Клональное размножение растений in vitro

Клональное размножение растений in
vitro
Вегетативное размножение


Сельскохозяйственные или декоративные
растения размножают вегетативным способом в
том случае, если они имеют специальные органы
для такого типа размножения (клубни, луковицы,
клубнелуковицы, столоны) или у них растянутый
ювенильный период, что удлиняет сроки
получения урожая, затрудняет селекционную
оценку отдельных генотипов (древесные и
кустарниковые культуры).
Сорта, породы вегетативно размножаемых
растений – это, как правило, сложные
гетерозиготы, нередко полиплоиды. Воспроизвести
их генотип путем семенного размножения
практически невозможно.
Вегетативное размножение
Недостатки:

Коэффициент размножения при естественном
вегетативном размножении, как правило, не такой
высокий, как при семенном размножении.

Семенные клубни, луковицы намного крупнее
обычных семян. Для их хранения нужны большие
хранилища, в которых должна поддерживаться
определенная температура, влажность, что
нередко связано со значительными затратами
энергии.

Сорта вегетативно размножаемых культур в ходе
вегетации накапливают разнообразные инфекции,
которые передаются последующим поколениям.

Поддержание генетических коллекций вегетативно
размножаемых культур связано со значительными
затратами.
Преимущества клонального размножения
растений in vitro




Высокий коэффициент размножения
Возможность эффективно размножать те растения,
которые с трудом размножаются традиционными
методами
Возможность круглогодичных работ, для их
проведения не требуются большие площади
При размножении растений в пробирках не
возникает угрозы их повторного заражения
вирусными и другими болезнями (при условии, что
исходное маточное растение является здоровым)
Использование культуры апикальных меристем
для получения свободного от патогенов
посадочного материала



Инициальные клетки апикальных меристем
характеризуются высокой цитогенетической
стабильностью: на протяжении всей жизни
растения они, как правило, сохраняют генотип
зиготы
Важное свойство меристемных тканей – отсутствие
в них или крайне низкие концентрации вирусных
частиц даже у пораженных вирусами растений
В 1952 г. Морель и Мартэн (Morel, Martin, 1952)
разработали методику оздоровления растений георгинов
с помощью культуры in vitro апикальных меристем
размером около 100 μм. С тех пор этот метод с разной
степенью эффективности нашел применение для
широкого круга вегетативно размножаемых растений.
Использование культуры апикальных меристем для
получения свободного от патогенов посадочного материала



Первым этапом промышленного размножения является
отбор наиболее продуктивных клонов маточных
растений, в наибольшей степени соответствующих
описанию сорта, древесно-кустарниковой породы, или
выделяющихся по комплексу положительных
характеристик.
Отобранные визуально здоровые маточные растения до
введения в культуру дополнительно проверяют на
наличие основных вирусов с использованием различных
методов: биотестов (заражения растений-индикаторов,
то есть особо чувствительных к патогену), электронной
микроскопии, иммуноферментного анализа (ИФА) –
ELISA (от англ: enzyme linked immunosorbent assay).
В последнее время находят применение методы,
основанные на анализе нуклеиновых кислот патогенов:
электрофорез, in situ гибридизация в сочетании с
применением различных меток (например, NASH –
nucleic acid spot hybridization), варианты ПЦР-анализа
(например, RT-PCR – reverse transcription polymerase
Иммуноферментный анализ
Спектрофотометр для оценки результатов ИФА
Использование культуры апикальных меристем
для получения свободного от патогенов
посадочного материала


Культуру in vitro апикальных меристем получают,
вычленяя в условиях асептики под бинокулярным
микроскопом верхнюю часть конуса нарастания стебля
размером около 200 μм и помещая его на
агаризованную питательную среду. В питательную
среду, помимо цитокининов и ауксинов, добавляют
небольшое количество гиббереллина. Культивирование
проводят на свету.
Эффективность оздоровления зависит от размера
эксплантата и вида вируса. Так, путем культивирования
апикальной меристемы картофеля удалось получить
70% растений-регенерантов, свободных от Y-вируса
картофеля (PVY), и только 10% растений без Х-вируса
(PVX).
Светоустановка для микроклонального
размножения растений
Использование культуры апикальных меристем
для получения свободного от патогенов
посадочного материала



