Открытое занятие на тему: «Поиск вещества наследственности

Открытое занятие на тему:
« Поиск вещества наследственности»
Разработчик –
Бохан Виолетта Валерьевна,
учитель биологии
МБОУ «Средняя школа № 10»
Петропавловск – Камчатский
2015
1
Данную работу можно рекомендовать к проведению на уроках
биологии в 9 - 10 классах по темам раздела: «Учение о клетке»; на
занятиях
кружка
по
предмету
биологии
провести
исследовательскую работу, поставить эксперимент.
За основу взят метод, предложенный В. Артамоновой в
популярной статье «Как увидеть ДНК» (Химия и жизнь,
Школьный клуб, 2002, №2),
Тема занятия: « Поиск вещества наследственности»
Возраст учащихся: 16 – 17 лет.
Продолжительность занятия – 90 минут.
Тип занятия – творческая лаборатория, эксперимент.
Цель занятия – формирование и развитие устойчивой положительной мотивации к
познавательной деятельности, творческих способностей, представления о простейших
методах биотехнологии на примере выделения молекулы ДНК; формирование
экологической культуры и развития интереса к научной работе.
Задачи:
● Образовательные: актуализация теоретических знаний о строении функциях молекулы
ДНК в процессе выполнения практических заданий; проконтролировать степень усвоения
основных умений и навыков безопасной и эффективной работы с микрооборудованием,
изученных и сформированных на предыдущих учебных курсах обучения биологии;
формирование первоначального представления о биологических объектах исследования, о
простых методах биотехнологии; самостоятельно выделить кристаллы молекулы ДНК из
ткани животного или растения.
● Развивающие: развитие умения наблюдать за происходящими процессами и
фиксировать результаты наблюдений (синтезировать, анализировать, сравнивать и
обобщать); формирование умения планирование предстоящей деятельности, поиском
способов решения поставленной проблемы, содержательной и личностной рефлексии,
контролем и самооценкой достигнутого.
● Воспитательные: воспитание положительной мотивации учения, умения работать
индивидуально и в группах, настойчивости и терпения в работе с объектами для
исследования; развитие умения радоваться успехам одноклассников, сочувствовать их
неудачам; формирование экологического воспитания, понимания полезности и важности
исследовательской деятельности в научной работе.
Технологии: технология исследовательской деятельности, постановки эксперимента,
информационная технология, технология проблемного обучения.
Формы организации учебной деятельности: фронтальный диалог, самостоятельная
работа, индивидуальная работа (микроскопирование), работа в группах
2
Объект исследования:
Выделенные из тканей животного и растения молекулы ДНК
Оборудование:
Демонстрационный материал: таблицы и фотографии с изображением молекулы ДНК,
портреты ученых, графическое изображение хода работы.
Материал для исследования:
- продукты для исследования: зелёный горошек, куриная печень, репчатый лук;
(можно экспериментировать с другими продуктами, содержащие большое количество
ДНК) Используются продукты только свежие!!!
- продукт для исследования – 100 мл (полстакана);
- для приготовления буфера: стакан с холодной водой – 200 мл, соль
(Na Cl) 1,5 г (1/4 ч. л.); 5 г (1 ч. л.) питьевой соды;
- детергент: жидкое моющее средство (без добавок) 1-2 столовые ложки (можно средство для мытья посуды - «Fairy»);
- пробирки, стеклянная посуда;
- раствор для контактных линз - несколько капель или сок свежевыжатого ананаса 1 : 1, к
2 мл суспензии – 2 мл ананасового сока (освобождает ДНК от гистоновых белков,
покрывающих ее своеобразной «шубой»).
- этиловый спирт 95% 15-30 мл;
- миксер для дробления ткани на клетки;
- марля для фильтрации;
- микроскопы
- предметные стёкла, пипетки, и другие емкости для выполнения лабораторной работы
- карточки – инструкции, пишущие принадлежности.
