epigeneticheskie_modifikacii_genoma_cheloveka

Молекулярная биология для
биоинформатиков
• Академический университет
• Ефимова Ольга Алексеевна
Лекция №2
Эпигенетические
модификации генома
человека
«Генетика предполагает, а эпигенетика располагает».
P. Medawar & J. Medawar
Доимплантационное
развитие человека
День 1.
Стадия зиготы
День 2.
Эмбрион в
стадии
дробления 4
бластомера
День 3.
Эмбрион на
стадии
дробления 8
клеток.
День 4. Морула.
3
День 5. Бластоциста
Разные судьбы, функции,
морфология, «способности»
клеток при одинаковом генотипе
Эпигенетическое наследование
В более общем смысле, предметом эпигенетики являются явления,
связанные с развитием различных фенотипов клеток или организмов
на основе одного генотипа.
В более узком смысле эпигенетика – раздел генетики, который изучает
наследуемые изменения активности генов во время развития
организма или деления клеток.
Эпигенетическое наследование – наследование паттерна экспрессии
генов.
Эпигенетическая регуляция - наследственные
и ненаследственные изменения в экспрессии
конкретного гена без каких-либо
соответствующих структурных изменений в
его нуклеотидной последовательности.
Эпигенетические явления: импринтинг, эффект положения,
особенности структурно-функциональной организации
хроматина определенных хромосомных локусов, влияющие
на экспрессию генов, интерференция РНК.
ДВА ВИДА ИНФОРМАЦИИ
В ГЕНОМЕ
Генетическая – закодированная в ДНК
программа создания живого организма
Эпигенетическая (динамическая) –
как, где и когда должна быть реализована
генетическая информация.
Каждый вид информации обеспечен
своими системами:
Кодирования
Хранения
Передачи
Изменения
генетические
• Необратимы (мутации)
• Изменения первичной
структуры ДНК
• Стабильно наследуемые
эпигенетические
• Обратимы
• Не затрагивают изменений
первичной структуры ДНК
• Бывают долговременные и
кратковременные
Молекулярные основы
Метилирование ДНК
эпигенетики
Модификации гистонов
Эпигеном - это совокупность
всех эпигенетических маркеров,
обусловливающих паттерн
экспрессию генов в данной
клетке.
Посттрансляционные
модификации гистонов
Гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4 формируют октамерные структуры, вокруг
которых закручивается нить ДНК, образуя таким образом нуклеосомы
Структура нуклеосомы
Аминокислотые остатки гистонов
могут подвергаться посттрансляционным
модификациям:
ацетилированию,
фосфорилированию,
метилированию.
Модификации аминокислотных
остатков гистоновых белков
происходят, в основном, в Nтерминальных участках, которые
расположены за пределами
компактного октамера и
подвергаются действию
различных клеточных сигналов
В зависимости от типа и сайта
модификаций аминокислотных
остатков, каждая нуклеосома имеет
свой «гистоновый код», регулирующий
активность транскрипции
Ацетилирование и деацетилирование гистонов
•ацетилирование связано с активацией транскрипции
•белки, осуществляющие ацетилирование - гистоновые
ацетилтрансферазы (НАТ); донор ацетильной группы –
ацетил коА
•белки, осуществляющие деацетилирование – гистоновые
деацетилазы (HDAC)
Модель модификации гистонов:
ДНК-связывающиеся активаторы привлекают НАТ для
ацетилирования нуклеосомных гистонов, а репрессоры
привлекают HDAC для деацетилирования гистонов. Эти
события приводят к изменению структуры нуклеосом и
активации или репрессии транскрипции соответственно.
Эффект ацетилирования – ослабление связи
между ДНК и гистонами из-за изменения
заряда, в результате чего хроматин становится
доступным для факторов транскрипции
Сайты ацетилирования:
аминогруппы лизиновых
остатков в составе боковой
цепи гистона
Фосфорилирование и
дефосфорилирование гистонов
•фосфорилирование связано с активацией транскрипции
•белки, осуществляющие фосфорилирование –
протеинкиназами; донор фосфата – АТФ
•белки, осуществляющие дефосфорилирование –
фосфатазы
Сайты фосфорилирования:
гидроксильные группы серина, треонина и тирозина.
В результате фосфорилирования увеличивается
негативный заряд.
