ME E-0900 Инсулин ИФА Набор реагентов для ИФА для

ME E-0900 Инсулин ИФА
Набор реагентов для ИФА для количественного определения Инсулина в сыворотке и плазме.
Только для in vitro диагностики.
Инсулин – это главный гормон, отвечающий за контроль метаболизма глюкозы. Он
синтезируется в β-клетках островков Лангерганса в виде прекурсора, проинсулина, который затем
преобразуется в С-пептид и Инсулин. С-пептид и Инсулин затем секретируются в эквимолярных
количествах в систему циркуляции. Зрелая молекула инсулина состоит из двух полипептидных
цепей, А цепь и В цепь (21 и 30 аминокислот соответственно). Цепи связаны между собой
дисульфидными мостиками. Существуют также дисульфидные мостики внутри А цепи. Секреция
инсулина зависит от концентрации глюкозы в крови, и этот гормон имеет ряд важных
метаболических свойств. Основной функцией инсулина является контроль поглощения
и утилизации глюкозы в периферических тканях с помощью транспортера глюкозы. Эта и другая
гипогликемическая активность, такая как ингибирование печеночного глюконеогенеза и
гликогенолиза, нейтрализуют действие гипергликемических гормонов, таких как глюкагон,
адреналин, гормон роста и кортизол. Концентрация инсулина значительно снижается
при инсулинозависимом сахарном диабете (ИЗСД) и некоторых других условиях, таких
как гипофизарный нанизм.
Уровень инсулина повышается при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНСД), ожирении,
инсулиномы и некоторые эндокринные дисфункции, такие как синдром Кушинга и акромегалия.
Принцип теста:
Набор Инсулин ИФА основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА),
основанный на принципе сэндвича.
Образцы пациента, стандарты и контроли подкислены и нейтрализуются непосредственно перед
анализом.
Лунки покрыты моноклональными антителами к антигенам, расположенным на молекуле
Инсулина.
Аликвоты образцов пациента, содержащие эндогенный инсулин, инкубируются в лунках с
ферментным конъюгатом (анти-Инсулин антитела – Биотин). После инкубации несвязавшийся
конъюгат вымывается.
Во время второго этапа инкубации ферментный Стрептовидин-пероксидазный комплекс
связывается в биотин-анти-Инсулин антителами. Лунки промываются и инкубируются с
ферментным комплексом (Стрептавидин-HRP-комплекс). Количество связавшегося HRP
комплекса пропорционально концентрации Инсулина в образце.
После добавления раствора субстрата интенсивность цвета раствора пропорциональна
концентрации Инсулина в образце.
Состав набора:
96
Микротитровальный планшет
12х8 (96 лунок), разборный; лунки покрыты моноклональными анти-Инсулин антителами.
Нулевой стандарт, 1 флакон, 3 мл, готов к использованию
0 мкМЕ/мл
Стандарты (1-5):
пять флаконов, по 1 мл, готовы к использованию.
концентрации: 6.25 - 12.5 – 25 - 50 и 100 мкМЕ/мл
Стандарты откалиброваны согласно рекомендациям ВОЗ,
NIBSC: 66/304.
Enzyme Conjugate,
Ферментный конъюгат
1 флакон, 5 мл, готов к использованию;
мышиные моноклональные антитела конъюгированные с биотином
Enzyme Complex
Ферментный комплекс
1 флакон, 7 мл, готов к использованию.
стрептавидин-HRP комплекс
Substrate Solution
Раствор субстрата
1 флакон, 14 мл, готов к использованию; тетраметилбензидин (ТМБ).
Stop Solution
Стоп-раствор
1 флакон, 14 мл, готов к использованию, содержит 0,5 М серной кислоты
Избегайте контакта со Стоп-раствором. Это может вызвать раздражение кожи и ожоги.
Wash Solution
Промывочный раствор
1 флакон, 30 мл (40X концентрированный), см. "Подготовка реагентов".
Оборудование и материалы необходимые, но не входящие в комплект
- Микропланшетный анализатор (450±10)
- Откалиброванные переменные прецизионные микропипетки
- Абсорбирующая бумага
- Дистиллированная вода
Хранение и стабильность набора:
При хранении при температуре 2-8 ° С закрытые реагенты сохраняют активность до истечения
срока годности. Не используйте реагенты после этой даты.