Накануне занятия: в целях экономия времени и наличии одного миксера, можно
приготовить две суспензии перед проведением занятия (например, суспензию из зеленого
гороха и куриной печени для первой и второй группы). Представитель третей группы
будет демонстрировать приготовление суспензии их репчатого лука перед учащимися в
ходе занятия (п. 1 в ходе лабораторной работы, приложение)
Ход занятия
1. Организационная часть
3
Учитель предлагает учащимся распределиться по группам, выбрав карточки в виде
бабочек. Учащиеся, выбрав зеленые карточки, проходят и занимают места за столом 1
группы, где буду выделять ДНК из зеленого горошка; 2 группа - желтые карточки – из
репчатого лука; 3 группа - синие карточки – из куриной печени.
● Прежде чем приступить к лабораторной работе, необходимо провести инструктаж по
технике безопасности, вспомнить основные правила работы с микроскопом, на столах у
каждого учащегося лежат карточки-инструкции (приложение).
Учитель здоровается с учащимися.
2. Актуализация знаний
Учитель: Наследственность, гены, ДНК… Эти научные термины знает каждый
старшеклассник, не говоря уже о студентах. Но никакой ДНК большинство из нас никогда
не видело, хотя получить кристаллы молекулы ДНК можно и в условиях школы.
Сегодня мы с вами попробуем выделить ДНК из растительных и животных тканей. Для
проведения эксперимента вам будут предложены продукты: репчатый лук, зелёный горох,
куриная печень. Наука утверждает, что в этих продуктах больше содержится ДНК.
Например, в луковице меньше межклеточного вещества и больше клеток. А почему
зелёный горох? Чем является горох для растения? (в семенах содержится большое
количество питательных веществ). Во всех трех продуктах содержится большое
количество питательных веществ, следовательно, больше ДНК. Давайте с вами вспомним:
Что такое молекула ДНК? Где она содержится? Какую функцию она выполняет?
Когда и кто открыл впервые молекулу ДНК? Кем были сформированы
представления и создана модель структуры ДНК? Как, кем и когда была доказана
генетическая роль ДНК? (учитель демонстрирует по ходу ответов учащихся
портреты ученых и фотографии молекулы ДНК на доске)
Учитель: Накануне я задала вам найти интересные научные факты в области генной
инженерии, биотехнологии. Кто нашел, поделитесь с нами (учащиеся озвучивают
факты)
Учитель: Изучая тему, нуклеиновые кислоты вы привыкли работать с такой
иллюстрацией, которая представлена на таблице (обращает внимание на таблицу с
изображением молекулы ДНК), но можно её увидеть иной, рассмотреть самим под
микроскопом (демонстрирует фотографии молекулы ДНК, как она выглядит под
микроскопом).
Целью нашей работы будет формирование представления о простейших методах
биотехнологии, на примере выделения молекулы ДНК в ходе проведения
эксперимента.
3. Практическая часть занятия
4
Учитель: В карточках-инструкциях у вас есть протокол исследовательской работы. По
ходу работы заполните протокол, ответьте на вопросы. Работа состоит из 7 этапов,
каждый этап мы с вами проходим вместе, заполняем протокол. Обратить внимание на
необходимость строгого соблюдения инструкции!
Поисковую деятельность учащихся учитель организует по решению проблемного
вопроса, необходимо пояснять учащимся, что они делают и для чего.
Необходимо назначить учащегося, по желанию, который бы контролировал, отвечал за
время, отведенное для каждого этапа.
Вопрос: «Предположите, что нужно сделать, чтобы увидеть молекулу ДНК?»
При организации беседы надо подвести учащихся к тому, что способ извлечения есть
результат «упаковки», т.е. зная, как упакована, молекула ДНК в клетке, мы должны ее
распаковать. Что такое мембрана? Строение мембраны? Какую функцию она
выполняет? Строение мембраны (белково-липидный слой) она «упакована», необходимо
разрушить этот слой.
Для проведения первого этапа эксперимента приглашаем
учащегося второй группы к лабораторному столу,
который продемонстрирует получения «горохово клеточного супа» из репчатого лука.
На столах у первой и второй группах стоят готовые
суспензии исследуемых продуктов.
1 этап. Возьмите приготовленную смесь продукта
для исследования («горохово - клеточный суп»)
Дробим ткань на клетки. Положите в миксер продукт для
исследования. Добавьте соли (уравниваем давления клетках, чтобы
они не полопались раньше времени) и 200 мл (стакан) холодной воды.
