при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (I)
Тип свечения
Аутоантигены
Заболевания
Частые типы свечения
Ядерное свечение
Гомогенное
Двухспиральная (дс) ДНК, гистоны,
хроматин/нуклеосомы, HMG (high mobility
group)
Системная красная волчанка (СКВ),
лекарственная волчанка/васкулиты, ювенильный
идиопати-ческий артрит
Крупное крапчатое
Sm, U1 – рибонуклео-протеин (РНП), ядерный
матрикс
Мелкое крапчатое
SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, многие ядерные
антигены
СКВ, смешанное заболевание соединительной
ткани (СЗСТ), синдром Рейно, системная
склеродермия (ССД), синдром Шегрена (СШ),
недифференцированное заболевание
соединительной ткани
СКВ, СШ, ССД, воспалительные миопатии, СЗСТ
Центромерное
Кинетохор: CENP-A, B, C, F
ССД (лимитированная форма), синдром Рейно
Нуклеолярное
PM/Scl, РНК-полимераза, UРНП, U3-РНП, To/Th,
B23 фосфопротеин/нуматрин
ССД, синдром Рейно, воспалительные миопатии,
перекрестный синдром
Диффузное
Рибосомальный белок Р (RibP), Jo-1, другие
синтетазы трансферной (т) – РНК, частицы
сигнального распознавания (SRP)
СКВ, воспалительные миопатии
Мелкое крапчатое
Jo-1, SRP, пируватдегидрогеназа (PDH)
(митохондрии)
Воспалительные миопатии, дерматомиозит (ДМ),
первичный билиарный цирроз (ПБЦ),
интерстициальное поражение легких
Цитоплазматическое свечение
Agmon-Levin N. et al. Ann Rheum Dis 2013; doi:10.1136/annrheumdis-2013-03863
Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (II)
Тип свечения
Плотное мелкое крапчатое
Плейоморфное крапчатое
клеточного цикла (PCNA)
Заболевания
СКВ, ревматоидный артрит (РА), ПБЦ,
воспалительные миопатии,
аутоиммунные заболевания печени
Здоровые лица, воспали-тельные
заболевания
Нуклеолярное (глыбчатое)
Вспомогательный белок ядерного
СКВ, лимфопролиферативные
антигена клеточной пролиферации: заболевания, СШ
фактор элонгации ДНК-полимеразы
дельта
U3-РНП (фибриллярин)
ССД
Множественное/редкое точечное
Sp100, PML-тельца, p80 -coilin
ПБЦ, хронический аутоиммунный
гепатит (ХАГ), СШ
Центросомы/центриоли (ранее:
аппарат веретена )
Митотическое веретено
Энолаза, нинеин, перицентрин
ССД, синдром Рейно, воспалительные
заболевания
РА, воспалительные заболевания,
микоплазменная пневмония
Дискретное крапчатое
Комплекс Гольджи
Цитоплазматические волокна
NuMa/центрофилин
Цитоплазматическое свечение
Эндосома (ранний эндосомальный
антиген -1), глицин-триптофан
(GW)/процессирующие тельца,
мультивезикулярные
тельца/лизосомы
Белки Гольджи/гольджины:
гиантин, гольджин 245, гольджин
110, гольджин 97, гольджин 95 и др.
