Кишкун Алексей Алексеевич

Маяки и лоции в
море современных
лабораторных
инноваций и
технологий
Что мы определяем при
лабораторных исследованиях?
Genomics (DNA- 35,000 genes)
Геномика
Transcriptomics (RNA - 100,000 mRNA’s)
Транскриптомика
Proteomics (Proteins - 1,000,000 proteins)
Протеомика
Metabolomics (2,500 smoll molecules)
Метаболомика
Лабораторные методы
исследования
1. Генетические маркеры, кодирующие
синтез специфических белков в
организме
2. Специфические белки
3. Метаболиты
Протеомика специфические белки
1. Плазмы крови
2. Органов (клеток) и тканей
Белки тесно связанные с
определенными структурами
органов и тканей
• Чем выше их уровень в крови – тем
выраженнее повреждение органа
• Чем выше их уровень в крови – тем
неблагоприятнее прогноз
Белки, отражающие реакцию
органов и систем на различные
патологические процессы
• Не связаны с патологией
определенного органа
• Чем выше (ниже) их уровень в крови
– тем выраженнее патологический
процесс
• Уровень повышения в крови с
меньшей степенью вероятности
отражает неблагоприятный прогноз
Определение специфических
белков используют для:
1. оценки риска развития сердечнососудистых заболеваний - определение
ультрачувствительного СРБ или
аполипопротеинов
2. раннего выявления воспалительного
процесса, оценки тяжести больного и
прогноза течения заболевания - СРБ или
прокальцитонин
3. диагностики острого коронарного синдрома
- миоглобин, тропонины Т или I
4. диагностики железодефицитных
состояний и анемии - трансферрин,
ферритин, растворимый рецептор
трансферрина
5. ранней диагностики нарушений статуса
питания больных - преальбумин,
трансферрин, альбумин
6. диагностики повреждений головного мозга
- белок S100
7. раннего выявления диабетической и
артериальной нефропатии - альбумин в
моче
Иммунология
Проточная цитофлюориметрия с
использованием моноклональных антител:
– иммунофенотипическая характеристика
клеток крови для диагностики
гемобластозов;
– иммунофенотипическая характеристика
клеток крови для оценки иммунного
статуса и диагностики
иммунодефицитов;
– иммунофенотипическая характеристика
стволовых клеток
Иммуногематология
• Группы крови АВ0
• Антигены эритроцитов системы
Резус
• Антигены системы Keлл
• Антигены системы Даффи (Duffy –
антиген Fy), Кидд (Kidd – антиген Jk),
MNS (антиген MNS) и Левис (Lewis –
антиген Le)
Масс-спектрометрия технология MALDITOF/MS
Матрично-активированная лазерная
десорбция/ионизация, МАЛДИ — (от
англ. MALDI, Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionization) — десорбционный
метод «мягкой» ионизации, обусловленной
воздействием импульсами лазерного
излучения на матрицу с анализируемым
веществом. Матрица представляет собой
материал, свойства которого
обусловливают понижение деструктивных
свойств лазерного излучения и ионизацию
анализируемого вещества.
Чувствительность метода: << 1
фемтомоль.
Кандидаты в биомаркеры сердечной
недостаточности (предложено более 60
биомаркеров, отражающих различные
патогенетические аспекты сердечной
недостаточности)
1. Биомаркеры воспаления:
• С-реактивный белок (высокочувствительный)
• Фактор некроза опухолей α и его рецепторы
• Интерлейкины 1,6,10 и 18
• Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2
(LP-PLA2)
• Адипонектин
2. Биомаркеры оксидативного стресса:
• Окисленные ЛПНП
• Миелопероксидаза
• Биопиррины мочи
3. Биомаркеры ремоделирования
экстрацеллюлярного матрикса:
• Матричные металлопротеиназы 2,3,9
• Тканевые ингибиторы металлопротеиназ
• Коллагеновые пропептиды
• Галектин 3
4. Нейрогормоны:
• Ангиотензин II
• Альдостерон
• Вазопрессин/копептин
• Эндотелин 1
• Катехоламины (норадреналин, адреналин)
• Кардиотропин 1
• Новые вазодилататоры (адреномедуллин и
средняя часть проадреномедуллина,
уротензин II, урокортин)
5. Биомаркеры повреждения и апоптоза
кардиомиоцитов:
• Тропонин I и T
• Легкие цепи миозинкиназы I
• Белок, связывающий жирные кислоты
• МВ-фракция креатинкиназы
6. Биомаркеры стресса кардиомиоцитов:
• Натрийуретические пептиды (предсердного типа,
мозгового типа,типа С, N-терминальный
пропептид предсердного типа А, про-НПМТ,
средняя часть пропептида предсердного типа)
• Растворимый рецептор ST2 (ST2 является
членом семейства рецепторов интерлейкина 1,
типичная рецепторная тирозинкиназа)
• Фактор дифференциации роста 15 (GDF-15)
7. Экстракардиальные биомаркеры:
• Цистатин С
• β-микроглобулин
• желатиназа-ассоициированный липокаин
нейтрофилов (NGAL)
• N-ацетил- D-глюкозаминаза (NAG)
• Молекула повреждения почек 1 (KIM-1)
• трийодтиронин
Что отражают показатели
(специфические белки),
полученные с помощью
современных технологий?
