клинико-иммунологическая характеристика хронической
advertisement
На правах рукописи Сайбель Анастасия Валерьевна КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОНИЧЕСКОЙ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ И ЛАТЕНТНОЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ И ОБОСНОВАНИЕ АЛГОРИТМА БОТУЛИНОТЕРАПИИ НА ЕЕ ФОНЕ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Владивосток – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, Маркелова Елена Владимировна Официальные оппоненты: Запорожец Татьяна Станиславовна – д.м.н., Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории иммунологии. Васильева Маргарита Михайловна – к.м.н., доцент, краевое Государственное бюджетное образовательное учреждение «Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения Министерства здравоохранения Хабаровского края» заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации. Защита диссертации состоится 14 ноября 2013 года в ______ часов на заседании диссертационного совета ДКМ 208.007.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2 (главный корпус). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по тому же адресу (корпус 3). Автореферат разослан «11» октября 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, доцент Скляр Лидия Федоровна 3 Общая характеристика работы Актуальность темы. Среди вирусных заболеваний герпес занимает одно из ведущих мест. HSV I способен вызывать острую, хроническую и латентную инфекцию. Вирусы семейства Herpesviridae обладают способностью не только персистировать, но и репродуцироваться в клетках иммунной системы [Нелюбин В.Н., Мудров В.П., 2004; Pollara G. et al., 2003], приводя к гибели или снижению функциональной активности иммуноцитов [Серебряная Н.Б., 2007; Peri Р. et al., 2008; Hung S.L. et al., 2012; Kim М. et al., 2012], что способствует развитию вторичных иммунодефицитных состояний и поддерживает длительную его персистенцию [Юцковская Я.А. с соавт., 2008; Халдин А.А. с соавт., 2008; Меледина И.В., 2009; Орехов Д.С. с соав., 2010; Khanna К.М. et al., 2011]. Однако, до настоящего времени дискутабельными остаются вопросы о механизмах персистенции, латенции и реактивации герпетической инфекции [Скрипкин Ю.К. с соавт., 2008; Decman V. et al., 2005; Moraru М. et al., 2012]. Многими исследователями подчеркивается роль иммунных нарушений и дисфункций в системе цитокинов. Но, эти вопросы еще далеки от полного и окончательного решения. Важной задачей современной дерматовенерологии и косметологии является сохранение и восстановление эстетического и психосоматического здоровья человека. Для решения проблем, связанных с возрастными изменениями кожи, наибольшей популярностью пользуются малоинвазивные манипуляции, позволяющие успешно и быстро коррегировать зоны депрессий – инъекции ботулотоксина типа А. Использование БТА для в коррекции возрастных изменений кожи лица интенсивно развивается, обсуждаются традиционные зоны введения, новые показания, меняются дозы и техники введения препарата [Cote T.R. et al, 2005; Carruthers J. et al, 2006; Mejia N.I. et al, 2008]. Однако, в ряде случаев развиваются ранние и поздние осложнения, в том числе реактивация герпес-вирусной инфекции с клиническими проявлениями, как правило, в местах введения БТА, что ухудшает косметический результат [Кубанова А.А. с соавт., 2004; Халдина М.В., 2008; Brin M.F. et al., 2009; Graber E.M. et al, 2011]. Обсуждаются вопросы лечебного эффекта внутрикожного введения БТА пpи лечении головной боли, постгерпетической невралгии [Халдин А.А. с соавт., 2010; Carruthers А., Carruthers J., 2008; Arnold Р.В. et al., 4 2009; Gazerani Р. et al., 2009]. Однако, доказательная база безопасности применения ботулотоксина у пациентов с факторами риска в настоящее время недостаточна [Alam М., 2002; Borodic G., 2007]. При этом отсутствуют алгоритмы ведения пациенток с HSV I инфекцией, при проведении инвазивных процедур. Цель исследования: изучить особенности иммунного и цитокинового статуса при различных клинических вариантах HSV I инфекции и обосновать алгоритм применения ботулотоксина типа А для коррекции возрастных изменений кожи. Задачи исследования: 1. Исследовать и проанализировать клеточные показатели врожденного и адаптивного иммунитета, уровень иммуноглобулинов (IgM,G,A) у пациенток с хронической HSV I инфекцией в разные периоды болезни. 2. Определить уровень провоспалительных (TNFα, IL-2, IL-17, IFNγ) цитокинов и растворимых рецепторов (TNFα II типа, IL-2) в сыворотке крови обследованных. 3. Исследовать содержание противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10, TGFβ1) в сыворотке крови пациенток и лиц контрольной группы. 4. Провести клинические, иммунологические исследования (с оценкой иммунного и цитокинового статуса) на фоне применения ботулотоксина типа А в динамике и разработать алгоритм его применения при HSV I инфекции. Научная новизна: Установлено, что важным механизмом контроля реактивации HSV I инфекции служит повышение количества NКТ-клеток, IL-2 и его растворимого рецептора. Доказано, что функциональный дефект Тклеточного иммунитета в период ремиссии при рецидивирующей HSV I инфекции стредне-тяжелого и тяжелого течения обусловлен нарушением процессов переключения их активации с ранней на позднюю и дисбалансом в системе цитокинов. Комплексный анализ иммунного и цитокинового статуса пациенток с хронической латентной и рецидивирующей лабиальной герпетической инфекцией и здоровых людей позволил уточнить особенности иммунорегуляции и