Ингибирование миостатина в качестве терапии мышечных
advertisement
Ингибирование миостатина в качестве терапии мышечных заболеваний Стратегии, направленные на увеличение мышечной массы и силы за счет ингибирования миостатинаперспективный путь для клинической разработки. Фолистатин является мощным антагонистом миостатина, который способен препятствовать доступу миостатина к воздействию на рецепторы в скелетных мышцах. Наращивание мышц как свойство фоллистатина хорошо продемонстрированы, но потому, что он представляет собой пептид с множеством функций, проблемы были подняты в отношении вне целевого эффекта при рассмотрении его пригодности для лечения мышечных заболеваний. Цель данного обзора тщательно обсудить эти сложные взаимодействия и продемонстрировать стратегию, которая использует известные свойства фоллистатина, которые могут быть использованы для содействия эффективности для увеличения мышечной массы и силы мышц в отсутствие неблагоприятных клинических эффектов. Акцент на торможении миостатина возникает из-за того, что лечение мышечных расстройств с помощью большинства фармакологических подходов вызывает разочарование. Андрогены, стероиды, популярных среди спортсменов, имеют долгосрочные риски, в том числе: эндокринные (атрофия половых и стерильность) , соматические (изменения липидов крови и сердечной гипертрофии) , и психоневрологические (тревога, депрессия, враждебность, паранойя), и попытки лечения мышечных расстройств данными препаратами были прекращены. Глюкокортикостероиды, которые оказались выгодным препаратом для лечения мышечной дистрофии, практически полностью ориентированы на мышечную дистрофию Дюшенна (МДД). Даже в этой группе пациентов механизм мало изучен, и доказательств того, что мышечная масса увеличивается , недостаточно. На генетические заболевания мышц нацелены стратегии генной манипуляции, в том числе замена генов, пропуск экзонов. Несмотря на энтузиазм, экспериментальные исследования показывают, что эти подходы обычно лишены возвращения нормальной функции. Комбинационные подходы, которые включают частичную коррекцию основного дефекта (например, микро-дистрофин) в сочетании с увеличением размеров и силы мышц, кажется, предлагают больше выгоды для мышечных заболеваний, где коррекция основного дефекта не может быть вариантом. Увеличение размеров и силы мышц может быть подходящим для генетических и приобретенных заболеваний мышц, где варианты лечения ограничены. Примеры включают в себя некоторые формы мышечной дистрофии, где стратегии генной манипуляции еще не применимы (FSHD), приобретенных заболеваний, таких как спорадический миозит. Патогенез Потенциал фоллистатина в качестве терапевтического средства для мышечной болезни, не может быть полностью понят без знания пути воздействия миостатина. Миостатина является членом семейства трансформирующих факторов роста-бета (TGF-β). Он экспрессируется в частности в развивающихся и взрослых скелетных мышцах. Во время роста, экспрессия миостатина ограничивает размер мышц во взаимодействии с несколькими факторами. Миогенные клетки реагируют на миостатин по механизму обратной экспрессии Pax-3 и Myf-5, важных транскрипционных регуляторов миогенной пролиферации клеток, и Мyo-D, ранним маркером мышечной дифференциации. В своих доклада в 1997 году McPherron и др. показали биологическое действие роста и дифференцировки гена фактора-8 (GDF-8) у мышей. У GDF-8 нулевых мышей мышцы были значительно больше по размеру, чем у дикого типа животных. (рис. 1). Индивидуальные мышцы мутантных мышей весом в 2-3 раза больше, чем у дикого типа животных. Увеличение массы было результатом сочетания гипертрофии и гиперплазии мышц. В этих опытах установлены функции GDF-8 пептидов в качестве основного фактора для ингибирования фактора роста мышц, "миостатина". Синтез миостатина Человеческий ген миостатина (MSTN) находится на хромосоме 2q32.2.67, ген состоит из трех экзонов и трех предполагаемых сайтов старта транскрипции, который кодирует 376аминокислот белка-предшественника, состоящего из сигнального пептида, N-концевого пропептида и С-концевого домена (рис. 2). Активация миостатина происходит поэтапно протеолитическим разделением белка-предшественника. Первоначально, ферменты удаляют сигнальный пептид (24-аминокислоты).Второе событие расщепления на аминокислоты отщепляет кислоты 240-243 два фрагмента: N-концевой пропептид 27640 Да и С-терминальный домен 12400 Да, которому суждено стать активным миостатином. Параллельные C-терминальные фрагменты миостатина связаны между собой через дисульфидные связи, и называются миостатин с-концевой димер, который остается нековалентно связан с комплексом N-концевых пропептидов. Этот комплекс циркулирует в крови и поддерживает миостатин сконцевой димер в латентном, неактивном состоянии . Третье расщепление на 76 аминокислот , необходимых для активации миостатина. Это происходит с помощью другой группы ферментов, металлопротеиназ, которые принадлежат к семье костных морфогенетических белков (BMP) -1/tolloid (TLD ). Сигнальный путь миостатина проходит через рецепторы активин типа IIB (ActRIIB) в скелетных мышцах, приведя в движение внутриклеточные каскады событий. Во-первых, предполагается, набор ко-рецепторов типа I . Активин рецептор-подобные киназы 4 и / или 5 (ALK-4, ALK-5) могут быть кандидатами в корецепторы, которые фосфорилируются ActRIIB. Это в свою очередь приводит к фосфорилированию ТФР-β конкретных Smads 2 и 3, которые образуют комплекс с Smad 4.Smad 2/3/4 комплекс перемещается в ядро, чтобы регулировать экспрессию целевых генов, таких как MyoD и миогенных регуляторных факторов (MRFs) (рис. 2) Помимо существенной роли