Универсальная дефиниция ИМ
Критерии острого ИМ
• Инфаркт миокарда - «выявление повышения и/или снижения
значений концентрации кардиомаркера [предпочтительно
кардиального тропонина (cTn)], по крайней мере, на одно
значение, характерное для 99-ой процентили, соответствующей
верхнему референсному значению». Т.е.,«≥ 2 х 99-ая процентиль
при CV ≤10%»
• В дополнение, должен быть, по крайней мере, один
из пяти признаков, подтверждающих диагноз ИМ
-
симптомы ишемии
изменения ЭКГ, характерные для новой ишемии (новые
изменения ST-T), или новая блокада левой ножки пучка Гисса
(LBBB);
развитие патологических зубцов Q на ЭКГ;
«свежая» потеря жизнеспособного миокарда или нарушение
региональной подвижности стенки, подтвержденные методами
визуализации
обнаружение внутрикоронарного тромба при ангиографии или
при аутопсии
Чувствительность биомаркеров к
повреждению миокарда
Infarction Mass [g.]
Infarction Mass vs. Mycardial Marker
ECG
5 - 10 g
CK
~0,2 g
Marker
CK-MB
~0,02 g
Troponin
~0,003 g
Высокочувствительный тропонин
• кардиальные тропонины
высокочувствительными тестами
обнаруживаются почти у 100 % здоровых
людей
• чувствительность методов определения
тропонинов повышена в 1000–10 000 раз и
теперь нижний предел определения
(аналитическая чувствительность) может
достигать 90 пкг/л
Алгоритм серийных измерений hs cTn для диагностики ИМ
Правила Ослера:
1. Диагноз никогда не ставят по
одному результату
исследования; необходимо
установить тенденцию
изменения полученных
результатов
2. Чем больше степень
отклонения результата от
референтной величины, тем
выше достоверность наличия
патологии
Sir William Osler, 1904
“The Evolution of Modern
Medicine”
Критерии диагностики сахарного
диабета (2010 г. Американская
Диабетическая Ассоциация):
1. HbA1c > 6,5 %, или
2. клинические симптомы сахарного диабета и
случайно выявленное повышение
концентрации глюкозы в плазме крови 11,1
ммоль/л (200 мг%) или;
3. уровень глюкозы в плазме крови натощак –
7,1 ммоль/л ((126 мг%) или;
4. через 2 ч после пероральной нагрузки
глюкозой (75 г глюкозы) - 11,1 ммоль/л
(200 мг%).
Гликозилированный гемоглобин
Измеряется методом катионобменной хроматографии и
иммунного анализа
Измеряется методом
аффинной
хроматографии
В 1996 году в США была разработана
Национальная программа стандартизации
гликозилированного гемоглобина (NGSP).