выявить ее нарушения, лежащие в основе формирования разных клинических форм герпетической инфекции. Уточнены и детализированы представления о роли нарушений иммунорегуляции в патогенезе хронической герпетической инфекции, как в период ремиссии, так и в период 5 реактивации. Дана клинико-иммунологическая характеристика и разработан алгоритм применения ботулотоксина типа А у пациенток с хронической рецидивирующей и латентной герпетической инфекцией. Практическая значимость работы. Выявлены особенности иммунорегуляции при хронической рецидивирующей и латентной HSV I инфекции. Установлены дополнительные критерии реактивации герпетической инфекции при проведении инвазивных косметических процедур. Разработаны алгоритмы применения ботулотоксина типа А у пациенток с хронической рецидивирующей и латентной HSV I инфекцией. Материалы диссертации легли в основу методических рекомендаций «Клинико-иммунологическая оценка применения ботулотоксина типа А для коррекции гипермимических морщин у женщин с герпесвирусной инфекцией I типа», утвержденных Департаментом здравоохранения Приморского края и ГБОУ ВПО ВГМУ Минздрава России, внедренных в практику работы дерматовенерологической и косметологической службы края и учебный процесс кафедр. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Иммунный статус пациенток с HSV I инфекцией вне клинического обострения характеризуется увеличением содержания NKT-клеток и удельного веса CD3+ CD25+ иммуноцитов, что свидетельствует о включении защитнокомпенсаторных механизмов и активации клеточных факторов иммунитета у этой категории больных. Выявлены особенности иммунофенотипа лимфоцитов в зависимости от особенности течения заболевания и стадии. 2. Выраженность нарушений иммунного статуса коррелирует с тяжестью рецидивирующей HSV I инфекции. При тяжелой HSV I инфекции установлена относительная недостаточность NKT-клеток, дефицит CD8+ клеток и дефект активации Т-лимфоцитов. Иммунные дисфункции носят стойкий характер, сохраняются в период ремиссии, что предопределяет необходимость иммунокоррегирующей терапии и исключение дополнительных факторов риска. 3. Цитокиновый профиль при HSV I инфекции вне обострения характеризуется Th 1 типом иммунного ответа с умеренным увеличением в сыворотке крови уровня TNFα, его растворимого рецептора II типа, IFNγ и IL-2 при снижении содержания IL-4 и IL-17. Установлены особенности цитокинового профиля 6 крови и дихотомии Т-хелперов при латентной и рецидивирующей HSV I инфекции. 4. Применение ботулотоксина типа А для коррекции гипермимических морщин не влияет на течение латентной и легкой рецидивирующей герпетической инфекции. Разработан дифференцированный алгоритм его применения при HSV I инфекции. Апробация результатов исследования. Материалы диссертации представлены и обсуждены на: VI Дальневосточном конгрессе «Человек и лекарство» (Владивосток, 2009); Х Региональной научно-практической, конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2012); Днях специалиста дерматолога, косметолога (Владивосток, 2011-2013); VI Международном форуме дерматовенерологов и косметологов (Москва, 2013); V Российском герпес-форуме (Москва, 2013); Уральском медицинском форуме тенденции «Современные развития медицинской косметологии» (Екатерингбург, 2013). Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в «перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», утвержденный ВАК. Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии планирования исследования, формирования групп пациентов, включенных в исследование, сборе материала, проведении аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, участвовала в выполнении лабораторных исследований (70%), провела интерпретацию, анализ и статистическую обработку полученных результатов. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 161 странице и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, трех глав собственных наблюдений, заключения и выводов. Список литературы содержит 312 источников, в том числе 128 отечественных и 184 иностранных авторов. Текст иллюстрирован 7 рисунками и 28 таблицами. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования 7 Клиническая часть работы выполнена на клинической базе Тихоокеанского государственного медицинского университета (ректор д.м.н., проф. Шуматов В. Б.) кафедр патологической физиологии и дерматовенерологии, косметологии и за период с 2010 по 2013 годы. Иммунологические исследования проведены в научно-исследовательской лаборатории кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России (зав. кафедрой д.м.н., проф. Маркелова Е. В.), а также в лаборатории ФГБУ «Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова» СО РАМН (зав. лаб. – д.м.н., Кузнецова Т.А.). Показатели цитокинового статуса определялись на базе лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН (зав. отделом, д.х.