Актин, цитокератин, топомиозин,
виментин
Неврологические заболевания, СШ,
СКВ, РА, ПБЦ, недифференциро-ванные
заболевания соединительной ткани
СКВ, СШ, РА, перекрестный синдром,
мозжечковая атаксия
ХАГ, ДМ, инфекционные и
воспалительные заболевания
Agmon-Levin N. et al. Ann Rheum Dis 2013; doi:10.1136/annrheumdis-2013-203863
Периферическое/краевое или
оболочки ядра
Аутоантигены
Редкие типы свечения
Ядерное свечение
Ламинины, LAP1/2gp210,
нуклеопорин р62, комплексные
антигены ядерной оболочки и
ядерных пор
DFS70/LEDGF-P75
Позиция
ACR
и
EULAR
в
отношении определения АНФ
•
Тестирование АНФ с помощью НРИФ при использовании в качестве субстрата HEp-2
клеток человека (содержащих 100-150 различных аутоантигенов)- «золотой стандарт»
и первичный скрининговый метод определения АНА в сыворотке крови
•
Другие скрининговые методы определения АНА (ИФА, мультиплексные технологии,
устанавливающие наличие в сыворотках антител к смеси ядерных антигенов,
увеличивают процент ложноотрицательных результатов и не могут заменить
тестирование АНФ с помощью НРИФ
•
Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием
различных методов твердофазного анализа ( ИФА, мультиплексные
диагностические платформы) должны предоставить данные о такой же или более
высокой чувствительности и специфичности этих техник по сравнению с АНФ-НРИФ,
а при расхождении результатов измерения АНА с клиническими данными
обязательно провести повторное исследование АНА с помощью НРИФ-HЕp-2,
•
У пациентов с положительными результатами определения АНФ рекомендуется
проведение подтверждающих тестов на специфические АНА к отдельным ядерным
антигенам (нДНК, Sm, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, РНП), используя методы ИФА,
иммуноблота (ИБ), двойной иммунодиффузии (ДИД), контриммуноэлектрофореза
(КИЭФ) и др.
•
Некоторые типы АНА (антицентромерные, PCNA, антитела к митотическому аппарату
клетки-NUMA) обнаруживаются только методом НРИФ на HEp-2 клетках, что
исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью
подтверждающих тестов.
•
Методы определения АНА, анти-ДНК, анти-Sm и др. должны быть валидированы
согласно национальным (CDC) или международным ( WHO) стандартам.
•
В бланках выдачи результатов анализа следует указывать метод определения АНА.
Недостатки непрямой реакции иммунофлюоресценции - основного скринингового
метода определения антинуклеарных антител
» СУБЪЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА
» НЕОБХОДИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
ТИПОВ СВЕЧЕНИЯ
» ОТСУТСТВИЕ КВАЛИФИЦИРОВАННОЙ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКИ
» ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СВЕЧЕНИЯ В ТИТРАХ
» ОТСУТСТВИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СУБСТРАТОВ, РЕАГЕНТОВ, МИКРОСКОПА
» ЗНАЧИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО ЛОЖНО ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
http://www.euroimmun.us
Автоматизация и стандартизация
определения АНФ методом НРИФ
http://www.aklides.com/
http://www.immcodiagnostics.com
http://www.aesku.com
Клиническое значение АНФ
ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ: СКВ (диагностический критерий
СКВ), ССД
ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ: СШ в сочетании с СКВ
МЕНЕЕ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ: ПМ/ДМ
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ: ЛЕКАРСТВЕННОЙВОЛЧАНКИ,
СЗСТ, АУТОИМУННОГО ГЕПАТИТА
ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОГНОЗА И МОНИТОРИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ:
ЮВЕНИЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКОГО АРТРИТА, ассоциирующегося с увеитом
ФЕНОМЕНА РЕЙНО, ассоциирующегося с системными РЗ
НЕ ИМЕЕТ ДОКАЗАННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО И ПРОГНОСТИЧЕСКОГО
ЗНАЧЕНИЯ ПРИ: РА, РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ, ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ,
ИНФЕКЦИЯХ, ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИЧЕСКОЙ ПУРПУРЕ
ФИБРОМИАЛГИИ
Клиническая информативность определения АНФ при СКВ
Показатель
ДЧ (%)
ДС (%)
ОППР
ОПОР
1.
Собственные данные
Данные литературы1
94,5
40
1,6
0,13
93
49-78
2,20
0,11
Solomon D.H., Kavanaugh A.J., Schur P.H. Evidence-based guidelines for the use
of immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthr Rheum 2002;47:434-44.
Клиническая информативность определения АНФ при ССД
Показатель
ДЧ (%)
ДС (%)
ОППР
ОПОР
1.
Собственные данные
Данные литературы1
96
40
1,6
0,1
85
44-75
1,86
0,27
Solomon D.H., Kavanaugh A.J., Schur P.H. Evidence-based guidelines for the use of
immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthr Rheum 2002;47:434-44.
Клиническая информативность определения АНФ при СШ
Показатель
Собственные данные
Данные литературы1
ДЧ (%)
ДС (%)
ОППР
ОПОР
96
40
1,6
0,1
48
44-91
0,99
1,01
1.
