Конференция X гемосорбция ИПГ Жандосов

Реклама
ЭЛИМИНАЦИЯ АЛЬБУМИН-СВЯЗАННЫХ
УРЕМИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ И ИНТЕРЛЕЙКИНОВ
УГЛЕРОДНЫМИ НАНОСОРБЕНТАМИ
ИЗ ПЛАЗМЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Ж.М. Жандосовa, З.А. Мансуров a, А.Ж. Байменовa, Д.М. Уразаеваa,
C. H. Howellb, S.V. Mikhalovskyb,с
a
Институт Проблем Горения, ул. Богенбай батыра 172, Алматы, Казахстан
b
University of Brighton, School of Pharmacy and Biomedical Science
c
Назарбаев Университет, пр. Кабанбай батыра 53, Астана, Казахстан
E-mail: [email protected]
Введение
Рисовая шелуха (РШ) является широко распространенной биомассой. Ежегодно во
всем мире производится более 600 млн. тонн данного вида растительного сырья. Создание
функциональных адсорбентов на её основе является экономически привлекательным, и
одновременно решает проблемы утилизации растительных отходов [1]. В частности,
адсорбенты на основе бросового сырья являются изделиями с высокой добавленной
стоимостью. Очистка крови путем гемодиализа является малоэффективным методом
элиминации высокотоксичных уремических токсинов, а именно - белковых конъюгатов
индоксилсульфата (IS) и пара-крезилсульфата (PCS), также как и воспалительных
цитокинов, в частности интерлейкинов IL6 и IL8. Хроническая болезнь почек (ХБП)
является дорогостоящим и все более распространенным заболеванием, связанным с
повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний [2-4]. Альбумин-связанные
уремические токсины (IS, PCS) накапливаются в организме и индуцируют состояние
длительного воспаления и окислительной нагрузки, ведущеее к дальнейшим нарушениям
сердечно-сосудистой, почечной и костной физиологии [5, 6]. Роль уремических токсинов,
наряду
с
воспалительными
цитокинами,
в
патофизиологии
хронического
прогрессирующего заболевания почек хорошо описана в литературе [7, 8]. Сорбционная
терапия, сочетающая применение углеродных наносорбентов (УН) с упорядоченной
пористостью, может быть использована для эффективной элиминации таких молекул,
которые плохо удаляются современной терапией гемодиализа и, таким образом может
предотвратить плохой прогноз пациентов с ХПБ.
Экспериментальная часть
Синтез углеродных материалов
Углеродные наноматериалы были синтезированы из рисовой РШ химическим
путем, который включал в себя помол смеси из РШ и K2CO3 в шаровой мельнице при двух
различных соотношениях (прибл. 22,2 и 27,8 г/моль), и последующую активацию в
инертной атмосфере в течение 0,5 и 2 ч при 950 °С для получения комбинации четырех
адсорбентов CRH-K2CO3 #1,3 и CRH-K2CO3 # 2,4 соответственно. Мезопористый
адсорбент “Mast TE 7” был получен компанией “Mast Carbon International”
(Великобритания).
Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
Исследования проводились на сканирующем электронном микроскопе SEM
(Zeiss NTS) с ускоряющем напряжением 5 кВ. Для исследований, гранулы CRH-K2CO3
закрепляли на держателе образцов. Предварительно на поверхность образцов в
специальной вакуумной установке Quorum (Q150TES) наносили тонкий проводящий слой
платины толщиной 4 нм для устранения эффектов зарядки.
Метод ртутной порометрии (МРП)
Пористую структуру образцов активированных углеродных материалов изучали
методом ртутной порометрии на порозиметре «PoreMaster 33/60» (Quantachrome
Instruments, Великобритания). Далее проводилась обработка данных порограмм (расчет
изотерм и определение объемов пор) с использованием программы «Quantachrome».