н., проф. Лукьянов П. А.). С учетом цели и поставленных задач, исследование состояло из 2 этапов: 1 этап – анализ особенностей иммунного статуса у женщин основной группы, учитывая критерии включения/исключения; 2 этап: оценка ботулотерапии в группах сравнения. На первом (открытом, сравнительном, проспективном) этапе в исследование были включены 150 пациенток с герпетической инфекцией. Комплексное клинико-лабораторное обследование проводили в амбулаторных условиях по единой программе. Материалами исследования служили данные амбулаторных карт и анкетирования обследуемых женщин. Проводили визуальную оценка кожи и слизистых оболочек, учитывали площадь поражения. Все женщины были консультированы гинекологом, у них были исключены заболевания, в том числе, инфекции, передаваемые половым путем. По характеру течения герпетической инфекции было выделено две группы: с клиническими проявлениями HSV I инфекции (64 чел.) и латентным ее течением (86 чел.). При этом пациентки с клиническими проявлениями были подразделены по степени тяжести на 3 группы: легкое течение (до 3 рецидивов в год – 24 чел.), средний степени тяжести (4-6 рецидивов в год – 22 чел.), тяжелое течение (7 и более рецидивов в год – 18 чел.). Обследование пациенток этой группы на I этапе проводили дважды: в период обострения и ремиссии. К пациенткам с латентной герпетической инфекцией относили женщин, имеющих в анамнезе один или несколько рецидивов лабиального герпеса более 1 года назад. На момент обследования в их крови были обнаружены антитела IgG 8 и/или IgM к ВПГ I и/или положительная ПЦР на антиген ВПГ I: I – с наличием анти ВПГ I антител IgG, их авидностью более 50% и отрицательной ПЦР на ДНК ВПГ (38 чел.); II – с обнаруженными в сыворотке крови противогерпетическими антителами IgG и положительной ПЦР на ВПГ I (22 чел.), авидностью антител IgG ВПГ до 50%; III – с обнаруженными в сыворотке крови антителами к ВПГ IgM и IgG, а также положительной ПЦР на ВПГ I (26 чел.). Группой сравнения служили 50 женщин (практически здоровых добровольцев, сопоставимых по возрасту), в анамнезе которых не было герпетической инфекции и в крови отсутствовали антитела к ВПГ. На втором этапе исследований пациентки с латентной HSV I инфекцией (42 человека) и с рецидивирующим герпесом (24 человека) были включены в группу, получавших с целью коррекции возрастных изменений кожи лица БТА. На этом этапе исследования пациентки с тяжелым течением HSV I инфекции не были включены из-за выраженных иммунных нарушений, требующих иммунокоррекции, которая не входила в задачи нашего исследования. Контролем служили пациентки с соответствующими клиническими вариантами HSV I инфекции, которые не получали БТА. В качестве материала для иммунологических исследований использовали цельную кровь, сыворотку венозной крови здоровых добровольцев и пациенток с ГВИ. Наблюдение за пациентками осуществлялось в течение года. Безопасность, терапевтическую эффективность ботулинотерапии оценивали через 21 день, и ежемесячно по результатам клинической картины (частота и время развития рецидива после проведенного курса лечения и ботулинотерапии). Лабораторные исследования включали анализы цитокинового и иммунного статуса исходно (для пациенток с рецидивирующей HSV I инфекцией забор крови проводился дважды в период рецидива и ремиссии не менее чем через 1 месяц после рецидива) и через 21 день II этапа. Оценивали динамику клинических проявлений HSV I инфекции, показателей иммунного статуса и цитокинового профиля сывороток крови, а также характер гипермимических и удельный морщин. вес Все побочных явлений экспериментальные БТА и терапии клинические исследования проведены с разрешения комитета по биомедицинской этике ГБОУ ВПО «ВГМУ Минздравсоцразвития РФ» (протокол № 2 от 19.ХI. 2011 г.). 9 Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии (цитофлуориметр FACScan, Becton Dickinson) с использованием моноклональных антител к кластерам дифференцировки с двойной меткой (Bekman Coulter, Франция), расчитывая удельный вес клеток (%) и их абсолютное содержание в литре. Уровень иммуноглобулинов основных классов в сыворотке крови оценивали методом твердофазного ИФА с помощью специфических тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск), содержание выражали в г/л. Определение уровня TNF-α, его растворимого рецептора II типа (SRTNFα p75); IL-2, его растворимого рецептора (SRIL-2), IL-17, IFN-γ, IL-4, IL-10, TGFβ1, в сыворотке крови проводили с помощью специфических реактивов фирмы «R&D Diagnostics Inc.» (США) методом ИФА, согласно прилагаемых инструкций. Учет результатов производили с помощью анализатора «Multiscan» (Финляндия). Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пг/мл. Математическая обработка полученных показателей: предварительно, используя критерий Шапиро-Уилка, определяли характер распределения исследуемых показателей. Из числа основных характеристик для исследуемых групп при нормальном распределении количественных признаков вычисляли среднюю арифметическую (М) и средние квадратическое отклонение (σ). При ненормальном распределении и малом числе наблюдений описание проводили через медиану (Ме), нижний и верхний квартиль. Статистическую достоверность различий между сравниваемыми группами определяли по таблицам Стьюдента или методу Манна–Уитни (для несвязанных групп), Вилкоксона (для связанных групп). Для определения направления и формы связи между признаками, использовали методы корреляционного анализа – коэффициент ранговой корреляции Спирмена, коэффициент корреляции Пирсона, критерий χ². При оценке терапии использовали метод относительного риска (RR) - сравнение в двух группах вероятности (риска) развития рецидива заболевания [Реброва О.