Solomon D.H., Kavanaugh A.J., Schur P.H. Evidence-based guidelines for the use of
immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthr Rheum 2002;47:434-44.
Кратность определения АНФ
Согласно международным рекомендациям определение АНФ в
НРИФ нецелесообразно использовать для мониторирования
активности патологического процесса (отсутствие корреляции
большинства типов свечения, кроме гомогенного, с активностью
заболевания; измерение в титрах) и может проводиться с частотой
1 раз в 6 месяцев – 1 год
Международные рекомендации по использованию
иммунологических маркеров для диагностики СКВ
Иммунологические критерии СКВ
Стандартная панель иммунологических тестов для оценки прогноза
и мониторирования активности СКВ
Антитела к dsДНК
Антитела к Ro/SSA
Антитела к La/SSB
Антитела к RNP
Антитела к ФЛ
Антитела к С1q
C3/C4
Антитела к двухспиральной (нативной) днк - серологический маркер СКВ
Методы определения:
1. ИФА-первичный скрининговый тест.
2. Непрямая иммунофлюоресценция с Crithidia Luciliae
3. РИА (тест-Farr)
подтверждающие
тесты
Crithidia Luciliae
•
Норма.
ИФА < 10-20 МЕ/мл,
НИФ с Crithidia luciliae - < 1:10
РИА Farr < 7 МЕ/мл.
Клиническое значение
Полезный тест для диагностики СКВ у пациентов с положительными результатами определения
АНФ.
Обязательный диагностический критерий СКВ.
Полезный тест для оценки активности патологического процесса и поражения почек.
Положительные результаты обнаружения антител к дсДНК не позволяют достоверно
прогнозировать обострения СКВ.
При других ревматических заболеваниях тестирование антител к dsДНК не полезно, так как они
выявляются очень редко (≤5% случаев) и в низких титрах.
• Увеличение концентрации анти-дсДНК и снижение концентрации
комплемента коррелирует с тяжестью СКВ
• Рекомендуется определять уровень анти-дсДНК и концентрацию С3
и С4 комплементов в сыворотке при наблюдении пациентов с СКВ
для оценки активности и прогнозирования развития обострений
Клиническая информативность определения
антител к дсДНК при СКВ (ИФА)
Показатель
ДЧ (%)
ДС (%)
ОППР
ОПОР
1.
Собственные данные
Данные литературы1
61
82
43
0,47
57,3
97,4
44,6
0,49
Kavanaugh A.F., Solomon D.H. Guidelines for immunologic laboratory testing in the
rheumatic diseases: anti-DNA antibody tests. Arthr Rheum 2002; 47: 546-55.
Кратность определения антител к дсДНК
Рекомендуемая частота определения антител к дсДНК составляет 1
раз в 1-3 месяца при высокой активности, 1раз в 3-6 месяцев при
низкой активности
Антитела к Sm (Smith) антигену (ИФА)
Sm антиген состоит из 5 малых ядерных (мя) РНК (U1, U2, U4, U5, U6), связанных с 11
и более полипептидами (70 kd, A, B/B′, C, C′, D, E, F, G). При СКВ антитела к Sm
реагируют с B/B′ и D полипептидами, общими для U1, U2, U4/U6 мяРНП, участвующих
в сплайсинге пре-мРНК.
•
Методы определения: ИФА, ИБ, ДИД и КИЭФ.
•
Норма: ≤ 25 ЕД /мл при использовании ИФА (зависит от рекомендаций
фирмы-изготовителя коммерческих наборов реагентов).
•
Клиническое значение:
1. Специфичный серологический маркер и диагностический критерий СКВ.
2. Не имеет пользы для оценки активности и характеристики субтипов СКВ.
•
Кратность определения:
Рекомендуется однократное определение антител к Sm.
Клиническая информативность определения
антител к Sm при СКВ (ИФА)
Показатель
ДЧ (%)
ДС (%)
ОППР
ОПОР
1.
Собственные данные
Данные литературы1
46
90
4,6
0,6
8-20
99
14,0
0,87
Kavanaugh A., Tomar R., Reveille J.et al., Guidelines for clinical use of the antinuclear
antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College
of Pathologists. Arch Pathol Lab Med 2000; 124: 71-81.