в росте мышц, последние данные показывают, что миостатин играет регулирующую роль в фиброзе скелетных мышц. Ли и др. показали, что миостатин и ActRIIB рецептор экспрессируется в фибробластах, тем самым вызывая их распространение и производством белков внеклеточного матрикса. Это приводит к распространению индукции к Smad сигнального пути в фибробласты с помощью фосфорилирования Smad3 и p38 МАРК и Akt патологического пути. Это повышает терапевтический потенциал для торможения миостатина, что может привести к росту мышц и в то же время уменьшение фиброза. При многих мышечных заболеваниях активный фиброз приводит к необратимым последствиям , будь то наследственные или приобретенные заболевания. Синтез фолистатина, изоформы и физиологическая роль. Фоллистатин, выделенный в качестве гликопротеина, первоначально был идентифицирован в фолликулярной жидкости яичников свиньи и получил свое название, потому что он подавляет синтез и секрецию фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из гипофиза. Он схож у многих видов млекопитающих в 83 % и 95% . Две группы изолированы и опубликовали свои результаты в 1987 году. Один придумал термин фоллистатин, другие назвали его ФСГ подавляющий протеин (FSP) . Со временем фоллистаин стал популярным обозначением, но название вряд ли отдает должное пептиду с функциями, которые выходят за рамки подавления ФСГ. Ген локализуется в хромосоме 5q11.2. Она состоит из относительно небольшой 6-кб геномной ДНК, состоящей из шести экзонов. Существует альтернативный сайт сплайсинга, который генерирует два основных вида, полную версию, которая кодирует 344-аминокислотный препротеин , различающийся 27-аминокислотной последовательностью от ее карбокси-сокращенного варианта, в 317аминокислотной форме отсутствует экзон 6 (рис. 3) . До активации фоллистатин , как миостатин, подвергается дальнейшей посттрансляционной модификации, потеряв еще 29 аминокислот путем удаления сигнального пептида, что приводит к полипептиду, 315 (FS315) часто упоминается как долинная изоформа, и 288 (FS288) называется короткой изоформой. Существует также свидетельства того, что FS315 может быть протеолитически расщеплен в естественных условиях на карбокси-концевые пептиды, чтобы дать промежуточные изоформы из 303 аминокислот. В то время как фоллистатин был впервые выделен, мало что было известно о его механизме действия. Важную функцию фоллистатин вместе с другими членами надсемейства TGF-β играет в репродуктивной физиологии. Эти TGF-β пептиды выполняют аутокринную / паракринную функции. Все трое были первоначально очищены из половых жидкостей и характеризуются на основе их способности модулировать ФСГ. В дополнение к половому месту производства (яичник / яички), эти пептиды вырабатываются клетками в гипоталамо-гипофизарной системе. Фоллистатин связывает активин и уменьшает производство FSH. Активин выделяется из фолликула яичника и служит для усиления секреции ФСГ. Ингибины, которые выделяются в двух формах (А и B), способны ингибировать высвобождение ФСГ на гипоталамогипофизарном уровне. Кроме того, хорошо документировано, что фоллистатин может отменить последствия GnRH в стимулировании секреции ФСГ. Это также отчасти из-за блокирования транскрипционной активации гена рецептора GnRH . Это сложное взаимодействие фоллистатина по отношению к гипофизу и функции половых желез обеспокоило исследователей по поводу использования его потенциала в качестве терапевтического средства в клинике. Тем не менее, потенциал рекомбинантных препаратов может использовать различия между изоформами в их способности связывать гепарин. Хорошо известный гепаринсвязывающий сайт фоллистатина присутствует в остатке 72-86, который является регионом, богатым основными аминокислотами. В отличие от карбоксиконцевой 27 аминокислотной последовательности FS-315, состоящий из 44% кислых аминокислот, не имеет сайта связывания гепарина. Эти соображения дают новые перспективы в связи с генной терапией с учетом потенциальных продуктов трансгенов. FS-288, тем короче альтернативного продукта сплайсинга имеет ≈ 10-кратное более высокое сродство к активину по сравнению с FS-315. При разработке продукта генной терапии для клинического использования, мы воспользовались этим свойством. В наших доклинических исследованиях, адено-связанный (ААВ) вирус, который несет кДНК FS-344 обеспечивает продукт генной терапии (FS-315) без влияния на репродуктивные возможности у мужчины или женщины, начиная от мышей до обезьян. Эта стратегия значительно повышает запас прочности для клинических испытаний, потому что FS-315 изоформы имеет ограниченное влияние на активин модуляцию защиты гипофизарно-гонадной системы от нежелательных изменений. То же самое можно сказать и избегая вне целевого эффекта опосредованного клеточной поверхностью связывания фоллистатина, в том числе функции, связанные с клеточной дифференцировкой, репарацией и апоптозом. Происхождение фоллистатина при нормальных физиологических условиях не совсем понятно. Очевидно, фоллистатин производится локально в гипофизе и в половых железах, яичниках и семенниках. В целом, изменение фоллистатина в течение менструального цикла несколько меняется. Однако, заметным исключением является период беременности, когда концентрация фоллистатина поднимаются параллельно с активином. Фоллистатин широко распространен в различных органах , и большинство фоллистатина находится в циркуляции, скорее всего, выделяется из стенок кровеносных сосудов. Генетически измененные мыши с повышенной и пониженной экспрессией фоллистатина. Компонент понимания функциональной роли фоллистатина можно почерпнуть из исследования генетически