Метилирование гистонов
Метилируются
-Лизин (моно-, ди- и триметилирование)
-Агринин (моно- и диметилирование)
Метилирование не приводит к изменению заряда модифицируемого
остатка
Эффекты метилирования в зависимости от сайта модификации
и количества метильных групп:
-Репрессия транскрипции
-Активация транскрипции
Регуляция транскрипции через молекулы-эффекторы
Метилирование лизинов
Осуществляют лизиновые метилтрансферазы - НКМТ
SET-домен
Донор метильной группы –
S-аденозилметионин (SAM)
6 наиболее хорошо описанных сайтов метилирования:
на гистоне Н3 (К4, К9, К27, К36, К79)
на гистоне Н4 (К20)
Деметлирование лизинов
LSD1 удаляет метильные группы с Н3К4
JHDM1 – H3K36me1 и me2, JHDM2A – H3K9m1 и me2,
JHDM3A – H3K36me3, JMJD2A – H3K9me3.
Роль модификаций в регуляции транскрипции
Модификации
Группа 1
ацетилирование
фосфорилирование
метилирование
Группа 2
убиквитинирование
сумоилирование
Роль в транскрипции
активация
активация
активация
репрессия
активация
репрессия
репрессия
Сайты
модифицирования
Н3 (К9, К14, К18, К56)
Н4 (К5, К8, К12, К16)
Н2А (?)
Н2В (К6, К7, К16, К17)
Н3 (S10)
Н3 (К4, К36, К79)
Н3 (К9, К27)
Н4 (К20)
Н2В (К123)
Н2А (К119)
Н3 (?)
Н4 (К5, К8, К12, К 16)
Н2А (К126)
Н2В (К6, К7, К16, К17)
Метилирование
ДНК и
связанные с
ним процессы
Молекулярные основы эпигенетики
H
H
N
CH3
4
5
3
6
2
N
1
Б.Ф. Ванюшин
Впервые определил
природу метилируемых
последовательностей
ДНК у разных видов
организмов (1959 г.)
N
O
Robin Holliday
Обосновал роль
метилирования ДНК в
регуляции работы гена.
Предложил термин
«эпимутация» (1987 г.)
Репрессия транскрипции посредством метилирования ДНК
Взаимосвязь между метилированием цитозина в
молекуле ДНК и ацетилированием гистонов
Механизмы инактивации гена в
результате метилирования промоторной
области
1. Метильные группы нарушают ДНК-белковые
взаимодействия, выступая в большую бороздку ДНК
и препятствуя связыванию специфических
транскрипционных факторов.
2. Метилированные районы ДНК специфически
связывают транскрипционные репрессоры.
3. Метилирование ДНК влияет на структуру хроматина.
Метилирование ДНК в клетке контролирует все (!)
генетические процессы, в том числе такие как :
Транскрипция (клеточная дифференцировка)
Репликация
Рекомбинация
Репарация
Транспозиция генов
Инактивация Х-хромосомы
Биологическая специфичность метилирования ДНК:
•
•
•
•
•
Видовая (штаммовая)
Тканевая (клеточная)
Органоидная (ядро, митохондрии, пластиды)
Внутримолекулярная (островки метилирования, повторы)
Возрастная
Резкое искажение метилирования ДНК:
• отсутствие метильных доноров
•

(рак, гепатома)
суперметилирование ДНК  РАК
• полное выключение (knockout) ДНК-метилазного гена 
остановка развития, апоптоз, смерть (без метилирования ДНК
жизни нет!)
Семейства ДНК-метилтрансфераз
(ДНК-метилаз) млекопитающих:
DNMT1 – поддержание метилирования
В гаметогенезе изоформы:
DNMT1o
DNMTp
DNMT2 – РНК-метилазная активность
(может специфично метилировать
цитозин в 38 положении
антикодоновой петли тРНК
аспарагина); связь между
метаболическими процессами и
репрограммированием метилирования
ДНК
SAM – донор метильной группы
DNMT3 – метилирование de novo,
регуляторные функции при
метилировании
DNMT3a
DNMT3b
DNMT3L
De novo метилирование ДНК и
сохранение характера
метилирования ДНК
Высокометилированые последовательности:
•Сателлитная ДНК
•Повторяющиеся элементы (в т.ч. транспозоны и их инертные формы)
•Уникальная межгенная ДНК
•Экзоны генов
CpG – островки
-неметилированные участки длиной 1 kb
- в 5`-концах 60% промоторов активных генов
Что защищает их от метилирования?
- они защищены белками
- постоянная работа деметилаз
- нетипичный состав оснований
Деметилирование – удаление метильных групп из ДНК
Пассивное деметилирование – реализуется после репликации ДНК, за счет
отсутствия метилазной активности.
Новосинтезированная нить ДНК не метилируется по образцу старой, и
образуется полуметилированная (гемиметилированная) ДНК.
Активное деметилирование – задействована ферментативная система,
превращающая 5-метилцитозин в цитозин независимо от репликации
Долгое время механизм и ферменты, вовлеченные в процесс
активного деметилирования ДНК оставались неизвестными!
