(европейская раса

2
В 2012 году в генетической лаборатории ФБУ «Рослесозащита» была
проделана работа по Договору № 87/12 от
21 сентября 2012 г. с
Департаментом лесного хозяйства администрации Тюменской области по
заданию: «Провести исследовательские энтомологические работы в целях
определения расы непарного шелкопряда, распространенного в Тюменской
области».
Объектами исследований были особи непарного шелкопряда (имаго и
яйцекладки), отобранные в августе-сентябре 2012 г. в 9-ти лесничествах юга
Тюменской области.
Исследование
образцов
непарного
шелкопряда,
полученных
от
Заказчика, по митохондриальному гену COI показало, что во всех
обследованных лесничествах Гольшмановском,
Ситниковском
и
Абабском, Армизанском, Бердюжском,
Ишимском, Казанском, Сладковском, Сорокинском,
Медведевском
лесничествах
Тюменской
области
представлена его европейская раса.
Однако, в 2013 году, при выполнении генетической лабораторией
ЦЗЛ Красноярского края работ по Договору № 2/гн от «11» ноября 2013 г. с
Федеральным государственным бюджетным учреждением «Новосибирская
межобластная ветеринарная лаборатория» в Гольшмановском и Ишимском
лесничествах Тюменской области обнаружены особи азиатской расы.
Результаты работы по указанным договорам в 2012-13 гг. приведены в
таблице 1 (акты отбора особей отсутствуют, образцы были предоставлены в
пронумерованных пробирках).
Молекулярно-генетическое
определение
расовой
принадлежности
непарного шелкопряда основано на определении наличия
мутации в
митохондриальном гене COI, ответственном за синтез фермента цитохром С
оксидазы.
Информация по секвенированию данного гена в различных
популяциях непарного шелкопряда представлена на сайте базы данных
3
Таблица 1. Расы непарного шелкопряда в насаждениях Тюменской
области, определенные на основе
анализа COI гена с применением
рестрикции (2012-2013 гг.)
№
п/п
1
2
3
Лесничество
Абабское л-во, Банниковское сх, кв. 283, выд.7,
N 56º05, 821×, E 70 º11,104 ×, отбор 07.08.2012, имаго.
Армизанское л-во, Ивановское сх, кв.23, выд. 31,
N 56º05, 989×, E 67 º47,000 ×, отбор 06.08.2012, имаго.
Бердюжское л-во, Глубоковский сх, кв.66, выд.1,
координат нет, отбор 06.08.2012, имаго.
4
Голышмановский район, «Голышмановское сельское
участковое лесничество», 311 квартал, отбор 2013 г.,
имаго
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Голышмановское л-во, Медведевское участковое, кв.
329, выд. 25,N 56º20, 111×, E 68 º30,843 ×, отбор
09.08.2012, имаго.
Голышмановский район, «Голышмановское сельское
участковое лесничество», кв. 62, 67, отбор 2013 г.,
имаго.
Ишимское л-во, Новолоктинское сх, кв.115, выд. 5, N
55º57, 007×, E 68 º56,433 ×, отбор 08.08.2012, имаго.
Ишимский район, «Ишимское сельское южное
лесничество», кв.134, отбор 2013 г., имаго.
Казанское л-во, Дальнетравное сх, кв. 9, выд. 3, N
55º41, 863×, E 69 º00,616, отбор 07.08.2012, имаго.
Сладковское л-во, Сладковское участковое, кв. 50,
выд. 48, N 55º30, 544×, E 70 º25,785×, отбор
07.08.2012, имаго
Сорокинское л-во, Сорокинскоеучастковое, кв.109,
выд.2, N 56º23, 240×, E 69 º49,470 ×, отбор 06.08.2012,
Омутинскоел-во, Ситниковское участковое, кв.38, выд.
38, N 56º23, 507×, E 67 º49,488 ×, отбор 09.08.2012,
имаго.
НСО, Чановский район, «Чановский лесхоз», отбор
2013 г., имаго
Раса
непарного
шелкопряда
Европейская
Европейская
Европейская
Смешанная
Европейская 66.7%
Азиатская –
33.3%
Европейская
Азиатская
Европейская
Азиатская
Европейская
Европейская
Европейская
Европейская
Азиатская
4
https://r.mail.yandex.net/url/3YamLXAu1vpT0WygMys_Yw,1352266899/phylota
.net%2Fcgibin%2Fsql_getcluster.cgi%3Fti%3D13122&cl%3D9&ntype%3D1&db
%3D184
Ниже
приведены
сиквенсы
(последовательность
нуклеотидов,
определенная на секвенаторе) ампликонов этого гена
у непарного
шелкопряда азиатской и европейской рас.