Ю., 2006]. Результаты исследований. Показатели иммунного статуса у больных герпетической инфекцией. При комплексной оценке иммунного статуса пациенток HSV I инфекцией не было выявлено статистически значимых различий в абсолютном содержании Т10 и В-лимфоцитов у обследованных женщин с ГВИ, по сравнению с контролем. Абсолютный уровень CD3+ CD4+ лимфоцитов также статистически значимо не отличался от контрольных значений. Только у 12% (18 чел) удельный вес CD3+ CD4+ лимфоцитов был ниже референсных значений, а у 6 чел (4%) – превышал их. Не выявлено достоверных изменений содержания цитотоксических Т-лимфоцитов у женщин с ГВИ по сравнению с контролем. Однако у 19 чел (12,67%) их содержание было низким. Расчет ИРИ (CD3+CD4+/CD3+CD8+) не позволил установить статистически значимых различий с конрольной группой, что в целом свидетельствует об удовлетворительной количественной характеристике Т-клеточного иммунитета у обследованных женщин с ГВИ. Информативные результаты получены при определении содержания NKT клеток, относящихся к факторам врожденного иммунитета. Эти лимфоциты обладают свойствами как Т-лимфоцитов, так и NK-клеток. Помимо цитотоксической функции они выполняют роль практически единственного источника цитокинов (в первую очередь IFNγ) на первом этапе реакции на внедрение вирусов. Кроме того они могут выполнять регуляторную функцию, ограничивая интенсивность иммунного ответа [Ярилин А.А., 2010]. Определено статистически значимое увеличение количества CD3+ CD16+ CD56+ лимфоцитов в периферической крови женщин с ГВИ (7,17±1,37% и 0,16±0,05х10 9/л против 3,44±0,06% и 0,07±0,02х109/л в контроле, р<0,05), что свидетельствует о включении защитно-компенсаторных механизмов и активации клеточных факторов врожденного иммунитета. В то же время у обследованных выявлены признаки хронической Т-клеточной активации, сопряженной с увеличением лимфоцитов, экспрессирующих ранний активационный рецептор к интерлейкину-2 (CD25). При этом увеличено и содержание CD25+ лимфоцитов, и удельный активационных вес CD3+ маркеров CD25+-Т-клеток. нарушена, так Однако, как экспрессия уровень поздних лимфоцитов, экспрессирующих антигены главного комплекса гистосовместимости II класса (HLA-DR) и апоптический маркер CD95/Fas, не отличался от их значений в контрольной группе. Лишь у части обследованных женщин с ГВИ (23 чел/15,33%) процессы сопряженности ранней и поздней активации лимфоцитов не были нарушены. При анализе иммуноглобулинов основных классов и 11 качественных показателей фагоцитоза не зафиксировано существенных их отличий от референсных контрольных величин. При оценке основных показателей иммунного статуса пациенток с разными клиническими формами герпетической инфекции был выявлен ряд закономерностей. Анализ CD3+ CD19- Т-лимфоцитов позволил констатировать, что при латентной ГВИ их содержание не отличалось от значений контроля, тогда как у пациенток с рецидивирующей ГВИ средней степени тяжести отмечалось относительное снижение CD3+ CD19- клеток, но показатели не выходили за пределы референсных пределов. При тяжелом течении HSV I инфекции зафиксирована недостаточность лимфоцитов, экспрессирующих CD3+ рецептор. При этом различия удельного веса Т-лимфоцитов были статистически достоверными по сравнению с контролем, пациентками с латентной ГВИ и легким течением рецидивирующей герпетической инфекции (р<0,05). Однако, абсолютное содержание CD3+ CD19- лимфоцитов при тяжелом течении ГВИ в целом было в пределах нормы и только у 33,33% (6 чел.) определен дефицит Тлимфоцитов. При анализе доли и абсолютного содержания Т-хелперов (CD3+ CD4+) и Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+ CD8+) не установлено существенных различий их уровня при разных формах латентной и рецидивирующей ГВИ. Средние показатели были в пределах референсных величин. Не выявлено также различий значений иммунорегуляторного индекса у пациенток анализируемых групп. Удельный вес и абсолютное содержание В-лимфоцитов (CD3- CD19+) варьировали мало, только при тяжелом течении ГВИ зафиксирована тенденция увеличения доли В-лимфоцитов. Не установлено различий уровня NК-клеток в зависимости от особенностей течения герпетической инфекции, тогда как при анализе содержания минорной популяции лимфоцитов, одновременно экспрессирующих маркеры CD3+ CD19+ CD56+ и относящихся к NKT-клеткам, определено, что при латентном течении ГВИ содержание этих лимфоцитов статистически значимо возрастает. При рецидивирующей инфекции их количество не отличается от контрольных величин, но значимо (р<0,05-0,01) ниже, чем при латентной ГВИ. По нашему мнению, это свидетельствует об относительном дефиците NKT клеток при рецидивирующей инфекции. При анализе иммуноцитов, экспрессирующих маркеры ранней и поздней активации, 12 установлено, что при латентной ГВИ нет различий уровня CD25+ и CD3+ CD25+, HLA-DR+ лимфоцитов. Их количество не отличается от референсных величин, тогда как содержание CD3+ HLA-DR+ было повышено в I подгруппе, а CD95+ лимфоцитов у пациенток I и II подгрупп, напротив, снижено как по удельному весу, так и в абсолютных величинах. При рецидивирующем течении ГВИ в период ремиссии выявлено увеличение лимфоцитов, в том числе CD3+ клеток, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2 (CD25+), особенно при среднетяжелом и тяжелом течении инфекции. При этом уровень иммуноцитов, экспрессирующих маркеры поздней позитивной активации (HLA-DR+ и CD3+ HLA-DR+) не изменялся, как по сравнению с контролем, так и по сравнению с пациентками с латентной герпетической инфекцией. Это свидетельствует о нарушении переключения процессов активации с ранней на позднюю, что, вероятно, отражает функциональный дефект Т-клеточного иммунитета в период ремиссии при рецидивирующей герпетической инфекции среднетяжелого и тяжелого течения. Следует отметить также, что у пациенток, с частотой рецидивов ГВИ более 7 раз в год зарегистрировано увеличение содержания CD3+ CD95+ лимфоцитов (р<0,05-0,01), что может быть одним из механизмов