Активное деметилирование ДНК
5-гидроксиметилцитозин – гидроксильная форма 5-метилцитозина
может быть промежуточным соединением в процессе активного
деметилирования (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010).
5-гидроксиметилцитозин описан у млекопитающих в начале 1970-х (Penn et
al., 1972).
2009 год:
5-гидроксиметилцитозин выявлен в клетках:
мозга
почки
легкого
сердца
в эмбриональных стволовых клетках мыши
в клетках HeLa
в клетках эмбриональной почки
(Kriaucionis, Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009).
Активное деметилирование ДНК
В 2009 году у млекопитающих было идентифицировано семейство белков
TET (Ten-Eleven-Translocation), гомологичных белкам трипаносомы JBP1 и
JBP2 – оксидазам метильной группы тимина (Tahiliani et al., 2009).
Оказалось, что все три белка семейства TET – TET1, TET2 и TET3 – могут
превращать 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин (Ito et al., 2010).
Деметилирование ДНК с образованием
5-гидроксиметилцитозина
Методы анализа метилирования
1. Метилчувствительная ПЦР (Not1, Eag1, SacII, HpaII,
HhaI)
2. Метилспецифическая ПЦР
Трансформация цитозина в урацил бисульфитом Na
3. MethylLight – метилспецифическая ПЦР в реальном
времени
4. Биологические микрочипы
5.Специфические антиметилцитозиновые антитела
Волны эпигенетического репрограммирования генома
млекопитающих
ДНК примордиальных половых клеток значительно метилирована;
при миграции клеток в недифференцированные гонады в них наблюдается резкое
деметилирование;
реметилирование (метилирование de novo) ДНК половых клеток происходит на поздних
стадиях созревания.
После оплодотворения уровень метилирования остается высоким в импринтированных
генах, но резко снижается в неимпринтипрованных отцовских и материнских генах.
К стадии бластоцисты уровень метилирования ДНК повышается.
Метилирование ДНК и факторы внешней среды
Метаболизм SAM –
донора метильной
группы
При дефиците фолиевой
кислоты повышен риск
возникновения дефектов
нервной трубки у плода
Причина:
снижение уровня
метилирования ДНК
Метилирование ДНК и факторы внешней среды
Доказано влияние на метилирование ДНК металлов – никеля, кадмия, мышьяка,
а также хрома, ртути, трихлорэтилена, дихлоруксусной и трихлоруксусной
кислоты, бензола, бисфенола.
Металлы способствуют образованию в клетке активных форм кислорода,
вызывающих повреждения ДНК, которые затрудняют или делают невозможной
работу ДНК метилтрансфераз.
В 1992 году Баркером была выдвинута гипотеза FEBAD (fetal basis of adult
disease).
В пользу гипотезы свидетельствует обнаруженная взаимосвязь между
воздействием на плод экзогенных и эндогенных факторов и риском
последующего развития сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного
диабета второго типа, остеопороза и некоторых видов рака.
Внешние
факторы
Внешние факторы, действующие на женщину в период
беременности, могут изменять характер метилирования
ДНК в ее клетках, модифицировать формирующиеся
эпигенетические паттерны плода, а также влиять на
процесс репрограммирования в формирующихся половых
клетках плода!
Метилирование ДНК является обратимой
реакцией и в значительной степени подвержено
воздействию эндогенных и экзогенных факторов.
Эти особенности, с одной стороны, увеличивают
риск возникновения ошибок из-за влияния
негативных факторов, но с другой – дают
возможность проводить коррекцию
эпигенетической регуляции генома за счет
определенных внешних воздействий, в том числе
лекарственных средств, гормонов и диеты.
Интерференция РНК
и регуляция
экспрессии генов
Нобелевская премия
по физиологии и медицине
2006 год
"RNA interference – gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
Предположение Fire & Mello:
Двуцепочечные РНК (dsRNA)
– запускающий механизм (триггер) системы
интерференции РНК.
Интерференция РНК
– это замолкание (сайленсинг) генов,
обеспечиваемое двуцепочечными
молекулами РНК (dsРНК).
Явление интерференции РНК открыто
в 1998 г. у Nematoda (Fire et al., 1998)
Инъекция в C.elegans РНК мышечного белка
dsРНК в 10-100 раз более эффективно активируют
систему интерференции РНК, по сравнению с ssРНК.
Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver
S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by
double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature
391, 806–811 (1998).
Эффект генетического сайленсинга
посредством интерференции РНК:
распространяется в тканях организма (!)
наследуется (!!!)
Механизм интерференции РНК
•
при исследовании интерференции РНК у растений
обнаружены короткие молекулы РНК, маркирующие ген,
подверженный сайленсингу;
•
в условиях in vitro воспроизведены биохимические
реакции интерференции РНК.