Для повышения эффективности оздоровления от
вирусной инфекции с помощью культуры меристем
маточные растения перед вычленением эксплантатов
подвергают термотерапии - продолжительному
воздействию повышенных температур.
Термотерапию проводят в климатических камерах при
37 °С и относительной влажности 90 %; освещенность
растений около 5 тыс. люкс, фотопериод 16 час. В
течение первой недели растения постепенно адаптируют
к повышенным температурам, ежедневно повышая ее
на два градуса с 25 до 37 °С. Продолжительность
термотерапии разная в зависимости от вида растений и
вирусов. Например, для оздоровления гвоздики
достаточно 10–12-недельного воздействия теплом.
Применение термотерапии в сочетании с культурой меристем дало возможность
получить более 70 % свободных от вирусов растений-регенерантов хмеля, 90 %
растений земляники, 25 % растений черной и красной смородины, 50 % малины,
более 80 % растений картофеля. Показана эффективность термотерапии для
лечения болезней, вызванных микоплазмами.
Использование культуры апикальных меристем
для получения свободного от патогенов
посадочного материала



Хемотерапия (химиотерапия) заключается в добавлении
в питательную среду, на которой культивируют
апикальные меристемы, различных веществ,
обладающих противовирусной активностью.
Чаще всего для этих целей используют синтетические
аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований:
цианогуанозин, 2-тиоурацил, Д-рибофуранозил-1,2,4триазол-карбоксимида (коммерческое название –
вирозол), а также интерферон, ридостин (рибонуклеат
натрия), биназу (микробную рибонуклеазу),
фенолкарбоновые кислоты: салициловую, галловую,
сиреневую, кофейную, феруловую, кумаровую.
Положительные эффекты хемотерапии отмечены для ряда
древесных и кустарниковых культур (черешни, сливы, малины,
смородины), некоторых цветочных культур. Применение
хемотерапии дает возможность повысить эффективность
оздоровления растений от вирусов с помощью культуры
меристем с 40% до 80-100%.
Клональное размножение растений in vitro
Методы микроразмножения:
 активация развития уже существующих
меристем (апекса стебля, пазушных и
спящих почек стебля);
 индукция адвентивных почек у
эксплантата или в каллюсной культуре;
 соматический эмбриогенез.
Клональное размножение растений in vitro


Активация развития уже существующих в растении
меристем основана на снятии апикального
доминирования. Апикальное доминирование –
подавление роста боковых почек растительного
побега при наличии верхушечной почки. Снять его
у пробирочных растений можно двумя путями:
удалением верхушечной почки или добавлением в
питательную среду цитокининов.
В случае использования цитокининов для снятия
апикального доминирования развитие пазушных
почек возможно без удаления верхушечной почки.
При этом из почек эксплантата и побегов,
тронувшихся в рост из верхушечной и пазушных
почек эксплантата, формируется конгломерат
побегов (аксиллярное ветвление)
Микроклональное размножение картофеля
(активация существующих меристем)
Клональное размножение растений in vitro
Клональное размножение растений in vitro

Метод клонального размножения растений in vitro путем
индукции адвентивных почек основан на свойстве
тотипотентности растительной клетки. Суть его
заключается в том, что эксплантаты разных частей и
органов растений, не содержащие стеблевых почек,
способны их образовывать in vitro при наличии
факторов, индуцирующих стеблевой органогенез. В
качестве эксплантатов могут быть сегменты листовых
пластинок и черешков, молодых соцветий, чешуй и
донца луковиц, клубнелуковиц, корневые черенки,
боковые и интеркалярные меристемы и другие органы и
ткани. Стеблевые почки возникают de novo как в
эпидермальных, так и супэпидермальных слоях
эксплантата. Поскольку они появляются в «необычном»
для растения месте, их называют адвентивными
(добавочными).
Образование адвентивных почек на листовых
эксплантатах льна
Клональное размножение растений in vitro