гибели Тлимфоцитов. При оценке гуморального иммунитета не выявлено существенных различий уровня IgM в зависимости от клинического течения ГВИ. Содержание IgG было более высоким при тяжелом течение ГВИ (12,00±1,69 г/л, р<0,05), но не выходило за пределы референсных величин. Уровень IgA был снижен у пациенток с латентной ГВИ III подгруппы, вероятно, это один из механизмов нарушения контроля реактивации ВПГ. Анализ количественных показателей фагоцитоза не установил различий в числе активных фагоцитов в зависимости от клинической формы ГВИ. В период ремиссии фагоцитарное число было снижено только в группе пациенток с тяжелым течением рецидивирующего герпеса. На следующем этапе исследований у всех обследованных пациенток с рецидивирующей HSV I инфекцией анализ иммунограмм был проведен в период обострения болезни (на 2-3 день). Установлено, что при легкой и средней степени тяжести HSV I инфекции в период обострения большинство исследованных показателей не выходит за пределы референсных величин. Следует отметить только увеличение содержания клеток, эксресирующих 13 рецепторы к IL-2 (CD25+) в обеих группах и снижение иммуноцитов с CD95+ антигеном при легкой степени тяжести. При тяжелой HSV I инфекции в период рецидива определен дефицит цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), увеличение иммунорегуляторного индекса, нарушение переключения активации иммунокомпетентных клеток с ранней на позднюю (с дефицитом HLA-DR+) и повышение уровня Ig G (в пределах референсных величин). Цитокиновый профиль рецидивирующей и сыворотки латентной крови HSV I у пациенток инфекцией. с Результаты сравнительного анализа провоспалительных цитокинов в сыворотке крови обследованных пациенток с ГВИ и женщин контрольной группы представлены в таблице 1. Установлено существенное (в среднем 3 раза, р<0,001) повышение TNFα в сыворотке крови обследованных с герпетической инфекцией. Следует отметить выраженную вариабельность индивидуальных значений данного цитокина (от 0,4 до 1251,31 пг/мл), что вероятно, связано с гетерогенностью вариантов клинического течения заболевания. Наряду с увеличением TNFα определено снижение уровня его растворимого рецептора II типа (р75), который способен связывать избыток цитокина и нивелировать его биологическую активность. Зафиксировано снижение содержания IL-17 в сыворотке крови женщин с герпетической инфекцией (2,55 пг/мл (1,63;9,19 пг/мл) против 10,96 пг/мл (2,97;26,31 пг/мл, р<0,01)). В то же время количество IFNγ в сыворотке крови женщин с HSV инфекцией было выше, чем в контроле (р<0,01). Установлено статистически значимое увеличение уровня IL-2 (р<0,001). При этом изменений SRIL-2 в сыворотке крови пациенток с ГВИ по сравнению с контрольной группой не было. При более углубленном анализе влияния особенностей течения инфекционного процесса на систему провоспалительных цитокинов был установлен ряд закономерностей. Повышение TNFα определено при всех клинических формах рецидивирующей ГВИ. Зафиксирована прямая корреляция гиперпродукции TNFα и тяжести рецидивирующей герпетической инфекции (r1=0,69; r2=0,78; r3=0,9; р<0,05-0,001) . Таблица 1 Цитокиновый профиль сыворотки крови обследованных в основной (пациентки с ГВИ) и контрольной группах № n/n 14 Показатели (Ме; Q25;Q75) пг/мл Группа контроля (n=50) Основная группа (n=150) 1 ТFNα 3,83 13,20 (2,19;6,67) (4,38;23,29)*** 2 2600,00 2143,77 SRТNFαp75 (2550,00;2989,40) (1866,59;2787,60)* 3 IL-2 1,75 28,26 (0,2;13,49) (6,12;313,23)*** 4 277,55 228,95 SRIL-2 (119,63;429,00) (145,52;574,81) 5 IL-17 10,96 2,55 (2,97;26,31) (1,63;9,19)** 6 IFNγ 12,52 25,54 (7,4;27,52) (2,27;72,29)** 7 IL-10 11,77 8,17 (4,70;23,19) (1,19;74,68) 8 IL-4 9,28 2,62 (5,0;10,60) (1,14;8,40)* 9 TGFβ1 19,92 19,48 (14,86;24,06) (16,27;22,90) Примечание: статистическая достоверность различий показателей с группой контроля: р<0,05 - *; р<0,01 - *; р<0,001 - ***. При латентной ГВИ и легкой степени тяжести рецидивирующей ГВИ уровень SRTNFα р75 не отличался от значений в контроле. При средней степени тяжести и тяжелой рецидивирующей ГВИ определена недостаточность продукции растворимых рецепторов TNFα II типа. Как уже отмечалось выше, это способствует усилению биологической активности TNFα и еще раз подтверждает факт его гиперпродукции. Установлено, что при латентном течении, независимо от лабораторных признаков активация HSV I, уровень IL17 не изменялся, и содержание его было в пределах референсных величин (р>0,05). При рецидивирующей HSV I инфекции получены иные данные: при легкой и средней степени тяжести был зафиксирован дефицит этого медиатора (р<0,05), а при тяжелой – несмотря на вариабельность значений (0,41; 489,27 пг/мл), констатирована гиперпродукция IL-17. Расчет χ2 позволил определить, что уровень IL-17, превышающий 30 пг/мл, у женщин с анамнезом HSV I инфекции, может быть дополнительным критерием тяжелого течения рецидивирующей HSV I инфекции (χ2 =7,36; р<0,0067). Констатирована относительная недостаточность IFNγ при тяжелом течении рецидивирующей ГВИ, его содержание в сыворотке крови только в этой группе пациенток не отличалось о референсных величин и было статистически значимо ниже, чем у пациенток с латентной ГВИ, рецидивирующей ГВИ легкой средней и степени тяжести (р<0,05-0,01). У пациенток остальных групп уровень IFNγ был 15 статистически значимо повышенным как по сравнению с контролем, так и по сравнению с пациентками тяжелой ГВИ. Установлено повышение уровня растворимых рецепторов IL-2 в сыворотке крови у пациенток с латентной ГВИ I и II