Взбивайте в течение 15 - 20 секунд. Миксер «сварит» вам гороховоклеточный суп.
2 этап. Высвобождение макромолекулы: процедите смесь через двойной слой
марли, отожмите (для удаления из клеточной суспензии всевозможных примесей).
5
Что касается фильтрации, то она нужна для того, чтобы механически
удалить из клеточной суспензии всевозможные примеси, в том числе,
крупные куски ткани — всё равно те вещества, которыми мы
собираемся обрабатывать смесь, не смогут проникнуть глубоко внутрь
таких конгломератов, и для выделения ДНК они окажутся
бесполезными.
Вопрос: Что нужно сделать с этими клетками, чтобы получить из них молекулу
ДНК? В домашних условиях вы избавляетесь от жира, оставленного на посуде Чем?
(моющее средство)
После того, как вы собрали клетки, их необходимо лизировать (разрушить), чтобы
высвободить ДНК. Мембраны клеток сделаны из жиров и белка и детергент (моющее
средство) растворяет их точно так же, как растворяет жиры и белки на грязной
сковородке. Процесс разрушения клеток называется лизисом, а содержащий детергент
раствор – буфером для лизиса. После растворения мембран, ДНК оказывается в
растворе.
3 этап. Обрабатываем детергентом: в полученную суспензию добавьте 2 столовые
ложки жидкого моющего средства и хорошо размешайте стеклянной палочкой. Оставьте
на 5-10 минут.
В результате такой обработки всё клеточное содержимое вывалится
наружу и окажется в растворе, который сделается при этом очень
вязким, тягучим и существенно более прозрачным, чем была клеточная
суспензия. Изменение консистенции раствора — верный знак того, что
лизис прошёл успешно.
Пока ждем 5- 10 минут, заполняем протокол.
4 этап. Разлейте жидкость по пробиркам, чтобы в каждой было заполнено не больше
трети объема.
Вопрос: Как вы думаете, будет ли ДНК видна после того, как вы разрушили клетки?
Почему вы так думаете? Можно ли увидеть молекулы ДНК по отдельности или
только при большом скоплении? Каким органическим веществом защищена ДНК?
Чтобы увидеть молекулу, нужно ли его удалить?
Необходим фермент, который расщепляет любые оставшиеся клеточные или
мембранные белки, которые могут помешать выделению ДНК, чтобы молекулы ДНК из
разных клеток собрались в один большой комок.
5 этап. Освобождаем от белков: добавьте в каждую пробирку по чуть-чуть
(несколько капель) раствора для контактных линз и осторожно встряхните, переворачивая
6
и наклоняя пробирку (если будете трясти слишком рьяно, разломаете ДНК и ничего
не увидите). Клеточная масса сжимается и опускается на дно пробирки. По времени
процесс идет 10-15 минут. О том, что белки разрушены можно судить по уменьшению
вязкости раствора.
Этап очистки ДНК от остаточных белков с помощью специальных
ферментов, способных разрушать эти молекулы. О том, что ферменты
сработали, можно судить по уменьшению вязкости раствора
Пока мы ждем 10 -15 минут один из учащихся демонстрирует эксперимент получения
ДНК из слизистой полости рта, заполняем протокол.
Вопрос: Если бы мы выделяли ВАШУ молекулу
ДНК, то какие клетки своего организмы вы могли
бы предложить для этого?
Подводим учащихся к мысли о слюне, которая
содержит клетки эпителия слизистой оболочки рта.
Для того, чтобы собрать тысячи клеток достаточно
просто слегка пожевать внутренние поверхности щек
и промыть рот водой. Эпителиальные клетки внутри
вашего рта делятся один или два раза в день. Старые
клетки постоянно слущиваются, а их место занимают
новые. Это происходит каждый раз, когда вы едите.
Карточка – инструкция. Выделение своей собственной ДНК
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
1 ч. л. моющего средства развести 3 ч. л. воды
В 250 мл воды растворить 0,5 ч. л. соли
Отлить 6 ч. л. в чистый стакан
Прополоскать рот солёной водой в течение 1 минуты
Смешать полученный раствор с моющим средством (п. №1)
Добавить в раствор несколько капель жидкости для линз
Осторожно влить ледяной спирт в раствор (1:1),
Поставить на сутки в холодильник
Вопрос: Как «собрать» молекулы ДНК в один комок, чтобы сделать их видимыми?