модифицированных мышей. Исследования, которые оценивают избыточную экспрессию гена фоллистатина через генетически индуцированную избыточную функцию, проводятся с целью изучения возможности вне целевого эффекта. Тем не менее, информация, полученная из таких моделей требует осторожной интерпретации из-за видовых различий и влияний гиперэкспрессии во время разработки, которая не является клинически значимой. Несмотря на предостережения, результаты у трансгенной модели, в которой ген фоллистатина был введен под контролем промоутера миозина легкой цепи. Рост мышечной массы был значительно больше, чем наблюдался у миостатин-нулевых мутантных мышей. Эти результаты показывают, что, по крайней мере, часть влияния фоллистатина в результате воздействия на другой путь независимого торможения миостатина. Это предположение подкрепляется дополнительными исследованиями, в которых мышам, которые сверхэкспрессируют трансгенный фоллистатин , были скрещены с миостатин-нулевыми животными. В результате фенотип оказался с четырехкратным увеличением мышечной массы у фоллистатин + / миостатин-/ - мышей, опережая эффект или миостатин- нулевых или животных с гиперэкспрессией фоллистатина. Эти результаты подчеркивают, что другие сигнальные пути могут быть использованы для увеличения размеров мышц и силы. Другой избыточной функцией мутантной линии мышей стало помещение металлотионеина (MT) -1 промоутера перед геном фоллистатина. Наблюдения половых изменений в этой модели дало пищу для размышлений, но они не могут быть непосредственно связаны с клиническими соображениями. MT-фоллистатин трансгенное потомство было жизнеспособным. Кроме того, не было вредных эффектов замечено в органах и системах, кроме половых тканей. У мужчин размер яичек был уменьшен, с переменной гиперплазией клеток Лейдига, блокада сперматогенеза и семенная дегенерация приводящая к бесплодию. У животных женского пола были тонкие матки и небольшие яичники, и многие стали бесплодными. Интерпретация этих результатов в контексте того, что мы ожидали в клинических испытаниях генной терапии, требует осторожности. У пациента, наше беспокойство может быть обосновано тем, что высокие сывороточные уровни фоллистатина могут связать активин и привести к снижению сывороточного уровня ФСГ , что приводит к половой дисфункции. Вместо этого, фоллистатинэкспрессирующие мыши имели нормальный уровень ФСГ. Это означает, что у трансгенных мышей гиперэкспрессия фоллистатина оказывает свое воздействие через экспрессию генов в матрице органа, нарушая местное регулирование. Это не будет перекликаться с парадигмой генной терапии, где продукт трансгена, FS344, не связаны с тканью, и не влияют на репродуктивную функцию. Мутантные мыши сохранились до рождения, но умерли через несколько часов после родов. Дефекты включали отставание роста и блестящую, упругую кожу. Существовало слабое развитие усов, гиперкератоз кожи, аномалии развития зубов, дефекты твердого неба, и уменьшенный размер межреберных мышц и диафрагмы. Центральная и периферическая нервная система, однако, была цела. В лучшем случае, это модель имеет небольшое отношение к нашей цели изучения фоллистатина в качестве потенциального терапевтического агента. Трансляционные подходы для ингибирования синтеза миостатина при миодистрофии. Увеличение размера мышц и их силы у животных моделей болезней мышц в экспериментальных исследованиях имеет важные последствия для разработки лечения нервно-мышечных болезней. В таблице 1 приведены стратегии, которые были использованы для укрепления потенциала этого подхода. У мышей MDX, модели МДД, было увеличение размеров и силы мышц с использованием моноклональных антител, которые ингибируют миостатин. В целях дальнейшей поддержки торможения миостатина при мышечной дистрофии, мыши MDX были скрещены с миостатин-нулевыми мышами, в результате чего у мышей наблюдались мышцы большего размера. Впечатляющие результаты в этой модели отмечены в диафрагме, где наблюдалось уменьшение фиброза , потенциал клинически значимого результата. Другой подход к достижению блокады миостатина использовать пропептид для поддержания миостатина С-концевого димера неактивным, блокируя доступ к ActRIIB рецепторам. В одной из экспериментальных парадигм, пропептид был стабилизирован путем слияния с IgG-Fc и системно вводился MDX мышам, что привело к увеличению сопутствующего размера мышц. Во второй стратегии, AAV был использован для доставки мутантного пропептида миостатина в мышиной модели конечностно- поясной мышечная дистрофия (КПМД) 2A. Мутация предотвратила расщепление пропептида и поддерживала миостатин С-концевой домен в неактивном состоянии.Калпаин-3 дефицитные мыши показали увеличение мышечной массы и силы. Другие исследования умерили энтузиазм и предупредили о лечении с учетом возраста и стадии дистрофии при лечении. Например, в модели недостаточности дельта-саркогликана (scgd-/ -), потеря деятельности миостатина у очень молодых мышей с использованием моноклональных антител или делеции гена (MSTN-/ -; scgd-/ -) наблюдалось повышение мышечного размера , улучшение регенерации мышц и снижение фиброза. Тем не менее, антитело-опосредованно торможение миостатина на поздней стадии у scgd-/ - мышей не смогло предотвратить прогрессирование патологии мышц, несмотря на рост мышечной массы. Другой неутешительный результат наблюдался у Dyw / Dyw мышей, мышиной модели с недостаточностью мерозина, врожденной мышечной дистрофии (MDC1A) . Dyw / Dyw мыши обладают плохой регенерацией мышц, которую можно было бы ожидать, чтобы показать положительный ответ на торможение миостатина. Однако попытки увеличить мышечную силу и продлить срок службы за