подгрупп и при легком течении рецидивирующей герпетической инфекции. У женщин с рецидивирующей ГВИ средней степени тяжести и в III подгруппе латентной инфекции содержание SRIL-2 не отличалось от значений в контроле, тогда как при тяжелом течении ГВИ уровень SRIL-2 был статистически значимо снижен 169,08 пг/мл (101,25; 351,10 пг/мл, р<0,05-0,01), что свидетельствует о нарушениях процессов активации лимфоцитов у этой категории больных. При оценке уровня противовоспалительных цитокинов не зафиксировано статистически значимых различий содержания IL-10 и TGFβ1 в сыворотке крови пациенток с ГВИ по сравнению с контрольной группой (рис. 1). Уровень IL-4, несмотря на вариабельность значений у обследованных пациенток с ГВИ, оказался ниже (р<0,05), чем в контроле 2,62 пг/мл (1,14; 8,40 пг/мл) против 9,28 пг/мл (5,0; 10,60 пг/мл) соответственно. пг/мл Р<0.05 1 – IL-10 контроль 2 – IL-10 пациентки 3 – IL-4 контроль 4 – IL-4 пациентки 5 – TGFβ контроль 6 – TGFβ пациентки Рис. 1. Содержание противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови обследованных в основной (пациенты с ГВИ) и контрольной группах В подгруппах с рецидивирующей HSV I инфекцией уровень противовоспалительных цитокинов оказался более гетерогенным и зависел о степени тяжести инфекции: при легкой степени тяжести количество IL-10 было 16 статистически значимо выше, чем в контроле и у пациенток двух других групп. При этом у пациенток с рецидивирующей HSV I инфекцией средней тяжести содержание IL-10 в сыворотке крови было в пределах нормы, а при тяжелом течении определен дефицит IL-10. При оценке показателей IL-4 в сыворотке крови обследованных с рецидивирующей HSV I инфекцией зафиксирован его дефицит у пациенток с рецидивирующей HSV I инфекцией средней степени тяжести и тяжелого течения. Установлено статистически значимое снижение TGFβ1 при тяжелом течении HSV I инфекции по сравнению с контролем и латентным ее течением (рис. 1). Известно, что важен не только факт количественных изменений уровня про- и противовоспалительных цитокинов, но и особенности их соотношений. Расчет коэффициента Th1/Th2 маркерных цитокинов (IFNγ/IL-4) не позволил выявить принципиальных различий в типах иммунного реагирования при разных клинических вариантах HSV I инфекции. Во всех группах в большей или меньшей мере установлено превалирование Th 1 типа иммунного ответа. В связи c этим была рассчитана доля каждого из исследованных медиаторов в сыворотке крови в зависимости от особенностей течения HSV I инфекции (рис. 2). Обозначения: Латентная HVS I инфекция, группы: инфекция: I – с наличием анти ВПГ I антител IgG II – с антителами IgG и положительной ПЦР на ВПГ I III – с антителами к ВПГ IgM и IgG и положительной ПЦР на ВПГ I Рецидивирующая HVS I легкая степень тяжести средняя степень тяжести тяжелая степень 17 Рис. 2. Цитокиновый профиль сывороток крови пациенток с разными клиниколабораторными проявлениями HVS I инфекции Результаты проведенного анализа позволили выявить особенности цитокинового профиля сывороток крови пациенток с разными клиниколабораторными проявлениями латентной и рецидивирующей HSV I инфекции в период ремиссии. Профиль цитокинов при латентной инфекции у пациенток I подгруппы характеризовался умеренным увеличением доли IL-2, IL-10, и снижением IL-4. Во II и III подгруппах определено существенное нарастание доли IL-2 и относительное снижение противоспалительных цитокинов (IL-10 и TGFβ1). У пациенток с хронической рецидивирующей HSV I инфекцией цитокиновый профиль зависел от степени тяжести инфекции. При легкой степени тяжести HSV I инфекции определяли двукратное увеличение доли IL10, существенное увеличение IL-2 и TNFα при снижении IL-17, IL-4 и TGFβ1. При средней степени тяжести зафиксировано увеличение доли IFNγ, TNFα, IL-2 при снижении IL-17, IL-4, IL-10. Иная картина выявлена при тяжелом течении HSV I инфекции. Основным в цитокиновом профиле было превалирование TNFα (почти в 8 раз) при дефиците IL-2, IFNγ, IL-10, IL-4, TGFβ и нормальном удельном весе IL-17. Учитывая выявленные нарушения цитокинового профиля сывороток крови женщин с рецидивирующей HSV I инфекцией в период ремиссии, нами обследованы те же пациентки в период обострения заболевания. Установлено, что у пациенток, с HSV I инфекцией легкой степени в период обострения умеренно увеличивался уровень TNFα при одновременном увеличении его растворимого рецептора, что обуславливает регуляцию процессов активации клеток. При этом не выявлено значимых изменений содержания IL-2 и его растворимого рецептора у этих пациенток. Уровень IL-17 возрастал (р<0,01) по сравнению с периодом ремиссии, достигая значений контрольной группы. Установлено также увеличение IFNγ (р<0,05). Анализ противовоспалительных цитокинов позволил выявить снижение IL-10 (до уровня контроля) в период обострения по сравнению с ремиссией. Существенных различий в количестве IL-4 и TGFβ1 в крови пациенток в период обострения не выявлено. 