Почему спирт должен быть холодным? Чем более холодный спирт вы берете, тем
хуже растворяется ДНК – это можно сравнить с тем, как сахар хуже растворяется в
холодном чае, чем в горячем.
6 этап. Осаждение ДНК из раствора Этот этап – самый ответственный: наклоните
пробирку и медленно влейте в нее немного этилового спирта, чтобы он образовал
слой поверх гороховой смеси. Лейте, пока спирта и смеси не окажется поровну. ДНК
всплывет наверх в виде хлопьев. Приливать спирт в пробирку с ДНК-содержащей
смесью следует осторожно пипеткой по стенкам пробирки, наслаивая его сверху.
Когда нижние слои спирта смешаются с раствором ДНК, начнется процесс
7
кристаллизации нуклеиновых кислот, и они всплывут
в виде белого облачка (количество спирта 1: 1).
Вопрос: Как можно установить, что в слюне, в
суспензиях
действительно есть клетки? Какое
лабораторное
оборудование
можно
для
этого
использовать? (посмотреть в микроскоп)
7 этап. Осторожно, лучше пипеткой следует взять каплю
этого облачка и поместить на предметное стекло.
Покровным стеклом пользоваться не надо, так как
концентрация ДНК в растворе невелика, в тонком слое
жидкости увидеть ее сложнее. Спирт испаряется быстро, и фрагменты ДНК быстро
разрушаются, поэтому каплю следует сразу поместить под микроскоп. Вы увидите чистые
кристаллы ДНК, похожие на клубки спутанных нитей.
3 Защита, подведение итогов, выводы
Группы демонстрируют свои полученные результаты, заполняют протоколы
исследования, делают выводы
Что же мы получили?
Конечно, увеличение школьного микроскопа не
позволит увидеть структуру молекулы, и определить
какие гены она содержит. Но чистые кристаллы ДНК
в виде спутанных клубков, нитей, «червячков» и
«запятых» видно при увеличении школьного
микроскопа совершенно отчетливо.
4 Рефлексия
Сделайте вывод своей работы, можно выбрать из
предложенного списка начало фразы и закончить её своими суждениями:
Сегодня я узнал…; было интересно…; было трудно…; я выполнил задание…; я понял,
что…; я приобрёл…; я научился…; у меня получилось…, я смог…; я попробую…; мне
захотелось… и т. д
Сегодня я работал (активно / пассивно);
своей работой я (доволен / не доволен
Вывод:
Домашнее задание (по выбору учащихся):
1. На примере опытов Эвери, Мак Леода, Мак Карти и других учёных докажите
значение биологического эксперимента для создания теории (ответ оформите в
виде презентации)
2. Докажите ведущую роль ДНК в хранении и передаче наследственной
информации (ответ оформите в виде презентации).
3. Сконструируйте модель молекулы ДНК
8
Поиск вещества
наследственности
Лабораторная работа «Выделение ДНК»
Цель: Сформировать представление о простейших
методах биотехнологии, на примере выделения молекулы ДНК.
Объект исследования:
Выделенные из тканей растения или животного молекулы ДНК
Оборудование:
- продукты для исследования: зелёный горошек – 100 мл (полстакана);
- для приготовления буфера: стакан с холодной водой – 200 мл, соль
(Na Cl) 1,5 г (1/4 ч. л.); 5 г (1 ч. л.) питьевой соды;
- детергент: жидкое моющее средство (без добавок) 1-2 столовые ложки;
- пробирки, стеклянная посуда;
- раствор для контактных линз - несколько капель;
- этиловый спирт 95% 15-30 мл;
- миксер для дробления ткани на клетки;
- марля для фильтрации;
- микроскопы
- предметные стёкла, пипетки;
- карточки - инструкции, пишущие принадлежности.
9
Поиск вещества
наследственности
Лабораторная работа «Выделение ДНК»
Цель: Сформировать представление о простейших методах биотехнологии,
на примере выделения молекулы ДНК.