ATTCAACAAATCATAAGGATATTGGAACCTTATATTTTATTTTTGGTATT
TGATCAGGAATAGTGGGAACATCTCTAAGTTTACTAATTCGAGCTGAAT
TAGGGAATCCTGGATCATTAATCGGAAATGATCAAATTTATAATACTAT
TGTTACAGCTCATGCATTTATCATAATTTTTTTTATAGTTATACCAATTA
TAATTGGAGGATTTGGTAATTGATTAGTACCTTTAATATTAGGAGCCCC
TGATATAGCTTTCCCCCGTATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCC
CCCTCATTAACCCTTTTAATTTCAAGAAGAATTGTAGAAAATGGAGCAG
GAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCTTCTAATATTGCTCATAG
AGGTAGATCTGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTTCACTTAGCTGGTATTT
CATCAATTTTAGGAGCAATTAATTTTATTACTACCATTATTAATATACG
ATTAAGAAATTTATCGTTTGATCAAATACCTTTATTTGTTTGAAGAGTT
GGAATTACAGCTTTCCTTCTACTTTTATCTTTACCTGTTTTAGCAGGTGC
TATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAATACATCCTTTTTTGACC
CTGCAGGAGGGGGAGATCCAATCCTTTATCAACATTTATTTTGATTTTT
CGGACATCCTGAAGTTTA (европейская раса)
ATTCAACAAATCATAAGGATATTGGAACCTTATATTTTATTTTTGGTATT
TGATCAGGAATAGTGGGAACATCTCTAAGTTTACTAATTCGAGCTGAAT
TAGGGAATCCTGGATCATTAATCGGAAATGATCAAATTTATAATACTAT
TGTTACAGCTCATGCATTTATCATAATTTTTTTTATAGTTATACCAATTA
TAATTGGAGGATTTGGTAATTGGTTAGTACCTTTAATATTAGGAGCCCC
TGATATAGCTTTCCCCCGTATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCC
CCCTCATTAACCCTTTTAATTTCAAGAAGAATTGTAGAAAATGGAGCAG
GAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCTTCTAATATTGCTCATAG
AGGTAGATCTGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTTCACTTAGCTGGTATTT
CATCAATTTTAGGAGCAATTAATTTTATTACTACCATTATTAATATACG
ATTAAGAAATTTATCGTTTGATCAAATACCTTTATTTGTTTGAAGAGTT
GGAATTACAGCTTTCCTTCTACTTTTATCTTTACCTGTTTTAGCAGGTGC
TATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAATACATCCTTTTTTGACC
CTGCAGGAGGGGGAGATCCAATCCTTTATCAACATTTATTTTGATTTTT
CGGACATCCTGAAGTTTA (азиатская раса)
У азиатской расы аденин (А) (подчеркнуто) заменен на гуанин (G).
5
Определение азиатской расы по результатам работ генетической
лаборатории ЦЗЛ Красноярского края может обуславливаться ошибками при
отборе и формировании образцов.
Поскольку образцы 2013 года были доставлены не только из
Тюменской, но и из Новосибирской области, где широко представлена
азиатская раса непарного шелкопряда, возможно, были сделаны ошибки
при их этикетировании.
Данные по обследованию лесничеств Новосибирской области в 2013
году приведены в таблице 2. Следует отметить, что в техническом задании на
выполнение работ генетической лабораторией ЦЗЛ Красноярского края эти
лесничества были заявлены как лесничества Тюменской области.
Таблица
2.
Расы
непарного
шелкопряда
Новосибирской области, определенные на основе
в
насаждениях
анализа COI гена с
применением рестрикции (2013 г.)
№
п/п
Лесничество
1
НСО, Болотнинский район, «Болотнинское
лесничество»
Отбор 2013 г., имаго
2
3
4
5
6
7
НСО, Венгеровский район, «Венгерово», кв. 33, отбор
2013 г., имаго.
НСО, Венгеровский район, «Венгерово», кв. 39, отбор
2013 г., имаго.
НСО, Венгеровский район, «Венгерово», кв. 37, отбор
2013 г., имаго.
НСО, Кыштовский район, «Кыштовское лесничество»
уч.№2, кв. 1, отбор 2013 г., имаго.
НСО, Кыштовский район, «Кыштовское лесничество»
уч.№2, кв. 6, отбор 2013 г., имаго.