18 При анализе цитокинового профиля сывороток крови пациенток с HSV I инфекцией средней тяжести в период обострения зарегистрировано статистически значимое повышение содержания TNFα (25,17 пг/мл против 19,89 пг/мл) и его растворимого рецептора (2234,33 пг/мл против 2001,01 пг/мл), однако уровень последнего оставался ниже контрольных значений. Зафиксировано увеличение IL-17 как по сравнению с периодом ремиссии (р<0,01), так и с референсными величинами (р<0,05), тогда как уровень IFNγ в период обострения снижался по сравнению со стадией ремиссии. Определено относительное повышение (до контрольных значений) содержания IL-4 в сыворотке крови женщин с HSV I инфекцией средней степени тяжести по сравнению с периодом ремиссии. Количество IL-10 и TGFβ1 в крови не зависело от стадии болезни. При тяжелом течении HSV I инфекции изменения цитокинового профиля касались практически всех изученных показателей. Установлено существенное (в 2 раза по сравнению со стадией ремиссии и в 20 раз по сравнению с контролем) повышение TNFα в сыворотке крови при одновременном дефиците его растворимых рецепторов II типа. Выявлено снижение IL-2 по сравнению со стадией ремиссии (р<0,05) и дефицит его растворимого рецептора (р<0,05-0,01). Содержание IL-17 было повышенным по сравнению с контролем (р<0,05), но не отличалось от стадии ремиссии. Выявлен дефицит IFNγ (р<0,05). Определено увеличение уровня IL-10 и IL-4 как по сравнению со стадией ремиссии, так и по его сравнению с контролем, при этом зафиксирован дефицит TGFβ1 у этой категории пациенток. Клинико-иммунологическая оценка применения ботулотоксина типа а для коррекции гипермимических морщин у женщин с HVS I инфекцией. При оценке влияния БТА терапии гипермимических морщин у женщин, включенных в исследование, через год ретроспективно был проведен анализ риска возникновения рецидива HSV I инфекции. Установлено, что относительный риск развития рецидива HSV I инфекции достигал 1,85 у пациенток с рецидивирующей инфекцией средней степени тяжести. Его результаты потребовали дополнительного III этапа исследования: пациенткам с HSV I инфекцией средней степени тяжести за 2 дня до БТА терапии 19 гиперкинетических морщин назначали валацикловир в дозе 500мг два раза в день (курсовая доза 5г). Анализ клинической эффективности БТА терапии гипермимических морщин у пациенток с латентной и рецидивирующей HSV I инфекцией позволил констатировать, что при I классе изменений мягких тканей лица отличная эффективность воздействия на мимические морщины в среднем составила 88,9%. При втором классе возрастных изменений мягких тканей лица отличные результаты достигнуты в среднем в 72,9%, хорошие – в 20,8%; удовлетворительные – в 6,3%. Не выявлено неудовлетворительных результатов. Существенных различий частоты побочных явлений в обследованных группах пациенток с HSV I инфекцией, в том числе и в зависимости от возраста не выявлено. Наиболее часто в течение трех дней после процедуры отмечались кратковременная эритема (21,7-36,4%), боль в месте введения (21,0-34,8%), отеки век (15,4-27,3%). Лишь в 1 случае был определен сухой кератокнъюнктивит. Птоз бровей выявлен в среднем в 6,1% случаев. Не выявлено случаев пареза мышц лица, слабости зрения, аллергических реакций. Не установлено значимых изменений уровня исследованных про- и противовоспалительных цитокинов на фоне применения БТА при латентной и рецидивирующей HSV I инфекции легкой степени тяжести, тогда как при рецидивирующей HSV I инфекции средней степени тяжести было определено увеличение (р<0,05) уровня TNFα в крови пациенток, получавших БТА для коррекции гипермимических морщин. Повышение его уровня коррелировало (r=0,82; р<0,05) с развитием рецидива в течение 21 дня после инъекции. В связи с полученными результатами на III этапе исследований пациентки с рецидивирующей HSV I инфекцией средней степени тяжести принимали профилактический курс валацикловира (0,5 два раза в день) за два дня до процедуры и далее в течение трех дней. Оценка клинических критериев не выявила существенных различий в частоте побочных явлений по сравнению с II этапом. Не определено значимых различий показателей иммунного статуса и цитокинового профиля сывороток крови этих пациенток. Относительный риск рецидива HSV I инфекции составил 0,9. Проведенные исследования позволили разработать алгоритм ботулинотерапии гипермимических морщин на фоне HSV I инфекции (рис. 3). 20 Рис. 3. Алгоритм ботулинотерапии гипермимических морщин на фоне HSV I инфекция ВЫВОДЫ 1. У женщин с латентной HSV I инфекцией установлено увеличение NKT-клеток и дефицит CD95+ лимфоцитов, особенно в молодом возрасте. При рецидивирующем течении HSV I инфекции в период ремиссии выявлен относительный дефицит NKT-лимфоцитов, повышение количества CD3+CD25+ и CD25+клеток, особенно при тяжелом течении заболевания, повышение CD3+CD95+ в крови последних. При этом содержание HLA-DR+ и HLA-DR лимфоцитов было в пределах референсных величин. 2. При латентной HSV I инфекции на фоне нормального уровня большинства исследованных цитокинов определено увеличение IL-2, IFNγ и IL10. У серопозитивных женщин с отсутствием признаков репликации вируса установлено увеличение доли IL-2, IL-10 при относительном снижении – IL-4. У женщин с признаками репликации вируса определена гиперпродукция IL-2, снижение удельного веса IL-10, TGFβ. 3. Рецидивирующая HSV I инфекция в период ремиссии характеризуется нарушениями в цитокиновом профиле крови: установлено увеличение TNFα и IL-2 на фоне снижения содержания их растворимых рецепторов, снижение IL-4 и IL-17. Выраженность и характер нарушений сопряжены с тяжестью заболевания. При легкой HSV I инфекции установлено одновременное увеличение TNFα, IL-2 и их растворимых рецепторов, что отражает сбалансированность процессов активации клеток. При средней степени тяжести рецидивирующей HSV I инфекции 21 определено повышение TNFα, дефицит его рецептора II типа, повышение IL-2 при нормальном количестве его растворимых рецепторов. Цитокиновый профиль характеризуется усилением Th 1 дихотомии: повышается доля IFNγ, TNFα и IL-2, определяется относительная недостаточность IL-10 и абсолютный дефицит IL-4, IL-17. Тяжелая HSV I инфекция характеризуется усугублением нарушений процессов иммунорегуляции: гиперпродукцией TNFα, дефицитом его растворимых рецепторов II типа, снижением (до референсных величин) IL-2, дефицитом его растворимых рецепторов, дефицитом IFNγ, IL-10, IL-4, TGFβ1. 