Объект исследования:
Выделенные из тканей растения или животного молекулы ДНК
Оборудование:
- продукты для исследования: репчатый лук – 100 мл (полстакана);
- для приготовления буфера: стакан с холодной водой – 200 мл, соль
(Na Cl) 1,5 г (1/4 ч. л.); 5 г (1 ч. л.) питьевой соды;
- детергент: жидкое моющее средство (без добавок) 1-2 столовые ложки;
- пробирки, стеклянная посуда;
- раствор для контактных линз - несколько капель;
- этиловый спирт 95% 15-30 мл;
- миксер для дробления ткани на клетки;
- марля для фильтрации;
- микроскопы
- предметные стёкла, пипетки;
- карточки - инструкции, пишущие принадлежности.
10
Поиск вещества
наследственности
Лабораторная работа «Выделение ДНК»
Цель: Сформировать представление о простейших методах биотехнологии,
на примере выделения молекулы ДНК.
Объект исследования:
Выделенные из тканей растения или животного молекулы ДНК
Оборудование:
- продукты для исследования: куриная печень – 100 мл (полстакана);
- для приготовления буфера: стакан с холодной водой – 200 мл, соль
(Na Cl) 1,5 г (1/4 ч. л.); 5 г (1 ч. л.) питьевой соды;
- детергент: жидкое моющее средство (без добавок) 1-2 столовые ложки;
- пробирки, стеклянная посуда;
- раствор для контактных линз - несколько капель;
- этиловый спирт 95% 15-30 мл;
- миксер для дробления ткани на клетки;
- марля для фильтрации;
- микроскопы
- предметные стёкла, пипетки;
- карточки - инструкции, пишущие принадлежности.
11
Ход работы
1. Возьмите приготовленную смесь продукта для исследования
(«горохово - клеточный суп»)
Дробим ткань на клетки. Положите в миксер продукт для
исследования. Добавьте соли (уравниваем давления клетках, чтобы
они не полопались раньше времени) и 200 мл (стакан) холодной воды.
Взбивайте в течение 15 - 20 секунд. Миксер «сварит» вам гороховоклеточный суп.
2. Высвобождение макромолекулы: процедите смесь через двойной
слой марли, отожмите (для удаления из клеточной суспензии
всевозможных примесей).
Что касается фильтрации, то она нужна для того, чтобы механически
удалить из клеточной суспензии всевозможные примеси, в том числе,
крупные куски ткани — всё равно те вещества, которыми мы
собираемся обрабатывать смесь, не смогут проникнуть глубоко внутрь
таких конгломератов, и для выделения ДНК они окажутся
бесполезными.
3. Обрабатываем детергентом: в полученную суспензию добавьте 2
столовые ложки жидкого моющего средства и хорошо размешайте
стеклянной палочкой. Оставьте на 5-10 минут.
В результате такой обработки всё клеточное содержимое вывалится
наружу и окажется в растворе, который сделается при этом очень
вязким, тягучим и существенно более прозрачным, чем была клеточная
суспензия. Изменение консистенции раствора — верный знак того, что
лизис прошёл успешно.
12
4. Разлейте жидкость по пробиркам, чтобы в каждой было заполнено не
больше трети объема.
5.Освобождаем от белков: добавьте в каждую пробирку по чуть-чуть
(несколько капель) раствора для контактных линз и осторожно встряхните,
переворачивая и наклоняя пробирку (если будете трясти слишком рьяно,
разломаете ДНК и ничего не увидите). Клеточная масса сжимается и
опускается на дно пробирки. По времени процесс идет 10-15 минут. О том,
что белки разрушены можно судить по уменьшению вязкости раствора.
Этап очистки ДНК от остаточных белков с помощью специальных
ферментов, способных разрушать эти молекулы. О том, что ферменты
сработали, можно судить по уменьшению вязкости раствора
6. Осаждение ДНК из раствора Этот этап – самый ответственный:
наклоните пробирку и медленно влейте в нее немного этилового спирта,
чтобы он образовал слой поверх гороховой смеси. Лейте, пока спирта и
смеси не окажется поровну. ДНК всплывет наверх в виде хлопьев.