НСО, Тогучинский район, «Мирновский лесхоз»,
отбор 2013 г., имаго
Раса
непарного
шелкопряда
Смешанная
Европейская
33.3%
Азиатская –
66.7%
Азиатская
Азиатская
Азиатская
Азиатская
Азиатская
Азиатская
6
№
п/п
8
9
10
Лесничество
Раса
непарного
шелкопряда
НСО, Усть-Тарский район, «Усть-Тарский лесхоз», кв.
Азиатская
215, отбор 2013 г., имаго.
НСО, Усть-Тарский район, «Усть-Тарский лесхоз», кв.
Европейская
204, отбор 2013 г., имаго
НСО, Чистоозерный район, «Чистоозерный лесхоз»,
Азиатская
отбор 2013 г., имаго
Для снятия указанных выше противоречий в результатах исследований
в 2014 году был выполнен дополнительный генетический анализ 120 особей
непарного шелкопряда в Тюменской области. Бабочки были отобраны
комиссионно, с применением сачков, акты отбора приведены в прилож. 1.
Всего обследовано 12 лесничеств. Исследование проводилось двумя
различными методами
-
методом рестрикции (прилож.
аллель-специфической
полимеразной
Последний был разработан
цепной
реакции
2)
и методом
(прилож.
3).
в лаборатории ФБУ «Рослесозащита»
специально для данного исследования.
Результаты генетического анализа образцов 2014 года с применением
обоих выше указанных методов приведены в таблице 3.
Таблица 3. Расы непарного шелкопряда в насаждениях Тюменской
области, определенные на основе анализа COI гена с применением аллельспецифической полимеразной цепной реакции и рестрикции (образцы 2014
года).
№
п/п
Лесничество
1
Богандинское, кв.187, выд. 3,
имаго - 10 особей, кладка - 1
Ситниковское, кв.53, выд.3, имаго
2
ампл.
рестр.
п.н.
143
А
G
Раса непарного
шелкопряда
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
7
№
п/п
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Лесничество
- 10 особей, кладка - 1
Армизонское, кв.2, выд. 21, имаго
- 10 особей, кладка - 2
Бердюжское, кв.22, выд.19, имаго
- 10 особей, кладка - 1
Ишимское, кв.100, выд. 15, имаго
- 10 особей, кладка - 1
Казанское, кв. 2, выд. 13, имаго 10 особей, кладка - 1
Сладковское, кв. 43, выд. 17,
имаго - 10 особей, кладка - 1
Абатское, кв.287, выд. 3, имаго 10 особей, кладка - 1
Викуловское, кв. 266, выд. 2,
имаго - 10 особей, кладка - 2
Сорокинское, кв. 209, выд. 34,
имаго - 10 особей, кладка - 2
Армашевское, кв. 464, выд. 19,
имаго - 10 особей, кладка - 2
Голышмановское, кв. 274, выд. 33,
имаго - 2 особи, кладка - 10
ампл.
рестр.
п.н.
А
G
Раса непарного
шелкопряда
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
Пояснения к таблице 3:
Ампл. рестр. п.н. – длина ампликона после рестрикции в парах
нуклеотидов, 161 п.н. – азиатская, 143 – европейская;
А – аллель-специфичный анализ на европейскую расу;
G - аллель-специфичный анализ на азиатскую расу;
+ - наличие ПЦР-продукта;
- отсутствие ПЦР-продукта.
Для подтверждения ранее полученных результатов
также сделан
аллель-специфичный анализ образцов, отобранных в 2012 году (табл. 4),
выделенная ДНК которых хранилась в течение 2-х лет при -20ºС в Отделе
лесной генетики ФБУ «Рослесозащита».
8
Таблица 4. Расы непарного шелкопряда в насаждениях Тюменской
области, определенные на основе анализа COI гена с применением аллельспецифической полимеразной цепной реакции (образцы 2012 года).
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Лесничество
Абабское л-во, Банниковское сх, кв.
283, выд.7,
N 56º05, 821×, E 70 º11,104 ×, отбор
07.08.2012, имаго.
Армизанское л-во, Ивановское сх,
кв.23, выд. 31,
N 56º05, 989×, E 67 º47,000 ×, отбор
06.08.2012, имаго.
Бердюжское л-во, Глубоковский сх,
кв.66, выд.1, координат нет, отбор
06.08.2012, имаго.
Голышмановское л-во, Медведевское
участковое, кв. 329, выд. 25,N 56º20,
111×, E 68 º30,843 ×, отбор 09.08.2012,
имаго.