Ужесточение критериев NGSP:
• 1996 год – точность <5% в диапазоне 4-14%
• 2002 год - точность <4% в диапазоне 4-14%
• 2007 год – bias ± 0,85% HbA1c в диапазоне 4-12%
• 2010 год - bias ± 0,75% HbA1c в диапазоне 4-10%
Точность - степень близости результата измерений
к принятому опорному значению
Bias - смещение (неправильность средства
измерения) - систематическая погрешность в
показании средства измерений
Методы определения специфических
белков:
Электрофорез, включая капиллярный
Иммунотурбидиметрия
ИФА
Иммунохемилюминисценция
Масс-спектрометрия
Хроматография
Микроскопия с использованием моноклональных
антител (иммуногистохимия)
8. Флюоресцентная микроскопия с использованием
моноклональных антител
9. Микроплашечная и гелевая технологии в
иммуногематологии
10. Проточная цитометрия
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Физический или химический
принцип технологии, т.е. на
чем основана технология,
ее аналитические
возможности и недостатки
Аналитическая
чувствительность метода –
способность метода
выявлять минимальное
количество аналита в
материале
Эволюция иммуноферментных
тест-систем на HBsAg
ИФА
тест-системы
Время
появления т/с
Чувствительность
выявления HBsAg
Т/с
1-го поколения
Конец 80-х ХХ
в.
1,0 МЕ/мл(нг/мл)
Т/с
2-го поколения
2-я половина
90-х ХХ в.
0,1 МЕ/мл
Т/с
3-го поколения
2007 г.
0,01 МЕ/мл
Чувствительность метода при
использовании меток различных типов
Тип метки
обнаружения
Пример метки
Ферменты
Бета-галактозидаза
Пероксидаза хрена
Щелочная фосфатаза
Пределы
1.5x10-16 моль
3x10-16 моль
5x10-17 моль
Биолюминесценция Ферментное усиление
Люцифераза светлячков
10-19 моль
10-19 моль
Флуоресценция
2x10-17 моль
10-13 моль
Ферменты/
Ион европия (III)
Флуоресцеин
Пероксидаза/люминол/усилитель <10-15 моль
Хемилюминесценция Глюкозо-6-фосфат
dehydrogenase péroxidase/
изолюминол
* Диоксиэтаны
10-18 моль
10-21 моль
Метаболомика
Риск развития атеросклероза и ИБС
Оптимальный холестерин-липопротеиновый
профиль:
•
•
•
•
общий холестерин – менее 5,17 ммоль/л (200 мг/дл);
ЛПВП-холестерин – более 1,3 ммоль/л (50 мг/дл);
ЛПНП-холестерин – менее 3,4 ммоль/л (130 мг/дл);
триглицериды – менее 1,7 ммоль/л (150 мг/дл)
Гомоцистеин – продукт обмена аминокислот,
фактор, определяющий риск развития
раннего атеросклероза и тромбоза
Витамин Д (ненасыщенный циклический спирт с 4
двойными связями и боковой цепью эргостерина, одно
кольцо в молекуле циклопентанпергидрофенантрена
в отличие от других
витаминов, превращается в гормон,
что делает его намного более
биологически активным
разорвано),
Локализация рецепторов к витамину Д
Система/Орган/Клетка
Функции
Патология
Кишечник
Абсорбция кальция
Мальабсорбция
кальция
Остебласты
Костеобразование и
минерализация
ОП, остеомаляция,
остеодистрофия
Остеокласты
Костная резорбция
Кожа
Дифференцировка
кераноцитов. Рост и
восстановление волос
Аллопеция
Репродуктивная
система
Овариальная/тестикулярная
Бесплодие
Иммунная система
Иммунологический
контроль
Аутоиммун. заболевания, опухоли
Ренин-ангиотензинная система
Контроль объема
крови
Гипертензия
Мозг
Ментальная функция
Болезнь Альцгейм.
В продуктах питания
содержание витамина D
несущественно
Синтез витамина D
в коже
Без вит D >6 мес/год
Без вит D 1-6 мес/год
Количество
месяцев,
Вит D круглый год Вит D круглый год
когда УФ-В
лучи
Без вит D 1-6 мес/год
солнечного
Без вит D >6 мес/год
света не
приводят к
образованию
в коже
витамина D3
Теоретический цвет кожи
Статус витамина D у приматов и ранних
людей
Зима
43o Сев.