Приливать спирт в пробирку с ДНК-содержащей смесью следует осторожно
пипеткой по стенкам пробирки, наслаивая его сверху. Когда нижние слои
спирта смешаются с раствором ДНК, начнется процесс кристаллизации
нуклеиновых кислот, и они всплывут в виде белого облачка. ( количество
спирта 1: 1)
7. Осторожно, лучше пипеткой следует взять каплю этого облачка и
поместить на предметное стекло. Покровным стеклом пользоваться не надо,
так как концентрация ДНК в растворе невелика, в тонком слое жидкости
увидеть ее сложнее. Спирт испаряется быстро, и фрагменты ДНК быстро
разрушаются, поэтому каплю следует сразу поместить под микроскоп. Вы
увидите чистые кристаллы ДНК, похожие на клубки спутанных нитей.
Что же мы получили?
Конечно, увеличение школьного микроскопа не позволит увидеть структуру
молекулы, и определить какие гены она содержит. Но чистые кристаллы
ДНК в виде спутанных клубков, нитей, «червячков» и «запятых» видно
при увеличении школьного микроскопа совершенно отчетливо.
13
Протокол исследовательской работы «ВЫДЕЛЕНИЕ
ДНК».
Ф.И. УЧАЩЕГОСЯ, ВЫДЕЛЯЕМОЙ МОЛЕКУЛЫ ДНК
______________________________________________________
ЭТАПЫ 1 - 4. СБОР И ЛИЗИС КЛЕТОК.
Что делали?
Что
наблюдали?
(результаты)
Были сложности?
Что
наблюдали?
(результаты)
Были сложности?
Какие?
ЭТАП 5. УДАЛЕНИЕ БЕЛКОВ.
Что делали?
Какие?
ЭТАП 6 - 7. ДЕЛАЕМ ДНК ВИДИМОЙ.
Что делали?
Что
наблюдали?
(результаты)
Были сложности?
Какие?
14
Сделайте вывод своей работы, можно выбрать из предложенного списка
начало фразы и закончить её своими суждениями:
Сегодня я узнал…; было интересно…; было трудно…; я выполнил
задание…; я понял, что…; я приобрёл…; я научился…; у меня
получилось…, я смог…; я попробую…; мне захотелось… и т. д
Сегодня я работал (активно / пассивно);
своей работой я (доволен / не доволен)
Вывод:
Домашнее задание (по выбору учащихся):
1.
На примере опытов Эвери, Мак Леода, Мак Карти и
других учёных докажите значение биологического эксперимента для
создания теории (ответ оформите в виде презентации)
2.
Докажите ведущую роль ДНК в хранении и передаче
наследственной информации (ответ оформите в виде презентации).
3.
Сконструируйте модель молекулы ДНК
15
ПРАВИЛА РАБОТЫ С МИКРОСКОПОМ
1.
Поставьте микроскоп штативом к себе на
расстоянии 5-10 см от края стола.
2.
В
отверстие
предметного
столика
направьте зеркалом свет; добейтесь хорошего
освещения поля зрения.
3. Поместите приготовленный препарат на предметный столик и закрепите
предметное стекло зажимами.
4. Пользуясь винтом, плавно опустите тубус так, чтобы нижний край
объектива оказался на расстоянии 1–2 мм от препарата; будьте
осторожны, чтобы не раздавить очень тонкое и хрупкое покровное стекло.
5. Глядя в окуляр одним глазом (не закрывая и не зажмуривая другой), при
помощи винтов медленно поднимайте тубус, пока не появится чёткое
изображение предмета.
6. Помните, что любое ваше движение (а особенно перемещение по классу)
может нарушить освещённость микроскопа соседей.
7. Микроскоп – хрупкий и дорогой прибор, и поэтому обращаться с ним
нужно аккуратно, строго следуя правилам.
«Дороже алмаза твои глаза» – гласит народная пословица. Пока люди
ещё не создали такой прибор, который мог бы заменить им глаза.
16
Устройство светового микроскопа
17
Приложение
Дополнительная информация
Конечно, для научных работников эта инструкция — в какойто степени шутка и никто из них ДНК таким способом не
выделяет, а между тем если и вправду воспользоваться ею, то
всё получится! Выход ДНК будет, правда, невелик, а вещество — не особенно чистым, но
увидеть в микроскоп длинные тонкие нити — кристаллы ДНК — вполне возможно.