Ишимское л-во, Новолоктинское сх,
кв.115, выд. 5, N 55º57, 007×, E 68
º56,433 ×, отбор 08.08.2012, имаго.
Казанское л-во, Дальнетравное сх, кв.
9, выд. 3, N 55º41, 863×, E 69 º00,616,
отбор 07.08.2012, имаго.
Сладковское л-во, Сладковское
участковое, кв. 50, выд. 48, N 55º30,
544×, E 70 º25,785×, отбор 07.08.2012,
имаго
Сорокинское л-во,
Сорокинскоеучастковое, кв.109, выд.2,
N 56º23, 240×, E 69 º49,470 ×, отбор
06.08.2012,
Омутинскоел-во, Ситниковское
участковое, кв.38, выд. 38, N 56º23,
507×, E 67 º49,488 ×, отбор 09.08.2012,
имаго.
ампл.
рестр.
п.н.
143
А
G
+
-
Раса
непарного
шелкопряда
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
143
+
-
Европейская
9
Пояснения к таблице 4:
Ампл. рестр. п.н. – длина ампликона после рестрикции в парах
нуклеотидов, 161 п.н. – азиатская, 143 – европейская;
А – аллель- специфичный анализ на европейскую расу;
G - аллель- специфичный анализ на азиатскую расу;
+ - наличие ПЦР-продукта;
- отсутствие ПЦР-продукта.
Сделать повторный анализ образцов 2013 года, исследованных в
генетической лаборатории ЦЗЛ Красноярского края, возможности не было.
После окончания договорных работ они были утилизированы по причине
недостаточного объема морозильных камер в генетической лаборатории
ЦЗЛ Красноярского края.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По итогам проведенных генетических исследований можно сделать
вывод о том, что в лесных насаждениях Тюменской области присутствует
европейская раса непарного шелкопряда.
Указанный
вывод
основан
на
результатах,
полученных
с
использованием двух различных методик.
Таким образом, подтверждены результаты генетических исследований
2012 г.
Определение в 2013 году азиатской расы
Голышмановском
и
Ишимском
лесничествах
непарного шелкопряда в
связано,
очевидно,
с
некорректным отбором исследованных образцов.
10
Приложение 1.
Копии актов комиссионного отбора образцов 2014 года
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Приложение 2
Методика определения расы непарного
шелкопряда методом рестрикции
1. Подготовка образцов и выделение ДНК.
Для анализа отделяли головогрудь имаго или брали 40 мг яйцекладки и
растирали стеклянным пестиком в буфере с рН 8,0 (2% бромид
цетрилтриметиламмония (СТАВ), 0,1 М трис, 1,4 М хлорид натрия, 20 мМ
ЭДТА натриевая соль). ДНК выделяли СТАВ-методом. Очистку от белков
производили хлороформом, для высаживания ДНК из раствора использовали
изопропиловый спирт, осадок ДНК троекратно отмывали 70% этиловым
спиртом. После высушивания полученный осадок ДНК растворяли в 50 мкл
деионизированной воды плотностью 18,2. Раствор ДНК использовали для
дальнейшего анализа.
2. Анализ ДНК.
Для
определения
расовой
принадлежности
особей
непарного
шелкопряда использовали рестрикционный анализ. Для этого полимеразную
цепную реакцию (ПЦР) проводили в 3 раунда.
1
раунд
ПЦР.
В
результате
ПЦР
с
праймерами
ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG (F)
TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA (R), был получен ампликон гена
COI состоящий из 709 пар нуклеотидов (п.н.) (фото 1), который разводили
деионизированной водой в 1000 раз и использовали для второго раунда ПЦР.
24
М
709
Фото 1. Электрофореграмма ампликона гена COI после 1 раунда ПЦР.
709 – количество пар нуклеотидов в ампликоне, М – маркер молекулярного
веса (снизу вверх) 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100,
50 п.н. Горизонтальный электрофорез, агароза 1,5%.
2 раунд ПЦР.
2-ой
рауд
ПЦР
производили
ATTGGAGGATTTGGTAATCG,
R
–
с
праймерами
F
ACAGTTCATCCTGTTCCTG,
–
в
результате которого получали короткий ампликон 161 п.н. (участок гена с
мутацией) (фото 2),
Зону расположения ампликона вырезали из агарозного геля, помещали
в насадку для дозаторов с фильтром (фото 3,4), замораживали при - 20ºС не
менее 15 часов для того, чтобы гель лопнул, центрифугировали при 15000g
10 мин., высаживали из полученного раствора ампликон изопропанолом,
осадок троекратно промывали 70% этиловым спиртом, высушивали,
растворяли в 20 мкл деионизированной воды, разводили в 1000 раз и
использовали для 3-го раунда ПЦР.