счет устранения миостатина при скрещивании Dyw мыши с миостатин- нулевой были неутешительными. Гомозиготные Dyw / Dyw; MSTN-/ - показали улучшенную регенерацию мышц, но дистрофические функции, включая некроз, воспаление и фиброз были затронуты и смертность увеличилась. Неблагоприятный исход объясняется сокращением бурого жира в неонатальный период, дополнительные эффекты основных мутаций в сочетании с торможением миостатина (Dyw / Dyw; MSTN-/ -). В другой модели наследственных мышечных заболеваний, связанные с кавеолином, полученные в исследованиях, заложили основу для возможного благоприятного исхода для клинических испытаний ингибирования миостатина. Кавеолин является интегральными мембранными белками и являются основными компонентами сарколеммы. Эти белки играют важную роль в передаче сигналов, кавеолин-3 (CAV3) генные мутации вызывают спектр мышечных расстройств, в том числе: аутосомно-доминантный LGMD1C, мышечные заболевания (RMD), спорадические и семейные формы гиперККэмии , и дистальных миопатий. У трансгенных мутантных мышей для P104L из CAV3, фосфорилированные Smad2 были повышены. Эти результаты показывают, что CAV3 обычно подавляет миостатин-опосредованный сигнал, тем самым защищая мышцы от атрофии. Блокирование миостатина путем скрещивания мутантов с CAV3 трансгенными мышами, которые сверхэкспрессируют пропептид миостатина (CAV-3P104L/MSTNPro) или внутрибрюшинное введение растворимого рецептора ActRIIB, предотвращают атрофию мышц с признаками подавления фосфорилирования Smad2. Эти результаты потенциально не сулят ничего хорошего для ингибирования миостатина у пациентов с CAV3 мутациями. В упомянутом выше исследовании, которое смотрело на потенциальную эффективность нейтрализующих моноклональных антител к миостатину (MYO-029) была изучена в двойном слепом рандомизированном клиническом испытании. Сто шестнадцать субъектов с мышечной дистрофией с различными заболеваниями, включая КПМД, мышечную дистрофию Беккера были включены. Субъекты были разделены на когорты с последовательной эскалацией дозы (когорта 1 на 1 мг / кг; Когорта 2 на 3 мг / кг; Когорта 3 при 10 мг / кг; когорта 4 при 30 мг / кг). MYO-029 показал хорошую безопасность и переносимость, за исключением кожной сыпи и гиперчувствительности при дозе 10 и 30 мг / кг. Не существовало улучшения мышечной силы или функции, но исследование не было разработано для эффективности. Тем не менее, биологическая активность MYO-029 имела тенденцию у ограниченного числа субъектов, которые продемонстрировали повышение мышечного размера, используя двойную рентгенографическую абсорбциометрию и гистологию мышц с дозозависимым увеличением при 3 мг / кг и 10 мг / кг. Это было первое клиническое исследование основано на гипотезе, что системное введение ингибиторов миостатина может быть подходящей стратегией для пациентов с различными мышечными расстройствами. Самое главное, не было никаких существенных побочных явлений, кроме связанных с кожной реакцией гиперчувствительности на антитела. Это исследование ясно открывает путь для более мощных ингибиторов миостатина, которые будут использоваться для стимулирования роста мышц при мышечной дистрофии. Действие миостатина на мышечную массу посредством генной терапии. Подход генной терапии для ингибирования миостатина представляет собой важное исследование для пациентов с мышечными заболеваниями. В отличие от фармакологических ингибиторов миостатина, таких как нейтрализующие антитела или рекомбинантные фармакологические агенты, которые были использованы в исследованиях (пропептид, растворимый рецептор ActRIIB, или препараты , такие как трихостатин), генная терапия предлагает потенциал для однократного введения вектора, несущего ген фоллистатина с постоянной экспрессией на протяжении многих лет, даже, возможно, в течение всей жизни человека. AAV-вектор для мышечных заболеваний. Он имеет большой опыт обеспечения безопасности при более чем 40 клинических испытаниях в различных группах болезней и продемонстрировал эффективность при врожденном амаврозе Лебера. Как мышцы являются естественным хозяином для AAV, преимущества для лечения широкого спектра болезней мышц очевидны. Несколько клинических испытаний, которые включают прямые инъекции в мышцы, продолжаются для дефицита альфа-1-анти-трипсина, а также Дюшенна и КПМД, и никаких побочных эффектов не возникало (неопубликованные набл., Джерри Mendell, Барри Бирн, Терренс Flotte). В то время как споры по поводу иммуногенности AAV, это не является непреодолимым препятствием, так как подавление иммунной системы изучается при вирусном переносе генов в ходе клинических испытаний. Преимущество торможения миостатина потенциал для лечения генетических и приобретенных заболеваний. Достижение клинически значимых результатов с использованием современных средств доставки генов к мышцам также является реалистичной целью. Примером потенциального получателя такого подхода является пациент с атрофией четырехглавой мышцы бедра (разгибатель колена). Примеры мышечных расстройств, которые предрасположены к слабости мышц разгибателей колена включают миотоническую мышечную дистрофию типа 1, мышечную дистрофию Беккера, и спорадический миозит. Терапевтический потенциал AAV-опосредованной генной терапии фоллистатина был тщательно изучен в нашей лаборатории в Центре генной терапии, детской больницы (Колумбус, штат Огайо). Гены фоллистатина, используемые для этих исследований является результатом альтернативного сплайсинга кДНК FS-344 (рис. 3). Конечный продукт этого трансгена является FS-315 циркулирующими изоформами. Из-за ее пониженного сродства к гепарину, поверхность клеток гипофизарно- гонадной системы , гораздо менее вероятно, будут затронуты, тем самым увеличивая профиль безопасности для этого трансгенного продукта. Это находит отражение в наших доклинических исследованиях, как будет описано.