Что же происходит с зелёным горошком или куриной печёнкой в процессе описанных
манипуляций и почему, в конечном счете, ДНК оказывается отделённой от всех
остальных веществ, которых в клетке великое множество?
1. Выбор объекта
Найдите что-то, что содержит много ДНК. Например, зеленый горошек (но можно
куриную печенку, селедочные молоки или лук).
ДНК, как известно, есть в каждой клетке, а значит, выделить её можно из любой ткани —
даже из костей животных, чешуи рыб или древесины, где клеток не так уж много по
сравнению с объёмом внеклеточного вещества.
Во всех тканях организма, как животного, так и растения, ДНК, как правило, одинакова.
Отличаются эти ткани тем, что в одних из них помимо вещества наследственности больше
почти ничего нет (молоки селёдки), а в других, таких, как костная ткань, содержание ДНК
относительно невелико. Кроме того, существуют ткани, в клетках которых имеется
удвоенный набор хромосом (к тетраплоидным относятся, в частности, клетки печени), а
потому и ДНК в них в два раза больше, чем во всех остальных. В семенах растений
относительное, содержание ДНК выше, чем в стебле, а из молодых растущих побегов её
можно выделить существенно больше, чем из такого же по объёму куска одревесневшего
ствола.
В общем, если перед исследователем не стоит какой-то специальной задачи, он старается
выбрать для работы ткань, в которой мало межклеточного вещества и много самих клеток.
Причём желательно, чтобы ткань легко распадалась на эти составляющие, а клетки не
были перегружены белками (как мышечные), липидами (как жировые) или
полисахаридами (как клетки мозга).
2. Дробим ткань на клетки
В миксере ткань, из которой мы собираемся добыть вещество наследственности,
распадается на отдельные клетки: чтобы механически разорвать связи между ними
требуется, как правило, гораздо меньше усилий, чем для того, чтобы повредить саму
клетку. И поскольку при нашем способе выделения ДНК требуются более или менее
целые, неповреждённые клетки, ясно, что консервированный горошек или солёная
селёдка для такого эксперимента не годятся, — лучше уж взять что-нибудь
18
свежезамороженное, если вы уверены, что продукт не размораживали в процессе
хранения несколько раз.
А немного соли нужно добавить в раствор для того, чтобы клетки не полопались раньше
времени: давление внутреннего содержимого на клеточную мембрану изнутри
уравновешивают давлением соляного раствора снаружи.
3. Высвобождаем макромолекулу
Что касается фильтрации, то она нужна для того, чтобы механически удалить из
клеточной суспензии всевозможные примеси, в том числе, крупные куски ткани — всё
равно те вещества, которыми мы собираемся обрабатывать смесь, не смогут проникнуть
глубоко внутрь таких конгломератов, и для выделения ДНК они окажутся бесполезными.
А обработать полученные клетки следует, в первую очередь, каким-нибудь детергентом.
Средство „Ферри“, способное, согласно рекламе, легко отмыть самую жирную посуду,
годится и для того, чтобы наделать больших дырок в липидной мембране, как самой
клетки, так и её ядра. Если нет жидкого моющего средства, можно сделать
концентрированный раствор стирального порошка — тоже подойдет.
В результате такой обработки всё клеточное содержимое вывалится наружу и окажется в
растворе, который сделается при этом очень вязким, тягучим и существенно более
прозрачным, чем была клеточная суспензия. Изменение консистенции раствора — верный
знак того, что лизис прошёл успешно.
4. Тут всё ясно и без комментариев — не наливайте слишком много раствора в ёмкость,
туда предстоит ещё много чего налить, к тому же, если смеси будет в избытке, её будет
трудно перемешать.