Индукция адвентивных почек из тканей
эксплантата - наиболее распространенный метод
микроразмножения луковичных цветочных
растений (лилий, нарциссов, гиацинтов,
тюльпанов) – из луковичных чешуй, сегментов
базальной части донца луковиц, эксплантатов
листьев; земляники садовой – из основания
побегов, регенерированных в культуре меристем;
представителей рода Brassica (капусты цветной,
кочанной, брюссельской, брокколи) – из сегментов
гипокотиля, котиледона, листьев; салата
цикорного – из сегментов листовых пластинок;
петуний – из сегментов корней; глоксиний,
сенполий, стрептокарпуса, эхинапсуса – из
сегментов листовых пластинок.
Соматический эмбриогенез в клеточной суспензии
in vitro арахиса
Инкапсуляция соматических эмбриоидов

В 1970-е годы Т. Мурасиге высказал идею инкапсуляции
соматических эмбриоидов с целью получения
искусственных семян. Она была реализована на
практике в начале 1980-х: применительно к
высушенным соматическим эмбриоидам моркови (Kitto,
Janik, 1982) и влажным (не подвергавшимся
подсушиванию) эмбриоидам люцерны (Redenbaugh et
al., 1984). Наибольшее распространение получила
вторая из названных технологий, которая заключается в
инкапсуляции соматических эмбриоидов в различные
гелеобразные субстратанции на основе агара,
альгината, карбоксиметилцеллюлозы, каррагинана,
гельрита, пектата натрия и других. Лучшие результаты
были достигнуты при использовании альгината.
Искусственные семена орхидей (соматические эмбриоиды,
инкапсулированные в альгинатный гель) (А) и полученные из
них проростки (Б)
Проблемы перевода растений-регенерантов из
условий in vitro в условия ex vitro


Особенности пробирочных растений:
Сформированные при повышенной влажности и гетеротрофном
питании листья имеют слабую анатомическую
дифференциацию: палисадная ткань отсутствует или слабо
развита, мезофилл в основном представлен клетками губчатой
паренхимы с большим межклеточным пространством,
хлоропласты имеют неорганизованные граны, низкое
содержание хлорофилла и протеинов. Ферменты,
ответственные за фотосинтез, обладают пониженной
активностью. Сосудистая система листьев недоразвита.
Многочисленные устьица остаются полностью раскрытыми и не
реагируют на стимулы (темнота, CО2 , абсцизовая кислота и
другие), которые в норме вызывают их закрытие. Защитное
восковое покрытие практически отсутствует, а тот воск,
который образуется, существенно отличается по химическому
составу от воска на листьях растений, выращиваемых в
окружающей среде (обладает пониженными гидрофобными
свойствами). Стебли пробирочных растений недостаточно
лигнифицированы, в них значительно меньше колленхимы и
склеренхимы по сравнению с нормальными растениями. Клетки
имеют тонкие оболочки, а межклеточное пространство
увеличено, сосудистая система недоразвита. У многих растений
в условиях in vitro не происходит образования корневых
Приемы, позволяющие улучшить приживаемость
растений