Метод низкотемпературной адсорбции азота
Информацию о микропористой и мезопористой текстуре (область от 17 до 3000 Ǻ)
образцов получали методом низкотемпературной адсорбции азота на анализаторе
Autosorb-1 (Quantachrome, Великобритания) после предварительной тренировки образцов,
проводимой при 200С в течение 3 часов. Далее проводили измерения изотерм адсорбции
азота при температуре жидкого азота 77К в диапазоне относительных давлений от 0,005
до 0,991. Далее проводили обработку данных (расчет изотерм, определение удельной
поверхности и объемов пор с использованием методов БЭТ и QSDFT) с использованием
программы «Quantachrome».
Адсорбционные исследования УН по метиленовому голубому.
Для проведения сорбционных исследований в статических условиях, готовились
исходные растворы метиленового голубого (МГ) с концентрациями 1000; 1500; 2000;
2500; 3000; 3500 и 4000 мг/л. Навески 0,1±0,001 г предварительно высушенного и
растертого в агатовой ступке УН переносили в стеклянную емкость вместимостью 100 мл,
добавляли 25 мл раствора МГ, накрывали чашкой Петри и перемешивали в течение 20
минут на магнитной мешалке. Суспензию переносили в пробирки и центрифугировали в
течение 15 минут, отбирали 5 мл осветлённого раствора для измерения оптической
плотности на фотоэлектроколориметре с использованием синего светофильтра, в кюветах
с расстоянием между рабочими гранями 10 мм. В качестве раствора сравнения
использовали дистиллированную воду. В случае если оптическая плотность раствора
составляла больше, чем 0,8 оптических единиц, то, для соблюдения закона БугераЛамберта-Бера раствор разбавляли в 10 раз дистиллированной водой. По значению
оптической плотности, используя градуировочный график, определяли остаточную
концентрацию МГ в растворе.
Адсорбционную способность УН по МГ (qе) вычисляли по формуле:
qе= 0,025(С0 – kСе)/m
(1)
где С0 – концентрация исходного раствора красителя (мг/л); Се – концентрация
раствора после сорбции (мг/л); k – коэффициент разбавления; m - масса УН (г). По
результатам экспериментов, в координатах Ce/qe-Ce построены изотермы адсорбции
Лангмюра в линеаризованной форме, имеющей следующий вид:
Ce
qe

1
qmax K 1

Ce
qmax
(2)
Значения сорбционной емкости (qmax)- емкости монослоя МГ рассчитывали графически.
Методика определения йодного числа
В данной работе йодное число (IN) определялось в соответствии со стандартом
ASTM D4607-94. При этом определяется количество йода в мг, которое может
адсорбироваться 1 г активированного угля. Методика определения йодного числа
основана на использование сорбционной модели Фрейндлиха, согласно следующим
уравнением:
1
𝑞 = 𝐾 ∙ 𝐶𝑛
(3)
где C – равновесная концентрация йодного раствора, К – константа Фрейндлиха,
1/n – адсорбционный показатель
Зависимость логарифма удельной адсорбции по йоду от логарифма равновесной
концентрации йода графически выражается прямой линией, отсекающей на оси ординат
отрезок, равный logК:
1
𝑙𝑜𝑔𝑞 = 𝑙𝑜𝑔𝐾 + 𝑛 𝑙𝑜𝑔𝐶
(4)
Используя тангенс угла наклона, вычисляют адсорбционный показатель (tgα = 1/n). При
условной концентрации 2,5 г/л (0,02 моль/л) рассчитывают йодное число. Методика
измерения включает в себе следующие этапы: обработка образца активированного угля
10 мл 5% HCl, упаривание от НСl, приливание 25 мл 0,1 н раствор йода к испытуемому
образцу, вакуумирование, перемешивание, центрифугирование, титрование 0,1 н
раствором тиосульфата натрия, используя крахмал в качестве индикатора йода.
Адсорбцию йода вычисляют согласно формуле:
𝐼
𝑞=
2 )∙𝑉
(𝐶0 −𝐶равн
𝑚АУ
(4)
где q – количество йода (мг), адсорбированного на 1г АУ, 𝐶0 – начальная концентрация
𝐼2
йодного раствора (приблизительно 12, 69 г/л), 𝐶равн
–равновесная концентрация р-ра йода
(найденная путем титрования р-ром Na2S2O3), г/л, 𝑉 – объем йодного раствора (25 мл),
𝑚АУ - масса активированного угля, г.
