Инструкция - ИнтерЛабСервис
advertisement
ОКП УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор ООО «ИнтерЛабСервис» И. А. Гущина __________ «____» 2011 г. Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией HRM Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» Соответствует требованиям национальных стандартов и технической документации изготовителя ОГЛАВЛЕНИЕ 1. НАЗНАЧЕНИЕ .....................................................................................................................3 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА ........................................................................................3 2.1 2.2 ПРИНЦИП МЕТОДА ............................................................................................................3 СОСТАВ НАБОРА................................................................................................................7 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ...................8 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ .....................................................................................9 5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ ...............................................................................9 6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ ....................................................................................10 7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА...............................................................................................10 8. РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ .............................................26 9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА .........................................40 2 1. НАЗНАЧЕНИЕ Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании RotorGene Q серии 5plex HRM (или Rotor-Gene Q серии 6) производятся компанией QIAGEN ведущим поставщиком инновационных технологий обработки образцов и проведения исследований. QIAGEN устанавливает стандарты в следующих областях: Очистка РНК, ДНК и белков Исследование нуклеиновых кислот и белков Исследование микроРНК и РНК-интерференции Выявление генетических и эпигенетических факторов онкологических заболеваний Автоматизация технологий пробоподготовки и исследований Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании RotorGene с функцией HRM производства QIAGEN могут применяться в клинической лабораторной диагностике. Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании RotorGene с функцией HRM предназначены для качественной оценки мутационного статуса в генах EGFR, KRAS, BRAF из ДНК человека, выделенной из зафиксированных формалином и залитых в парафин образцов опухолевой ткани. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для выявления соматических мутаций в кодоне V600E в гене BRAF методом ПЦР в реальном времени, используя комбинацию двух технологий – аллель специфичную ПЦР с праймерами Scorpions и обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» должен применяться обученным персоналом в специально оборудованной лаборатории с пробами ДНК, извлеченными из фиксированной формалином и залитой парафином опухолевой ткани. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1 Принцип метода Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» использует две технологии для выявления мутаций с помощью ПЦР в реальном времени — аллель специфичную ПЦР (ARMS) и праймеры Scorpions. Аллель специфичная ПЦР (ARMS) Аллель-специфичная или специфичная для данной мутации амплификация достигается с помощью ARMS (Amplification Refractory Mutation System, рефракторная мутационная система амплификации). Taq ДНК-полимераза (Taq) эффективна для различения соответствий и несоответствий на 3'-конце ПЦР-праймера. Специфические 3 последовательности, несущие мутации, селективно амплифицируются даже в пробах, где большинство последовательностей не имеют данной мутации. Когда праймер полностью соответствует, амплификация проходит в полном объеме. В случае несоответствия 3'конца последовательности геномной ДНК, происходит лишь незначительная фоновая амплификация. Праймеры Scorpions Регистрация продуктов амплификации происходит с использованием праймеров Scorpions. Scorpions - это бифункциональные молекулы, содержащие ПЦР-праймер, ковалентно связанный с зондом. Флуорофор в этом зонде взаимодействует со снижающим флуоресценцию гасителем, также встроенным в зонд. В ходе ПЦР, когда зонд связывается с ампликоном, флуорофор и гаситель разделяются, что приводит к повышению флуоресценции в реакционной пробирке. Этапы работы Работа с набором реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» проходит в два этапа. На первом этапе выполняется контрольное измерение для определения суммарной ДНК в пробе. На втором этапе определяется наличие или отсутствие мутантной ДНК. 2.1.1 Формат набора Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» включает: - контрольная (Ctrl) система - мутационных система для анализа мутаций Реакционные смесь содержат внутреннюю контрольную пробу (внутренний контроль), помеченную HEX™. Это контроли наличия ингибиторов, которые могут привести к ложноотрицательным результатам. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» имеют оптимальное разведение. Мы не рекомендуем дальнейшее разбавление реактивов, поскольку это может привести к потере производительности. Мы не рекомендуем ставить реакции, объемом менее 25 мкл, поскольку это может повысить риск ложных отрицательных результатов. Все реактивы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене разработаны специально для данного теста. Все реактивы, поставляемые в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначены для использования только в том же наборе. Для поддержания оптимальной производительности реактивы в наборе не должны замещаться. Используйте только Taq ДНК-полимеразу (Taq), которая поставляется в наборе. Не замещайте ее Taq ДНК-полимеразой (Taq) из других наборов того же или иного типа или Taq ДНК-полимеразой (Taq) от других поставщиков. Контрольная проба 4 Контрольная проба (Ctrl), помеченная FAM™, используется для определения суммарной ДНК в пробе. В контрольной пробе амплифицируется участок экзона 3 гена BRAF. Праймеры и зонд разработаны так, чтобы избежать любых известных полиморфизмов BRAF. Мутационные анализы Мутационная проба, помеченная FAM, содержит один зонд Scorpion плюс праймеры для различения дикой и мутантной ДНК. Мутантная ДНК выявляется ПЦР - анализом в реальном времени. 