Последний, перед высадкой растений, пассаж
рекомендуют производить на более бедную по составу
минеральных солей питательную среду, например, среду Уайта,
концентрацию сахарозы уменьшают до 1%. Из среды
полностью исключают цитокинины, оставляя только ауксины,
стимулирующие корнеобразование (например, ИМК).
Повышают интенсивность освещения (до 8-10 тыс. люкс),
немного понижают температуру, при которой производят
культивирование
Добавка в питательную среду ретардантов роста, а также
адаптогенов: янтарной кислоты, крезацина, Мивала-Агро,
которые ингибируют рост стеблей в длину, вызывают
утолщение корней, уменьшают листовую поверхность,
увеличивают содержание хлорофилла и стимулируют
образование воска на листьях.
Снижение влажности воздуха в культуральных сосудах путем
использования десикантов, охлаждения нижней части сосудов,
а также простым удалением пробок из пробирок за 7-10 дней
до высадки растений в грунт.
Для ряда древесных культур благоприятный эффект дает
микоризация пробирочных растений.
Пробирочные растения картофеля с
микроклубнями
Регенерация растений картофеля из микроклубней
Направления практического использования
клонального размножения растений in vitro



Разработаны и широко используются
промышленные технологии микроклонального
размножения большого числа вида орхидей, а
также других ценных цветочных и декоративных
культур.
Производство высококачественных семян
картофеля
Широкое применение нашли технологии
микроклонального размножения древесных и
кустарниковых культур, причем, не только
различных плодовых и декоративных, но и
культур, применяемых в городском озеленении,
лесовосстановлении.
Сохранение ценного генофонда в условиях in vitro




В условиях in vitro хранят генетические
коллекции:
сортов и пород вегетативно размножаемых
культур,
стерильных форм,
растений, образующих семена, которые быстро
теряют всхожесть или не выдерживают высушивание и пониженные температуры
Применяют два основных подхода:

- сохранение коллекций в виде медленно растущих
культур пробирочных растений;
 - криоконсервация тканей или клеточных культур
отдельных генотипов.
Сохранение генетических коллекций в виде медленно
растущих культур пробирочных растений
Методы замедления роста культур:

пониженная температура культивирования (1-4 оС для
холодостойких и 8-16 оС для теплолюбивых культур)

пониженное атмосферное давление (0,5 мм рт. ст.) или
снижение концентрации кислорода в воздушной среде
(смесь инертного газа (азота) и кислорода в концентрации 110%), при которой производят культивирование;

добавление в питательную среду осмотиков (6-10%
сахарозы, 3-6% маннита или сорбита) или регуляторов
роста, замедляющих рост растений (хлорхолинхлорид,
гидразид малеиновой кислоты, 2,2-диметил гидразид янтарной
кислоты (В-995), Фосфон Д);

получение и хранение при пониженных температурах
запасающих органов растений (микроклубней,
микролуковиц, микроклубнелуковиц) или
инкапсулированных соматических эмбриоидов.
Криоконсервация тканей или клеточных культур
растений



Методические подходы для сохранения
жизнеспособности клеток при замораживании:
выбор биологического объекта для криоконсервации
использование криопротекторов
(Проникающие в
клетки протекторы: глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль,
диметилсульфоксид (ДМСО), аминокислоты: пролин, аспарагин и
другие) препятствуют формированию кристаллов льда путем
образования водородных связей с молекулами воды. Непроникающие
криопротекторы: сахароза, трегалоза, фиколл, альбумин,
поливинилпирролидон защищают клетки от осмотических перепадов,
связанных с замораживанием, снижают скорость роста кристаллов льда)

прекультивирование подлежащих замораживанию
объектов в специфических условиях, позволяющих
уменьшить содержание воды в клетках (на питательных
средах с 2-6% маннита или сорбита, ДМСО (2,5-10%), при пониженных
температурах (4-6оС)

высушивание в ламинарном потоке воздуха, с
использованием силикагеля. Эффективно в сочетании с
альгинатной инкапсуляцией
Криоконсервация тканей или клеточных культур
растений




Процесс криоконсервации клеток и тканей
растений включает следующие этапы:
замораживание (температуру понижают медленно,
0,5-1оС в минуту, до -35оС, выдерживают при этой
температуре 15-30 мин и только после этого
погружают материал в жидкий азот)
хранение
размораживание (помещая извлеченные из
жидкого азота пробирки на водяную баню,
нагретую до +37-40оС)
рекультивирование