Исследование адсорбции уремических токсинов и воспалительных цитокинов
Для проведения адсорбционных исследований брали 3 навески испытуемого
сорбента по 0,02 г для каждого периода инкубации (5, 30, 60 мин). Навески помещали в
пробирки Эппендорфа, предварительно уравновешивали 800 мкл натрий-фосфатного
буфера путем перемешивания в шейкер-инкубаторе при 37 °С в течение 2 часов.
Пробирки центрифугировали при 8000 об/мин в течение 3 минут, после чего
надосадочную жидкость удаляли. Готовили раствор человеческой плазмы с PCS (1 мМ),
IS (0,5 мМ), и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 37 °С в течение 1 часа. После
инкубации, 750 μл плазмы, зараженной токсинами приливали к сорбентам и
контрольному образцу, и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 37 °С в течение 5, 30 и
60 минут. По прошествии каждого периода инкубации, надосадочную жидкость отделяли
от сорбентов путем центрифугирования, помещали в пробирки Эппендорфа и хранили
при температуре -80 °С в морозильнике.
ВЭЖХ анализ уремических токсинов PCS и IS
Высокоэффективную
жидкостную
хромотографию
проб
проводили
с
использованием колонки Fortis, Waters 717 Plus Autosampler (при 15 °С), печи Perkin
Elmer Series 200 и LC насоса (при 25 °С), флуоресцентного детектора Varian Prostar
модели 360 и интерфейса РЕ Nelson 900 Series. Метод ВЭЖХ был описан де Лоором [9] с
использованием конкурентноспособного связывания альбумина октаноатом натрия для
измерения общего количества PCS и IS находящихся в плазме.
Иммуноферментный анализ IL6 и IL8
Для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), использовали 96 ячеечный
микропланшет (ряды (А-Н) х (1-12)). Для сенсибилизации поверхности, в каждую ячейку
добавили по 100 мкл раствора (0,05 мл иммобилизованных антител, разбавленных в 12,5
мл буфера) использую ряды (А-Н)х(1-12) для стандартов и количество повторов (n=2) для
каждого экспериментального образца. Микропланшет покрыли парафильмом и поместили
на ночь в холодильник. Далее микропланшет промывали буфером (10 таблеток PBS
растворенных в 1 л дистиллированной воды с добавлением 500 мкл “Tween 20”) 3 раза,
заполнили 200 мкл разбавителя и оставили при комнатной температуре на 1 ч, после чего
снова промыли буфером 3 раза. Приготовленные растворы IL6 и IL8 добавили по 100 мкл
в 1 и 2 столбцы ячеек, затем разбавили в следующих столбцах таким образом, чтобы
концентрация раствора предыдущего образца была в два раза больше. Далее в ячейки
добавили по 100 мкл разбавленных экспериментальных образцов. После 2 ч инкубации
промывали PBS-буфером 5 раз. После этого добавили 100 мкл раствора обнаруживающих
антител меченных ферментом (авидин-HRP реагент), затем инкубировали в течение 1 ч
при комнатной температуре. Пластину промывали 7 раз PBS-буфером в течение 30
секунд. Добавили 100 мкл раствора субстрата (ТМБ) в каждую ячейку. Выдерживали в
темноте при комнатной температуре в течение 10-30 минут, затем добавили 50 мкл
закрепителя (2н H2SO4) в каждую ячейку. Измерили оптическую плотность при длине
волны 450 нм в приборе (ELISA microplate reader).
Результаты и обсуждение
СЭМ Изображения образца CRH-K2CO3 #3 показаны на Рисунке 1. Морфология
поверхности CRH-K2CO3 #3 образца характеризуется развитой структурой, имеющие
макро- и нанопористость (рис 1а – макропористая губка, рис 1б – перегородка).