4. При рецидиве HSV I инфекции легкой степени тяжести выявлено умеренное увеличение продукции провоспалительных цитокинов и снижение IL10. При рецидиве HSV I инфекции средней степени тяжести изменения цитокинового профиля характеризуется увеличением противовоспалительных доли медиаторов (IL-4, IL-10), снижением IFNγ на фоне высокого содержания TNFα, IL-2, IL-17. При тяжелой HSV I инфекции в период рецидива определена гиперпродукция TNFα, IL-10, IL-4; дефицит SRTNFα, SRIL-2, IFNγ, TGFβ1, что свидетельствует о глубоких нарушениях иммунорегуляции и переключении на Th 2 тип иммунного ответа. 5. Доказана клинико-иммунологическая безопасность примнения БТА для коррекции гипермимческих морщин у женщин с латентной и рецидивирующей HSV I инфекцией легкой степени тяжести в период ремиссии. Установлено повышение относительного риска рецидива HSV I инфекции у женщин с рецидивирующей HSV I инфекцией средней тяжести, в 1,85 раза. Разработан алгоритм применения БТА для коррекции гипермимических морщин при HSV I инфекции вне обострения. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ 1. Прогностическое значение имеет определение TNF α. Его уровень, превышающий 29 пг/мл, использовать в качестве критерия развития рецидива при проведении инвазивных косметологических процедур. 2. Применение БТА терапии гипермимических морщин у женщин с латентной и легкой степенью тяжести рецидивирующей HSV I инфекции не 22 влияет на частоту и характер побочных явлений, частоту рецидивов HSV I инфекции и исследованные показатели врожденного и адаптивного иммунитета. 3. У пациенток со средней степени тяжести HSV I инфекции относительный риск возникновения рецидива при применении БТА составил 1,85. Рекомендуется профилактическое использование валацикловира в дозе 500 мг 2 раза в день, начиная за 2 дня до введения БТА, курсовая доза 5 г. БТА вводится им согласно инструкции по применению, в средней дозе 120-150 ед. 4. Не рекомендуется использовать БТА для коррекции гипермимических морщин у пациенток с тяжелой рецидивирующей HSV I инфекцией из-за выраженных нарушений цитокиновой регуляции и иммунного статуса, что предопределяет применение пролонгированной противовирусной и иммуномодулирующей терапии. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Юцковская Я.А., Сайбель А.В., Дворянинова И.Е., Зиганшина Т.А. Коррекция круговой мышцы глаза с применением препарата Диспорт // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. –2011. -№2. – С.25-30 2.Маркелова Е.В., Сайбель А.В., Красницкая А.С. Современные представления о процессах латенции и реактивации герпесвирусов 1 типа // Фундаментальные исследования. – 2012. - №12 (2). – С. 418-425 3.Маркелова Е.В., Сайбель А.В., Гапоненко Е.К. Роль цитотоксических лимфоцитов в патогенезе герпетической инфекции // Российский аллергологический журн. – 2013. - №2,(2) – С. 189-190. 4.Маркелова Е.В., Сайбель А.В., Красницкая А.С., Гапоненко Е.К. Герпетическая инфекция: дискутабельные вопросы диагностики и лечения // Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии. – Владивосток: ИПК МГУ им. акад. Г.И. Невельского, 2012. – С. 21-25. 5.Сайбель А.В., Тимошенко Е.В., Юцковская Я.А. Нестандартное использование препаратов ботулотоксина типа А: лифтинг груди // Инъекционные методы в косметологии. – 2010. - №4. – С.42-45 6.Юцковская Я.А., Сайбель А.В., Еременко И.Е., Бирко О.Н. Прогнозирование результатов ботулинотерапии (препарат Диспорт) в верхней трети лица // Эстетическая медицина. – 2011. - №3. – С. 363-367 23 7.Сайбель А.В., Юцковская Я.А., Таран М.Г., Бирко О.Н. Гендерные особенности ботулинатерапии // Новель эстетик Украина. – 2011. - №3. – С. 4656 8.Сайбель А.В., Юцковская Я.А., Орлова О.Р., Кизей И.Н. Сочетание аппаратных методов и ботулинотерапии: механизмы взаимодействия // Вестник эстетической медицины. – 2012. – Т.11,№1. – С.68-75 9. Клинико-иммунологическая оценка применения ботулотоксина типа А для коррекции гипермимических морщин у женщин с герпесвирусной инфекцией I типа / Маркелова Е.В., Юцковская Я.А., Сайбель А.В., Бирко О.Н. // Владивосток : ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского, 2013. – 17 с. Список сокращений БТА – ботулотоксин типа А ВПГ – вирус простого герпеса ГВИ – герпесвирусная инфекция ИРИ – иммунорегуляторный индекс CD – кластер дифференцировки HLA-DR+ – маркер поздней активации лимфоцитов HSV – herpes simplex virus (вирус простого герпеса) IFN – интерферон IgM,G,A – иммуноглобулины NK – натуральные киллеры sR – растворимые рецепторы sTNF RII – растворимый рецептор к фактору некроза опухоли II типа TGF – трансформирующий фактор роста TNF – фактор некроза опухоли 24 Сайбель Анастасия Валерьевна КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОНИЧЕСКОЙ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ И ЛАТЕНТНОЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ И ОБОСНОВАНИЕ АЛГОРИТМА БОТУЛИНОТЕРАПИИ НА ЕЕ ФОНЕ Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 01.10.2013. Формат 60х84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №343 Отпечатано в типографии ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского 690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а