Открытые реагенты должны храниться при температуре 2-8 ° С.
Микротитровальный планшет должен храниться при температуре 2-8 ° С в плотно закрытом
фольгированном пакете.
Подготовка реагентов:
Перед использованием все реагенты и необходимое количество стрипов должны быть комнатной
температуры.
Промывочный раствор:
Добавьте к 30 мл концентрата промывочного раствора 1170 мл деионизированной воды, до
конечного объёма 1 200 мл.
Разведенный промывочный раствор стабилен 2 недели при комнатной температуре.
Образцы:
Используется сыворотка или плазма (только гепарин- или цитрат-плазма)
Не используйте гемолизированные, желтушные и липемические образцы.
Хранение:
Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8° С до 5 дней.
Возможно более длительное хранение однократно замороженных образцов при – 20 ° С.
Размораживание должно проводиться непосредственно перед исследованием.
Разведение образцов:
Если при анализе установлено, что образец содержит более высокую концентрацию, чем
стандарты, то образцы можно разбавить Стандарт 0 и провести повторное исследование, как
описано в процедуре анализа.
При расчете результата должен учитываться фактор разведения
Пример:
a) разведение 1:10: 10 мкл Образца + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать)
b) разведение 1:100: 10 мкл разведения а) + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать)
Процедура анализа:
Перед применением все реагенты должны быть комнатной температуры. Стандарты, контроли и
образцы должны исследоваться в дублях. Как только процедура анализа была начата, она должна
быть завершена без перерыва.
1. Закрепите необходимое количество стрипов на штативе.
2. Добавьте по 25 мкл стандартов, контролей и образцов в соответствующие лунки новыми
одноразовыми наконечниками.
3. Добавьте по 25 мкл ферментного конъюгата в каждую лунку.
Тщательно перемешайте в течение 10 секунд. Важно добиться полного смешивания на
этом этапе.
4. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре в закрытом планшете.
5. Резко вытряхните содержимое лунок.
Промойте каждую лунку 3 раза разведенным промывочным раствором (по 400 мкл на
лунку). Для удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к
абсорбирующей бумаге.
Важно: чувствительность и точность данного анализа зависит от правильного выполнения
процедуры промывки.
6. Добавьте по 50 мкл Ферментного комплекса в каждую лунку.
7. Инкубируйте 60 минут при комнатной температуре.
8. Резко вытряхните содержимое лунок.
Промойте каждую лунку 3 раза разведенным промывочным раствором (по 400 мкл на
лунку). Для удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к
абсорбирующей бумаге.
9. Добавьте по 50 мкл Субстрата в каждую лунку
10. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре.
11. Для остановки ферментной реакции добавьте по 50 мкл Стоп-раствора в каждую лунку.
12. Измерьте ОП на микропланшетном анализаторе при 450±10 нм в течение 10 минут после
добавления стоп-раствора.
Расчет результатов:
1. рассчитайте среднюю оптическую плотность каждого стандарта, контроля и неизвестного
2. Нарисуйте калибровочную кривою на логарифмической бумаге со средней оптической
плотности на Y-оси и концентрацией калибратора на X-оси. Если для анализа
используется программное обеспечение, то рекомендуется кривая на 4-параметра.
3. Рассчитайте значение неизвестных при помощи калибровочной кривой.
4. Если концентрация образца выше стандартов, то образец должен быть разведен. При
расчете результата необходимо учитывать фактор разведения.
Пример типичной стандартной кривой:
(не используйте для расчета)
Стандарт
Стандарт 0 (0 мкМЕ/мл)
Стандарт 1 (6,25 мкМЕ/мл)
Стандарт 2 (12,5 мкМЕ/мл)
Стандарт 3 (25 мкМЕ/мл)
Стандарт 4 (50 мкМЕ/мл)
Стандарт 5 (100 мкМЕ/мл)
ОП (450 нм)
0.03
0.07
0.14
0.35
0.88
2.05
Ожидаемые нормальные значения:
Настоятельно рекомендуется, чтобы каждая лаборатория определяла свои границы нормальных и
аномальных значений.
2 – 25 мкМЕ/мл
Диапазон:
0 – 100 мкМЕ/мл
Чувствительность:
1,76 мкМЕ/мл