25
161
М
Фото 2. Электрофореграмма ампликона участка гена COI с мутацией
после 2 раунда ПЦР. 161 – количество пар нуклеотидов в ампликоне, М –
маркер молекулярного веса. Горизонтальный электрофорез, агароза 1,5%.
Визуализацию производили окрашиванием фрагментов ДНК в 0,02%
растворе бромистого этидия. Съемка сделана с помощью монохромной
видеокамеры. Фотографии представлены в виде негатива.
Фото 3,4. Подготовка вырезанного ампликона 161 п.н. для очистки и
последующей рестрикции.
3 раунд ПЦР. Использовали те же праймеры, что и во 2-м раунде.
Полученный ампликон 161 п.н. резали рестриктазой Tag 1 в течение 16
часов при температуре 65ºС.
Рестрикционная смесь составляли по
инструкции, приложенной к продажной рестриктазе. После 16-часовой
26
рестрикции проводили электрофорез в 2% агарозном геле параллельно с
исходным ампликоном.
27
Приложение 3.
Методика определения расовой принадлежности непарного
шелкопряда методом аллель-специфичной полимеразной
цепной реакции
Подготовка образцов и выделение ДНК.
Для анализа отделяли головогрудь имаго или брали 40 мг яйцекладки и
растирали стеклянным пестиком в буфере с рН 8.0 (2% бромид
цетрилтриметиламмония (СТАВ), 0.1 М трис, 1.4 М хлорид натрия, 20 мМ
ЭДТА натриевая соль). ДНК выделяли СТАВ-методом (Падутов В. Е. и др.,
2007), модифицированным. Очистку от белков производили хлороформом,
для осаждения ДНК из раствора использовали изопропиловый спирт, осадок
ДНК троекратно отмывали 70% этиловым спиртом. После высушивания
полученный осадок ДНК растворяли в 50 мкл деионизированной воды.
Раствор ДНК использовали для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК.
Для
определения
расовой
принадлежности
особей
непарного
шелкопряда использовали аллель-специфическую полимеразную цепную
реакцию.
Вследствие
того,
что
оригинальная
нуклеотидная
последовательность (в районе 196 позиции) для азиатской расы содержит G
(гуанин), а для европейской расы содержит А (аденин), то нами были
подобраны доминантные аллель специфические праймеры способные
различать L. dispar dispar f. Asiatica от L. dispar dispar f. Europe. Праймеры
были оптимизированы таким образом, чтобы можно было определить
Европейскую
расу
в
оду
стадию
ПЦР
(missF-endA
-
ATTGGAGGATTTGGTAATCGA,
missF-endG
-
ATTGGAGGATTTGGTAATCGG,
missR-HRM
-
gtaataatcaAAATCttataTTATTTATAC). Образцы, показывающие отсутствие
ПЦР продукта подвергали проверке на наличие Азиатского аллеля.
28
ПЦР-смесь была основана на применении коммерческого набора Смесь
2-bluе (Интерлабсервис, РФ). Режим амплификации состоял: 1 цикл
(денатурация) - 95º С, 2 мин (1х); 2 цикл – денатурация - 95 º С, 10 сек., отжиг
- 60 º С, 15 сек., элонгация - 72 º С, 5 сек. (37х), 3 цикл(элонгация) - 72 º С, 2
мин. (1х).
Полученный продукт ПЦР (рисунок 1) разгоняли в 1,8% агарозном геле
на
основе
0,5Х
ТБЕ.
На
рисунке
1
представлена
нуклеотидная
последовательность локуса, амплифицированного с праймерами missF-endA
и missR-HRM.
Рисунок 1
Нуклеотидная последовательность ампликона COI гена,
(праймеры missF и missR).
Электрофореграмма ПЦР-продукта представлена на рисунке 2.
Рисунок 2 Электрофореграмма ампликона фрагмента COI гена (праймеры
missF-endA и missR-HRM)
95 п.н.
Интерпретация электрофореграмм:
Европейская раса – определяется по наличию ПЦР продукта при
амплификации с праймерами missF-endA и missR-HRM.
29
Азиатская раса
– определяется по отсутствию ПЦР продукта при
амплификации с праймерами missF-endA и missR-HRM и наличии продукта
при амлпификации с праймерами missF-endG и missR-HRM. Отсутствие
продукта ПЦР с обоими наборами праймеров говорит об отсутствии
подходящей матрицы в образце ДНК или о плохом ее качестве.
30