Для определения оптимального продукта гена для клинического продвижения, фоллистатин непосредственно по сравнению с другими миостатин-ингибирующими генами, в том числе факторами роста и дифференциации связанного сывороточного белка-1 (GASP-1), и фоллистатин связанных генов (FLRG) . В четырехглавую мышцу и переднюю большеберцовую мышцу мышей дикого типа были введены AAV серологического типа 1, который кодирует FS-344, FLRG, и GASP-1. Увеличение массы тела наблюдалось во всех трех испытаниях трансгенов, однако, наибольший прирост произошел у FS-344-обработанных животных (рис. 4а, б). Увеличенная мышечная масса сопровождается улучшением функции, о чем свидетельствует увеличение силы задних конечностей (рис. 4). Лечение не влияет на размеры сердца или гистологию. Исследование кардиомиоцитов указывает, что торможение миостатина селективно к скелетной мышечной ткани. Мы не обнаружили никаких изменений репродуктивной способности у мышей, получавших наши AAV1 FS-344 трансгены (AAV1-FS, таблица 2). Кроме того, мы не обнаружили никаких гистологических / патологические изменения в половой ткани, ткани сердца, печени, почек по сравнению с контрольными, указывая, что это лечение оказалось безопасным и хорошо переносимым. Впоследствии, мы протестировали возможность AAV1-FS-344 для увеличения мышечной массы и силы вместе с задержкой разрушения мышц у мышей MDX. Четырехглавая мышца и передняя большеберцовая мышцы были подвергнуты инъекциям в 3-недельном возрасте и наблюдали в течение 5 месяцев до вскрытия. 15-кратное увеличение в сыворотке крови фоллистатина было замечена у мышей, получавших высокие дозы (1,5 × 1012 В.Г. / кг) и 6-кратное увеличение было обнаружено в низкой дозе (1,5 × 1011 В.Г. / кг). Мыши отображали значительное увеличение размеров мышц (рис. 5а), с наибольшим увеличением мышечной массы при высоких дозах (рис. 5б). как показано в предыдущих исследованиях мышей дикого типа, последствия могут быть замечены в местах, удаленных от вирусной инъекции (например, трицепс;. рис 5б). Увеличение мышечной массы происходит в зависимости от дозы в мышцах. AAV-FS-344-мыши также продемонстрировали значительное снижение в сыворотке крови креатинкиназы (рис. 6а). Можно предположить, что увеличение прочности отдельных волокон делает их более устойчивыми к повреждению от стресса при нормальной деятельности. Далее мы оценивали потенциал для AAV1-FS-344 для увеличения мышечной силы у MDX животных, получавших лечение в более старшем возрасте. Препарат вводили в четырехглавую мышцу и переднюю большеберцовую мышцу в 210-дневном возрасте, мыши продемонстрировали увеличение мышечной силы, измеряется сила сцепления задних конечностей более чем через 60 дней после введения. После достижения плато, повышенная прочность сохраняется на протяжении 560 дней при оценке в этом исследовании (рис. 6, б, в). Уменьшение воспаления и фиброза в диафрагме поддерживают предыдущие выводы, связанные с фоллистатином, расширяя свой потенциал для клинического применения. В диафрагме AAV1-FS-344обработанных мышей MDX, (мышца, которая наиболее близко повторяет дистрофические процессы в организме человека) мы обнаружили снижение соединительной ткани (рис. 6). Кроме того, MDX мышцы рассмотреные на 560 день продемонстрировали меньшее количество групп некротических мышечных волокон и мононуклеарных инфильтратов. Это противовоспалительный эффект фоллистатина был изучен в других исследованиях. Фоллистатин , также как было показано, снижает провоспалительные цитокины, индуцированные липополисахаридной стимуляцией. Учитывая положительные результаты на мышах, мы также расширили наши исследования генной терапии для приматов, чтобы установить прямые доказательства того, что инъекции являются эффективным средством повышения прочности у большей модели, которые более точно имитирует клинические условия. Слишком часто, исследования на мышах не могут перейти в клинику, однако, демонстрируют эффективность и безопасность с использованием тех же средств передачи вирусов и той же упаковки у крупных видов животных , обеспечивает разумную уверенность в успехе для пациентов. Наши исследования у макак были весьма успешными . Мы изучили AAV1-FS-344 под управлением конкретных (киназа креатина в мышцах) и неспецифический (CMV) промоторов . Мы видели значительное увеличение размеров и силы мышц. Обширные наблюдения у этих обезьян в отношении репродуктивной функции органов и тканей на посмертном анализе не выявили патологии органов и систем, в том числе органов гипофизарно-гонадной системы. Наши исследования показывают, что таким образом AAVопосредованная генная терапия фоллистатина имеет потенциал для лечения мышечной дистрофии, и это хорошо позиционируется в интересах определенных приобретенных заболеваний. Мы также отметили, что комбинационная терапия, то есть замена дефектного гена, в сочетании с генной терапией фоллистатина может предложить больше, чем в одиночку. Например, текущие исследования в нашей лаборатории показали, что сочетание AAV-опосредованной генной терапии микро-дистрофина с AAV поставкой фоллистатина увеличивают силу мышц и защиту от эксцентричных сокращений в большей степени, чем любой из них может достичь в одиночку. Противовоспалительные эффекты, которые сопровождают фоллистатин AAVопосредованную генную терапию, также являются потенциальной пользой для определенных групп пациентов, например, со спорадическим миозитом. Двойной эффект повышения мышечной силы