широты
160
120
A
80
40
0
Обезьяны
Старого Света
Люди, вся
поверхность
кожи которых
подвергается
воздействию
УФ-В
“Норма”
80
Содержание
в крови при
приеме 1000
МЕ/день
Источники: Cosman, Osteoporosis Int 2000; Fuleihan NEJM 1999; Scharla Osteoporosis Int 1998; Vieth AJCN 1999, 2000
Жители северных
широт,
принимающие
4000 МЕ/день
Физиологическое
потребление
взрослыми
Клинические лаборатории США
Тесты, выполнение которых
возросло в наибольшей степени за
последние 10 лет
Тесты, с наибольшей клинической
значимостью за последние 10 лет
Геномика и
транскриптомика
Молекуляно-генетические маркеры рака легких:
• Circulating Tumor DNA
• DNA Methylation—B4GALT1, KIF1A, MCAM,
RarB, PAK3, SSBP2, TIMP-3
• Messenger RNA—CK7, EGFR, RUNX3, SCCA,
SFTPB, TGFBR3, TRGC2, TRBV9
• MicroRNA—miR-15b, -21, -27b, -126, -210, -4865p, -574-5p, -1254, -let-7d, has-miR-328, has-miR26a, has-miR-383, has-miR-92a, msa-miR-662
Биомаркеры для мониторинга трансплантации
Применение
Орган
Почки
Brandhorst G,
Oellerich M.
Individually
tailored
immunosuppres
sion: Is there a
role for
biomarkers?
Clin Chem
2011; 57:376–
81.
Проба
Биомаркер
Диагностика
Прогноз
Urine
Perforin mRNA
X
X
GB mRNA
X
X
CD103 mRNA
X
PI-9
X
X
Granulysin mRNA
X
X
IP-10 mRNA
X
CSCR3 mRNA
X
FOXP3 mRNA
X
FasL mRNA
X
Urine IP-10 Protein
X
TIM-3 mRNA
X
IFN-γ mRNA
X
Почки
Кровь
GB, perforin,
FasL mRNA
X
CD40L mRNA
X
IL-4, -5, -6, IFN-γ
X
HLA-DRA mRNA
X
TNF-α mRNA
X
IL-8 mRNA
X
Сыворотка AT1R-AA
Печень
Легкие
Кровь
Кровь
X
X
X
TLR
X
C3 gene
X
CXCR, CSCL-10, CSCL9
X
X
TLR
X
X
C3 gene
CXCR, CSCL-10, CSCL9
X
X
X
5 составляющих в понимании
возможностей современных технологий
клинической лабораторной диагностики:
1. На чем основана технология
2. Значение технологии для клинической практики
3. Что отражают показатели, полученные с помощью
современных технологий
4. Аналитические возможности технологии и ее
недостатки
5. Оптимальное сочетание возможностей различных
технологий для повышения их клинической
эффективности
Выводы:
1. Руководители здравоохранения,
клиницисты, специалисты лабораторной
диагностики должны понимать, что нам
нужно как можно быстрее внедрять и
осваивать новые технологии, чтобы
окончательно не отстать от уровня
развития медицины и лабораторной
диагностики развитых стран и,
соответственно, качества оказания
медицинской помощи населению страны.
2. Следующим шагом является переход с
уровня протеомно-метаболической
диагностики, который мы пытаемся
внедрить в клиническую практику, на
генетический уровень диагностики.
3. Генетический уровень требует внедрения в
клиническую практику генетических
маркеров диагностики сердечно-сосудистых, онкологических, эндокринологических
и других заболеваний, генетических
маркеров подбора и отторжения трансплантантов, маркеров особенностей фармакогеномики лекарственных препаратов в
организме больного, генетических маркеров
прогноза и исхода заболеваний и т.д.
4. Внедрение генетических маркеров
заболеваний в клиническую
практику приводит к коренному
изменению подходов к
профилактике и лечению, и главное,
достижению лучших результатов
профилактики и лечения.
Что делать?
Лучшей альтернативой является
сохранение спокойствия?
Что делать?
Практически осуществлять переход
от кустарных лабораторных
мастерских к автоматизированной
конвейерной индустрии и внедрять
современные технологии в
клиническую практику
Смело верь тому, что вечно,
Безначально, бесконечно,
Что прошло и что настанет,
Обмануло иль обманет
Все на свете редко стало ─
Есть надежды ─ счастья мало;
Не забвение разлука:
То ─ блаженство, это ─ мука.
М.Ю. Лермонтов