5. Освобождаемся от белков
Чего только нет в нашей смеси! Однако белков здесь — больше всего, причём именно они
образуют самые прочные комплексы с ДНК. Существуют методики, когда белки удаляют
из раствора в несколько этапов. Например, часть из них легко денатурирует и выпадает в
осадок при добавлении концентрированных растворов солей. В лабораторных условиях
такие приёмы прекрасно работают, а от осадка исследователи освобождаются, помещая
пробирки на несколько минут в центрифугу. После этого все более или менее крупные
клеточные обломки, денатурированные белки и другие примеси оказываются на дне,
образуя очень плотный осадок, и перелить в другую пробирку надосадочную жидкость,
содержащую в основном нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК, — труда не составляет.
Однако в домашних условиях этот этап очистки нам придётся пропустить, пожертвовав
частью интересующего нас вещества, — оно так и останется „в белковом плену“.
Мы сразу же перейдём к очистке ДНК от остаточных белков с помощью специальных
ферментов, способных разрушать эти молекулы. Именно такие вещества содержит сок
ананаса. Сами они — тоже белки, поэтому ананас, из которого выжимают сок, должен
быть свежим: у ферментов нет ни малейшего шанса сохраниться неизменными в компоте
или в консервированном продукте. Что же касается раствора для очистки линз, то если вы
собираетесь использовать его — не забудьте положить таблетку для удаления белковых
19
отложений! Сами по себе растворы для хранения контактных линз никаких активных
веществ не содержат — иначе и нашим глазам не поздоровилось бы.
О том, что ферменты сработали, можно судить по уменьшению вязкости раствора. Если
этого не происходит, поместите смесь в тёплое место (примерно 37°С) на полчаса, иногда
может потребоваться добавить больше ананасового сока или раствора для очистки линз.
6. Осаждаем ДНК из раствора
Теперь ДНК плавает в растворе сама по себе. Белки больше не цепляются за неё, хотя
обломков всевозможных молекул в смеси по-прежнему много. В лабораторных условиях
эти ненужные фрагменты убирают, тщательно перемешивая раствор с фенолом и/или
хлороформом. Органические растворители, способные забирать белки „на себя“, тяжелее
воды, а потому при последующем расслоении смеси в центрифуге они опускаются на дно.
После центрифугирования внизу пробирки оказываются фенол и/или хлороформ с
растворёнными в них белками, а вверху — водная фаза, содержащая ДНК. Водную фазу
собирают в отдельную пробирку и дальше работают уже с относительно чистым
раствором.
За неимением центрифуги и органических растворителей, работа с которыми требует к
тому же специальных мер безопасности, этот этап очистки в домашних условиях
приходится пропустить и осаждать ДНК прямо из „грязного“ раствора.
Заметим сразу — заменить этиловый спирт водкой или духами нельзя: если концентрация
спирта будет низкой и упадёт при смешивании с водной фазой до 60-65%, ДНК в
кристаллическое состояние не перейдёт. Отчасти именно по этой причине наливать спирт
в пробирку с ДНК-содержащей смесью следует осторожно, наслаивая его сверху. Тогда
нижние слои спирта частично смешаются с раствором ДНК, начнётся процесс
кристаллизации нуклеиновых кислот, и они всплывут на поверхность (где спирт более
концентрированный) в виде хлопьев.
Если же налить спирт сверху не получится и всё безнадёжно перемешается, то при малом
количестве этанола у вас вообще ничего не получится, а при большом начнёт
кристаллизоваться не только ДНК: в осадок выпадут и остатки белков, и кое-что ещё из
исходного содержимого клеток.
7. Что же мы получили?
Чистые кристаллы ДНК похожи на клубки спутанных нитей, но не надо забывать, что вы
видите именно кристаллы вещества, а не его макромолекулы, и сказать по их внешнему
виду, какие гены содержит выделенная вами нуклеиновая кислота, конечно, невозможно.
Чтобы узнать это, придётся снова растворять ДНК. Впрочем, „прочесть“
последовательность нуклеотидов в домашних условиях, увы, невозможно: для этого
нужны не только специальные приборы, но и дорогие реактивы.
Однако если вы уже хорошо рассмотрели кристаллы и они успели подсохнуть, можете
понаблюдать за тем, как ДНК растворяется. Она в начале набухает, становясь похожей на
студенистую медузу, и лишь спустя несколько дней раствор делается однородным.
Процесс можно ускорить, если пробирку почаще встряхивать.
20
Выделение ДНК …
21
22