Малые интерферирующие РНК (siRNAs – short
interfering RNAs) – класс 21-22 нуклеотидных
двуцепочечных РНК, образующихся из более
длинных двуцепочечных РНК.
Общая схема регуляции генетической экспрессии за счет
интерференции РНК (по Novina, Sharp, 2004)
Функции siРНК
1. Сайленсинг мобильных генетических элементов;
2. Сайленсинг гетерохроматиновых повторов;
3. Сайленсинг генетического материала вирусного
происхождения;
4. Ограничение степени экспрессии гена в
определенных тканях.
При выделение фракций коротких РНК (19-25
нуклеотидов) из различных организмов обнаружен
еще один класс малых РНК – микроРНК.
МикроРНК (miRNAs - micro RNAs) – класс
19-25 нуклеотидных одноцепочечных РНК,
закодированных в уникальных генах
геномов многоклеточных организмов.
Схема образования miРНК
(по Novina, Sharp, 2004)
Функция miРНК
Обеспечивают сайленсинг различных генов,
обычно, за счет частично комплементарного
связывания с мРНК, в результате которого
блокируется ее трансляция.
• один тип miРНК может регулировать
трансляцию мРНК более 100 различных
генов;
• степень ингибирования зависит от
количества связывающихся miРНК (в
3’UTR мРНК содержится несколько
сайтов связывания).
Отличия miРНК и siРНК
miРНК
siРНК
• Продукт dsРНК,
закодированных в уникальных
генах геномов многоклеточных
организмов (>1% от всех генов
у человека);
• Продукт dsРНК,
образующихся в результате
транскрипции транспозонов,
гетерохроматиновых
повторов или генетического
материала вирусного
происхождения ;
• мРНК может не разрушаться;
• Один тип miРНК регулирует
разные гены.
• мРНК разрушается;
• Один тип siРНК обычно
регулирует только один тип
мРНК.
• созданы библиотеки коротких РНК и ДНК-
векторов,
кодирующих
короткие
РНК,
мишенями которых является около 8000 генов
генома человека;
• внедряется в практику терапевтическое
применение синтетических коротких РНК для
целенаправленного подавления генетической
экспрессии при некоторых заболеваниях.
«В последние годы … установлен
особый класс заболеваний человека,
обусловленный дефектами структуры
и модификаций хроматина - так
называемые «хроматиновые болезни».
С. Назаренко,
2005 г.
Синдром Ретта (OMIM 312750)
Частота 1 на 10000-15000
детей женского пола
Впервые описан Реттом в
1966г (Rett, 1966), повторно
в 1983 Хогбергом
( Hagberg, 1993).
Мутация в гене MeCP2 (MeC
binding protein),
расположенном на Xq28
http://www.mississippichallenge.or
g/rettsyndrome.html
http://www.rodim.ru/conference/in
dex.php?s=0b8265fee36f1322b6da
b8dae8f038a7&showtopic=83503&
pid=4926083&st=765&#entry49260
83
•регрессия развития
•аутизм
•стереотипные движения рук
http://swimpig.blogspot.com/200
7_02_01_archive.html
Синдром ICF (OMIM 242860)
(Immunodeficiency, Centromere instability and Facial anomalies syndrome )
Luciani et al., 2005
Мутации в гене
DNMT3B (DNA
metiltransferase),
расположенном на
хромосоме 20q11.2
Синдром ICF (иммунодефицит, хромосомная нестабильность,
аномалии лицевого черепа)
Гетерохроматиновые районы хромосом 1, 9 и 16
неметелированы, вследствие чего растянуты и имеют
ветвистую структуру
Впервые синдром
описан в 1978 году
(Hulten, 1978)
Синдром Коффина – Лоури (OMIM 303600)
Мутация гена RSK
(ribosomal S6 kinase),
расположенном на
Хp21.1-21.2
RSK2 - регулируемая
ростовыми
факторами серинтреониновая киназа
Частота
встречаемости
1:40 000 - 50 000
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?
book=gene&part=cls&rendertype=figure&id=cl
s.F1
Впервые был описан 1966 Коффином
(Coffin et al., 1966), позже Лоури отметил
другие характерные особенности в 1972
году (Lowry et al., 1972).
http://clsf.info/Welcome.htm
Газета "Российское здоровье и общество"
«Капризная дама» ГЕНЕТИКА:
«Три—четыре года прошло, как появились
хроматиновые болезни. Одна из них — синдром
Халькинсона-Килборга. Со времен вьетнамской
войны его связывали с дефолиантами,
применяемыми американской армией, затем с
другими экстремальными воздействиями
экологического характера. Причиной оказалась
аномалия прикрепления хроматина к генам».