(а)
(б)
Рисунок 1 – СЭМ-снимки образца CRH K2CO3 #3:
а -увеличение x20 000; б -увеличение x100 0000;
Из снимков, приведенных на рисунке 1 (а, б) видно, что текстура активированных
образцов сохранила исходную морфологию рисовой шелухи, несмотря на жесткую
химическую обработку. На рисунке 1 б видна развитая пористая поверхность образца,
содержащая наноразмерные элементы- поры
Текстурные характеристики K2CO3 активированных образцов рисовой шелухи,
полученных путем исследования методом низкотемпературной адсорбции азота
приведены в таблице 1. Образцы активированные в течение 0,5 ч (CRH-K2CO3 #1 и 3)
имеют более высокую удельную поверхности, по сравнению с образцами,
активированными в течение 2 часов.
Таблица 1 – Результаты адсорбции азота для образцов CRH-K2CO3
Образец
CRH-K2CO3 #1
CRH- K2CO3 #2
CRH- K2CO3 #3
CRH- K2CO3 #4
SБЭT
м2/г
1655
691
1272
552
SDFT
м2/г
1182
480
1178
366
VDFT
см3/г
1.6
1.2
1.0
0.6
Dпор
нм
4.0
4.0
0.6
3.3
Сравнительные данные полученные с использование различных адсорбционных
методов показаны в Таблице 2. Значения йодного числа близки к данным удельной
поверхности по БЭТ. Кроме того, большие объемы мезопор полученные методом ртутной
порометрии и большие площади поверхности по БЭТ, соответствуют максимальной
адсорбционной способности по МГ согласно модели Лангмюра.
Таблица 2 – SБЭТ, йодное число, емкость монослоя метиленового голубого и
объем мезопор по данным ртутной порометрии для образцов CRH-K2CO3
Образец
SБЭT
м2/г
CRH-K2CO3 #1
CRH- K2CO3 #2
CRH- K2CO3 #3
CRH- K2CO3 #4
1655
691
1272
552
Йодное
число
мг/г
1438
1545
-
МГ qmax
мг/г
578
259
621
272
МРП
Vмезо
см3/г
0.39
0.15
0.44
0.32
Данные ртутной порометрии для образцов из рисовой шелухи, активированной
K2CO3, полученных в Институте проблем горения были проанализированны програмным
обеспечением “Quantachrome” и предоставлены на Рисунке 2.
Рисунок 2 – Распределение пор по размерам образцов CRH-K2CO3 согласно
данным ртутной порометрии
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1 23
IS concentration remaining µM
PCS concentration remaining µM
Элиминация PCS и IS в предварительных экспериментах по кинетике адсорбции
согласно результатам ВЭЖХ анализа представлены на рисунке 3. Образцы CRH-K2CO3
#1-4 показали наибольший потенциал для элиминации токсинов. Степень сорбции
образцов CRH-K2CO3 #1 и #3 составила порядка ~ 90% PCS и ~100% IS, по сравнению со
степенью элиминации токсинов сорбентом MAST ТЕ7 (~ 50 и 57%, соответственно).
700
600
500
400
300
200
100
1
2
3
0
(а)
(б)
Рисунок 3 – Остаточные концентрации (а) PCS и (б) IS в плазме после инкубации с
углеродными образцами, в течение 5 минут (1), 30 минут (2) и 60 минут (3).
На рисунке 4 представлены молекулярные модели, вес и размер воспалительных
цитокинов IL6 и IL8.
IL6: 26kDa (5x5x12нм)
IL8: 8kDa (4x4x9нм)
Рисунок 4 – Модельные изображения интерлейкинов IL6 и IL8
Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод (рис. 5). К
носителю с иммобилизованными антителами (1) добавляют раствор, содержащий
анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе
образуется комплекс антиген-антитело (2). Затем носитель отмывают от несвязавшихся
компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела (3). После
вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют
ферментативную
активность носителя, которая пропорциональна начальной
концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического
иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами
иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого
распространения названия «сэндвич» метод (4). Ферментативная реакция (цветная
реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного
неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до
окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования (5).
Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител.
Результат оценивается спектрофотометрически и позволяют судить о концентрации
антигена в растворе (интерлейкины IL6 и IL8) .