и уменьшение клеточной инфильтрации мононуклеарных обеспечит перспективное сочетание для лечения. В заключение, генная терапия использования фоллистатина для подавления миостатина перспективна для лечения мышечных заболеваний. Наши результаты показывают, что увеличение размеров и силы мышц с уменьшением фиброза у мышей MDX, а также наш успех в исследованиях у приматов, готовит почву для клинических испытаний у человека. Мы не столкнулись ни с побочными эффектами, не с влиянием на репродуктивную способность, и не с иммуногенностью трансгенов фоллистатина или его продукта. Таким образом, противовоспалительный эффект фоллистатина будет способствовать улучшениям при различных заболеваниях, в частности таких, как спорадический миозит, где медицинское лечение еще не разработано. Ссылки: 1. Aartsma-Rus A, Kaman WE, Weij R, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons. Mol Ther. 2006;14:401–407. [PubMed] 2. Abmayr S, Gregorevic P, Allen JM, Chamberlain JS. Phenotypic improvement of dystrophic muscles by rAAV/microdystrophin vectors is augmented by Igf1 codelivery. Mol Ther. 2005;12:441–450. [PubMed] 3. Alen M, Rahkila P. Reduced high-density lipoprotein-cholesterol in power athletes: use of male sex hormone derivates, an atherogenic factor. Int J Sports Med. 1984;5:341–342. [PubMed] 4. Amthor H, Huang R, McKinnell I, Christ B, Kambadur R, Sharma M, et al. The regulation and action of myostatin as a negative regulator of muscle development during avian embryogenesis. Dev Biol. 2002;251:241–257. [PubMed] 5. Balagopal P, Olney R, Darmaun D, Mougey E, Dokler M, Sieck G, et al. Oxandrolone enhances skeletal muscle myosin synthesis and alters global gene expression profile in Duchenne muscular dystrophy. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006;290:E530–539. [PubMed] 6. Bartoli M, Poupiot J, Vulin A, Fougerousse F, Arandel L, Daniele N, et al. AAV-mediated delivery of a mutated myostatin propeptide ameliorates calpain 3 but not alpha-sarcoglycan deficiency. Gene Ther. 2007;14:733–740. [PubMed] 7. Barton-Davis ER, Cordier L, Shoturma DI, Leland SE, Sweeney HL. Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice. J Clin Invest. 1999;104:375–381. [PMC free article] [PubMed] 8. Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, Ahima RS, et al. Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature. 2002;420:418–421. [PubMed] 9. Bogdanovich S, Perkins KJ, Krag TO, Whittemore LA, Khurana TS. Myostatin propeptide-mediated amelioration of dystrophic pathophysiology. FASEB J. 2005;19:543–549. [PubMed] 10. Bogdanovich S, McNally EM, Khurana TS. Myostatin blockade improves function but not histopathology in a murine model of limb-girdle muscular dystrophy 2C. Muscle Nerve. 2008;37:308–316. [PubMed] 11. Cagliani R, Bresolin N, Prelle A, Gallanti A, Fortunato F, Sironi M, et al. A CAV3 microdeletion differentially affects skeletal muscle and myocardium. Neurology. 2003;61:1513–1519. [PubMed] 12. Cerletti M, Negri T, Cozzi F, Colpo R, Andreetta F, Croci D, et al. Dystrophic phenotype of canine X-linked muscular dystrophy is mitigated by adenovirus-mediated utrophin gene transfer. Gene Ther. 2003;10:750–757. [PubMed] 13. Dohi T, Ejima C, Kato R, Kawamura YI, Kawashima R, Mizutani N, et al. Therapeutic potential of follistatin for colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 2005;128:411–423. [PubMed] 14. Esch FS, Shimasaki S, Mercado M, Cooksey K, Ling N, Ying S, et al. Structural characterization of follistatin: a novel follicle-stimulating hormone release-inhibiting polypeptide from the gonad. Mol Endocrinol. 1987;1:849–855. [PubMed] 15. Evans LW, Muttukrishna S, Groome NP. Development, validation and application of an ultra-sensitive two-site enzyme immunoassay for human follistatin. J Endocrinol. 1998;156:275–282. [PubMed] 16. Fernandez-Vazquez G, Kaiser UB, Albarracin CT, Chin WW. Transcriptional activation of the gonadotropinreleasing hormone receptor gene by activin A. Mol Endocrinol. 1996;10:356–366. [PubMed] 17. Galbiati F, Razani B, Lisanti MP. Emerging themes in lipid rafts and caveolae. Cell. 2001;106:403–411. [PubMed] 18. Gilfillan CP, Robertson DM. Development and validation of a radioimmunoassay for follistatin in human serum. Clin Endocrinol (Oxf) 1994;41:453–461. [PubMed] 19. Gregorevic P, Blankinship MJ, Allen JM, Crawford RW, Meuse L, Miller DG, et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nat Med. 2004;10:828–834. [PMC free article] [PubMed] 20. Gregorevic P, Allen JM, Minami E, Blankinship MJ, Haraguchi M, Meuse L, et al. rAAV6-microdystrophin preserves muscle function and extends lifespan in severely dystrophic mice. Nat Med. 2006;12:787–789. [PubMed] 21. Guo Q, Kumar TR, Woodruff T, Hadsell LA, DeMayo FJ, Matzuk MM. Overexpression of mouse follistatin causes reproductive defects in transgenic mice. Mol Endocrinol. 1998;12:96–106. [PubMed] 22. Haidet AM, Rizo L, Handy C, Umapathi P, Eagle A, Shilling C, et al. Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administration of myostatin inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:4318– 4322. [PMC free article] [PubMed] 23. Hamed SA. Drug evaluation: PTC-124—a potential treatment of cystic fibrosis and Duchenne muscular dystrophy. IDrugs. 2006;9:783–789. [PubMed] 24. Hashimoto O, Nakamura T, Shoji H, Shimasaki S, Hayashi Y, Sugino H. A novel role of follistatin, an activinbinding protein, in the inhibition of activin action in rat pituitary cells. Endocytotic degradation of activin and its acceleration by follistatin associated with cell-surface heparan sulfate. J Biol Chem. 1997;272:13835–13842. [PubMed] 25. Hill JJ, Davies MV, Pearson AA, Wang JH, Hewick RM, Wolf-man NM, et al. The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. J Biol Chem. 2002;277:40735– 40741. [PubMed] 26. Hill JJ, Qiu Y, Hewick RM, Wolfman NM. Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factorassociated serum protein-1: a novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. Mol Endocrinol. 2003;17:1144–1154. [PubMed] 27. Jones KL, Mansell A, Patella S, Scott BJ, Hedger MP, de Kretser DM, et al. Activin A is a critical component of the inflammatory response, and its binding protein, follistatin, reduces mortality in endotoxemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:16239–16244. [PMC free article] [PubMed] 28. Keller ET, Ershler WB, Chang C. The androgen receptor: a mediator of diverse responses. Front Biosci. 1996;1:d59–71. [PubMed] 29. Khoury RH, Wang QF, Crowley WF, Jr, Hall JE, Schneyer AL, Toth T, et al. Serum follistatin levels in women: evidence against an endocrine function of ovarian follistatin. J Clin Endocrinol Metab. 1995;80:1361–1368. [PubMed] 30. Kindermann W, Urhausen A. Left ventricular dimensions and function in strength athletes. Re: Hartgens F, Cheriex EC, Kuipers H. Prospective echocardiographic assessment of androgenic-anabolic steroids effects on cardiac structure and function in strength athletes. Int J Sports Med. 2003;24:344–351. Int J Sports Med 2004;25:241−242; author reply 243−244. [PubMed] 31. Kuang W, Xu H, Vilquin JT, Engvall E. Activation of the lama2 gene in muscle regeneration: abortive regeneration in laminin alpha2-deficiency. Lab Invest. 1999;79:1601–1613. [PubMed] 32. Langley B, Thomas M, Bishop A, Sharma M, Gilmour S, Kambadur R. Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression. J Biol Chem. 2002;277:49831–49840. [PubMed] 33. Lee SJ, McPherron AC. Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:9306–9311. [PMC free article] [PubMed] 34. Lee SJ. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol. 2004;20:61–86. [PubMed] 35. Lee SJ, Reed LA, Davies MV, Girgenrath S, Goad ME, Tomkinson KN, et al. Regulation of muscle growth by multiple ligands signaling through activin type II receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:18117–18122. [PMC free article] [PubMed] 36. Lee SJ. Quadrupling muscle mass in mice by targeting TGF-beta signaling pathways. PLoS ONE. 2007;2:e789. [PMC free article] [PubMed] 37. Lenders JW, Demacker PN, Vos JA, Jansen PL, Hoitsma AJ, van 't Laar A, et al. Deleterious effects of anabolic steroids on serum lipoproteins, blood pressure, and liver function in amateur body builders. Int J Sports Med. 1988;9:19–23. [PubMed] 38. Li ZB, Kollias HD, Wagner KR. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J Biol Chem. 2008;283:19371–19378. [PMC free article] [PubMed] 39. Li ZF, Shelton GD, Engvall E. Elimination of myostatin does not combat muscular dystrophy in dy mice but increases postnatal lethality. Am J Pathol. 2005;166:491–497. [PMC free article] [PubMed] 40. Liu M, Yue Y, Harper SQ, Grange RW, Chamberlain JS, Duan D. Adeno-associated virus-mediated microdystrophin expression protects young mdx muscle from contraction-induced injury. Mol Ther. 2005;11:245– 256. [PMC free article] [PubMed] 41. Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN, Jr, Mingozzi F, Bennicelli J, et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 2008;358:2240–2248. [PMC free article] [PubMed] 42. Massague J, Wotton D. Transcriptional control by the TGF-beta/Smad signaling system. EMBO J. 2000;19:1745– 1754. [PMC free article] [PubMed] 43. Matzuk MM, Lu N, Vogel H, Sellheyer K, Roop DR, Bradley A. Multiple defects and perinatal death in mice deficient in follistatin. Nature. 1995;374:360–363. [PubMed] 44. McClorey G, Moulton HM, Iversen PL, Fletcher S, Wilton SD. Antisense oligonucleotide-induced exon skipping restores dystrophin expression in vitro in a canine model of DMD. Gene Ther. 2006;13:1373–1381. [PubMed] 45. McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature. 1997;387:83–90. [PubMed] 46. Mendell JR, Moxley RT, Griggs RC, Brooke MH, Fenichel GM, Miller JP, et al. Randomized, double-blind sixmonth trial of prednisone in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 1989;320:1592–1597. [PubMed] 47. Mendell JR, Boue DR, Martin PT. The congenital muscular dystrophies: recent advances and molecular insights. Pediatr Dev Pathol. 2006;9:427–443. [PMC free article] [PubMed] 48. Minetti GC, Colussi C, Adami R, Serra C, Mozzetta C, Parente V, et al. Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors. Nat Med. 2006;12:1147–1150. [PubMed] 49. Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther. 2007;7:316–324. [PubMed] 50. Moxley RT, 3rd, Ashwal S, Pandya S, Connolly A, Florence J, Mathews K, et al. Practice parameter: corticosteroid treatment of Duchenne dystrophy: report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and the Practice Committee of the Child Neurology Society. Neurology. 2005;64:13–20. [PubMed] 51. Mueller C, Flotte TR. Clinical gene therapy using recombinant adeno-associated virus vectors. Gene Ther. 2008;15:858–863. [PubMed] 52. Nakamura T, Takio K, Eto Y, Shibai H, Titani K, Sugino H. Activin-binding protein from rat ovary is follistatin. Science. 1990;247:836–838. [PubMed] 53. Ohsawa Y, Hagiwara H, Nakatani M, Yasue A, Moriyama K, Murakami T, et al. Muscular atrophy of caveolin-3deficient mice is rescued by myostatin inhibition. J Clin Invest. 