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Рисунок 5 – Схема иммуноферментного анализа
600
500
400
300
200
100
0
1
23
IL-8 concentration (pg/ml)
IL6 concentration (pg/ml)
На рисунке 6 представлены остаточные концентрации IL6 и IL8 по результатам
предварительных экспериментах по кинетике адсорбции, согласно данным ИФА.
1400
1200
1000
800
600
2
1
3
400
200
0
(а)
(б)
Рисунок 6 – Остаточные концентрации IL6 (а) и IL8 (б) в плазме после инкубации с
образцами сорбентов в течение 5 минут (1), 30 минут (2) и 60 минут (3).
Образцы CRH-K2CO3 #1-4 показали перспективу использования в процессах
элиминации токсинов из человеческой плазмы. Степень сорбции образцов CRH-K2CO3 #2
и 4 составила 35-40% для IL6, а образцы CRH-K2CO3 #2 и 4 показали 100 % элиминацию
IL8, в то время как образец MAST ТЕ7 показал меньшую степень сорбции токсинов.
Заключение
В ходе работы были получены углеродные материалы синтезированные из
растительного сырья. Их характеристики были изучены с помощью ряда физикохимических методов исследования: низкотемпературная адсорбция азота, ртутная
порометрия, СЭМ, сорбция метиленового голубого. Полученные данные показали, что:
1. Образцы CRH K2CO3 #1,3 обладают наибольшей удельной поверхностью, равной
1655 м2/г и 1272 м2/г соответственно.
2. Ряд образцов CRH K2CO3 #1-4 показали наибольший объем мезопор: 0,15-0,44 см3/г.
3. Согласно ВЭЖХ анализу, степень сорбции образцов CRH-K2CO3 #1 и 3 составляет
~90% PCS и ~100% IS.
4. Данные ИФА показали, что образцы CRH-K2CO3 #1-4 способны удалять 35-40% IL6,
и 100 % IL8.
Согласно проведенным исследованиям, полученные углеродные материалы
представляют потенциал в качестве составного компонента сорбентов для очистки крови
путемгемоперфузии.
Литература
1. Z.A. Mansurov, M.K. Gilmanov, in: Sorbents: Properties, Materials and Applications,
Edited Thomas P. Willis, Nova Science Publishers Inc., NY (2009), Chapter 3, pp. 217-284.
2. Steenkamp R, Castledine C, Feest T, Fogarty D. UK RRT Prevalence in 2009: national
and centre-specific analyses. The UK renal registry 13th annual report. 2010;35-60.
3. Stenvinkel P. Chronic kidney disease: a public health priority and harbinger of
premature cardiovascular disease JnInt Med 2010; 1365: 2796
4. Glorieux G, Cohen G, Jankowski J, Vanholder R. Platelet/Leukocyte Activation,
Inflammation, and Uremia. Seminars in Dialysis 2009; 22(4):423-427.
5. Fujii H, Nakai K, Fukagawa M. Role of Oxidative Stress and IndoxylSulfate in
Progression of Cardiovascular Disease in Chronic Kidney Disease.Therapeutic Apheresis and
Dialysis 2011;15(2):125–12
6. Jourde-Chiche N, Dou L,Cerini C, Dignat-George F,Vanholder R, Brunet P. ProteinBound Toxins—Update 2009.Seminars in Dialysis 2009; 22(4) :334–339.
7. Carrero JJ, Park S-H ,Axelsson J, Lindholm B, Stenvinkel P. Cytokines,
Atherogenesis, and Hypercatabolism in Chronic Kidney Disease: A Dreadful Triad.Seminars in
Dialysis. 2009; 22(4):381–386.
8. Himmelfarb J. Uraemic toxicity, oxidative stress and haemodialysis as renal
replacement therapy. Seminars in Dialysis.2009; 22(6) :636–643.
9. De Loor H, Meijers B, Meyer T, Bammens B, Verbeke K, Dehaen W, Evenepoel P.
Sodium octanoate to reverse indoxyl sulphate and p-cresylsufate albumin binding in uremic and
normal serum during sample preparation followed by fluorescence liquid chromatography.
Journal of Chromatography A, 1216 (2009):4684-4688.
Скачать