2006;116:2924–2934. [PMC free article] [PubMed] 54. Parsons SA, Millay DP, Sargent MA, McNally EM, Molkentin JD. Age-dependent effect of myostatin blockade on disease severity in a murine model of limb-girdle muscular dystrophy. Am J Pathol. 2006;168:1975–1985. [PMC free article] [PubMed] 55. Parton RG. Caveolae—from ultrastructure to molecular mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003;4:162–167. [PubMed] 56. Phillips DJ, de Kretser DM. Follistatin: a multifunctional regulatory protein. Front Neuroendocrinol. 1998;19:287– 322. [PubMed] 57. Pope HG, Jr, Katz DL. Psychiatric and medical effects of anabolic-androgenic steroid use. A controlled study of 160 athletes. Arch Gen Psychiatry. 1994;51:375–382. [PubMed] 58. Qiao C, Li J, Jiang J, Zhu X, Wang B, Li J, et al. Myostatin propeptide gene delivery by adeno-associated virus serotype 8 vectors enhances muscle growth and ameliorates dystrophic phenotypes in mdx mice. Hum Gene Ther. 2008;19:241–254. [PubMed] 59. Rebbapragada A, Benchabane H, Wrana JL, Celeste AJ, Attisano L. Myostatin signals through a transforming growth factor beta-like signaling pathway to block adipogenesis. Mol Cell Biol. 2003;23:7230–7242. [PMC free article] [PubMed] 60. Reisz-Porszasz S, Bhasin S, Artaza JN, Shen R, Sinha-Hikim I, Hogue A, et al. Lower skeletal muscle mass in male transgenic mice with muscle-specific overexpression of myostatin. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2003;285:E876–888. [PubMed] 61. Robertson DM, Klein R, de Vos FL, McLachlan RI, Wettenhall RE, Hearn MT, et al. The isolation of polypeptides with FSH suppressing activity from bovine follicular fluid which are structurally different to inhibin. Biochem Biophys Res Commun. 1987;149:744–749. [PubMed] 62. Sampaolesi M, Blot S, D'Antona G, Granger N, Tonlorenzi R, Innocenzi A, et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 2006;444:574–579. [PubMed] 63. Schneyer AL, Wang Q, Sidis Y, Sluss PM. Differential distribution of follistatin isoforms: application of a new FS315-specific immunoassay. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89:5067–5075. [PubMed] 64. Shimasaki S, Koga M, Esch F, Cooksey K, Mercado M, Koba A, et al. Primary structure of the human follistatin precursor and its genomic organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:4218–4222. [PMC free article] [PubMed] 65. Shimasaki S, Koga M, Esch F, Mercado M, Cooksey K, Koba A, et al. Porcine follistatin gene structure supports two forms of mature follistatin produced by alternative splicing. Biochem Biophys Res Commun. 1988;152:717–723. [PubMed] 66. Sjoqvist F, Garle M, Rane A. Use of doping agents, particularly anabolic steroids, in sports and society. Lancet. 2008;371:1872–1882. [PubMed] 67. Solinas-Toldo S, Lengauer C, Fries R. Comparative genome map of human and cattle. Genomics. 1995;27:489– 496. [PubMed] 68. Stolz LE, Li D, Qadri A, Jalenak M, Klaman LD, Tobin JF. Administration of myostatin does not alter fat mass in adult mice. Diabetes Obes Metab. 2008;10:135–142. [PubMed] 69. Sugino K, Kurosawa N, Nakamura T, Takio K, Shimasaki S, Ling N, et al. Molecular heterogeneity of follistatin, an activin-binding protein. Higher affinity of the carboxyl-terminal truncated forms for heparan sulfate proteoglycans on the ovarian granulosa cell. J Biol Chem. 1993;268:15579–15587. [PubMed] 70. Sumitomo S, Inouye S, Liu XJ, Ling N, Shimasaki S. The heparin binding site of follistatin is involved in its interaction with activin. Biochem Biophys Res Commun. 1995;208:1–9. [PubMed] 71. Thomas M, Langley B, Berry C, Sharma M, Kirk S, Bass J, et al. Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. J Biol Chem. 2000;275:40235–40243. [PubMed] 72. Tsuchida K, Arai KY, Kuramoto Y, Yamakawa N, Hasegawa Y, Sugino H. Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-beta family. J Biol Chem. 2000;275:40788–40796. [PubMed] 73. Ueno N, Ling N, Ying SY, Esch F, Shimasaki S, Guillemin R. Isolation and partial characterization of follistatin: a single-chain Mr 35,000 monomeric protein that inhibits the release of follicle-stimulating hormone. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84:8282–8286. [PMC free article] [PubMed] 74. Wagner KR, McPherron AC, Winik N, Lee SJ. Loss of myostatin attenuates severity of muscular dystrophy in mdx mice. Ann Neurol. 2002;52:832–836. [PubMed] 75. Wagner KR, Fleckenstein JL, Amato AA, Barohn RJ, Bushby K, Escolar DM, et al. A phase I/IItrial of MYO-029 in adult subjects with muscular dystrophy. Ann Neurol. 2008;63:561–571. [PubMed] 76. Wakatsuki M, Shintani Y, Abe M, Liu ZH, Shitsukawa K, Saito S. Immunoradiometric assay for follistatin: serum immunoreactive follistatin levels in normal adults and pregnant women. J Clin Endocrinol Metab. 1996;81:630–634. [PubMed] 77. Wang QF, Farnworth PG, Burger HG, Findlay JK. Acute inhibitory effect of follicle-stimulating hormonesuppressing protein (FSP) on gonadotropin-releasing hormone-stimulated gonadotropin secretion in cultured rat anterior pituitary cells. Mol Cell Endocrinol. 1990;72:33–42. [PubMed] 78. Wang QF, Farnworth PG, Findlay JK, Burger HG. Chronic inhibitory effect of follicle-stimulating hormone (FSH)-suppressing protein (FSP) or follistatin on activin- and gonadotropin-releasing hormone-stimulated FSH synthesis and secretion in cultured rat anterior pituitary cells. Endocrinology. 1990;127:1385–1393. [PubMed] 79. Woodruff TK, Sluss P, Wang E, Janssen I, Mersol-Barg MS. Activin A and follistatin are dynamically regulated during human pregnancy. J Endocrinol. 1997;152:167–174. [PubMed] Переведено проектом МОЙМИО www.mymio.org Оригинал статьи http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2717722/?tool=pubmed