2.1.2 Определение исходного материала для анализа Со всеми пробами следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом. Материалом для анализа должна быть геномная ДНК человека, выделенная из фиксированных формалином и залитых в парафин проб опухолей. Образцы должны транспортироваться в соответствии со стандартными требованиями работы с патологическим материалом, обеспечивающим качество образцов. Опухолевые образцы негомогенны, срезы из одного образца опухоли могут не соответствовать срезам той же опухоли. Опухолевые пробы могут также содержать неопухолевую ткань. ДНК неопухолевой ткани не должны содержать мутации BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)». 2.1.3 Выделение ДНК Мы рекомендуем использовать набор для выделения ДНК из тканей QIAamp® DNA FFPE (QIAGEN, кат.№ 56404) для очистки геномной ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин образцов опухолей. Выделение ДНК необходимо выполнять согласно инструкции к набору реагентов QIAamp DNA FFPE: Поместите срезы, фиксированные формалином и залитые в парафин, на покровные стекла Соскребите избыток парафина вокруг срезов ткани, используя стерильный скальпель. Соскребите срезы тканей в микроцентрифужные пробирки, используя свежий скальпель для каждой предназначенной для выделения пробы. Расщепление протеиназой К должно проводиться в течение 1 часа. Очищенную геномную ДНК растворяют в 200 мкл буфера ATE (поставляемого в наборе для тканей QIAamp DNA FFPE). Храните очищенную геномную ДНК при 15–25°C. 2.1.4 Внутренние контроли. Определение ДНК должно основываться на ПЦР и может отличаться от количественного определения, основанного на значениях поглощения. Смесь для дополнительной контрольной реакции (Ctrl) поставляется для определения качества и количества ДНК в пробах перед анализом с использованием набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)». 5 Все пробы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» генерируют короткие продукты ПЦР. Тем не менее, набор для ПЦР не будет работать с тяжелыми фрагментами ДНК. Пробы в дополнение к интересующей реакции содержат внутренний контроль (см. «Анализ данных»). Если оба анализа оказались неудачными, данные следует автоматически отбросить, поскольку присутствовавшие ингибиторы могли привести к ложным отрицательным результатам. Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, однако следует отметить, что это также разбавит ДНК. Все экспериментальные анализы должны содержать контроли. 2.1.5 Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе. Мы настоятельно рекомендуем применение дополнительной контрольной реакционной смеси (Ctrl), поставляемой с набором набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» для определения суммарной ДНК в пробе. В контрольном анализе амплифицируется участок экзона 3 гена BRAF. Мы рекомендуем постановку проб только с контрольной пробой, используя положительный контроль BRAF (ПК) в качестве положительного контроля и воду, свободную от нуклеаз в качестве отрицательного контроля (ОК). Для оптимального использования реактивов в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» пробы следует обрабатывать партиями. Если пробы тестируются индивидуально, это требует большего количества реактивов и снижает количество проб, которые можно протестировать данным набором. 2.1.6 Анализ данных Анализы в реальном времени с использованием праймеров Scorpions используют число циклов ПЦР, необходимое для выявления флуоресцентного сигнала выше фонового в качестве меры молекул-мишеней, присутствующих в начале реакции. Точка, в которой сигнал получается выше фоновой флуоресценции, называется пороговым циклом (C T). Значения ∆CT пробы вычисляются как разница между определением мутации CT и контрольным измерением CT от той же пробы. Пробы классифицируются как положительные (наличие мутации), если они дают ∆CT меньше, чем пороговое значение ∆CT для этого анализа. Выше этого значения проба либо может содержать процент мутантной ДНК ниже необходимого для обнаружения с помощью набора (за аналитическим пределом), либо проба отрицательна по мутациям. Значения CT мутационных, равные 40 или выше будут считаться отрицательными или находящимися за пределами чувствительности набора. При использовании праймеров ARMS может происходить некоторое неэффективное праймирование, давая очень запоздалый фоновый CT от ДНК, не содержащей мутации. Все значения ∆CT, рассчитанные от фоновой амплификации, будут выше пороговых 6 значений ∆CT, и проба будет классифицироваться как отрицательная по мутациям. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для использования на приборе для амплификации в реальном времени QIAGEN Rotor-Gene Q 72-луночного формата. 2.1.7 Контроль качества Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах удобны и просты в использовании. Благодаря профессионализму разработчиков, входящие в наборы реагенты имеют гарантированное высокое качество. В соответствии с сертифицированной по ISO Системой контроля качества QIAGEN, каждая партия наборов реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» тестируется в соответствии с утвержденными техническими условиями для обеспечения постоянного качества продукта. 2.2 Состав набора Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией HRM Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» Название Состав Физические свойства Жидкость дезоксирибонуклеиновая кислота в водном растворе 250 мМ Трисхлорида pH 8.7, 10 мМ сульфата аммония, 375 мМ хлорида калия, 1,5 мМ хлорида магния, дезоксирибонуклеотид трифосфаты, стерильная вода Олигонуклеотиды для Жидкость Реакционная смесь V600E позиции в геномной V600E Reaction Mix ДНК (дезоксирибонуклеинова (фиолетовая) V600E Reaction я кислота, в водном Mix (Purple) растворе 250 мМ Трисхлорида pH 8.7, 10 мМ сульфата аммония, 375 мМ хлорида калия, 1,5 мМ хлорида магния, дезоксирибонуклеотид трифосфаты, стерильная Контрольная реакционная смесь (красная крышка) Control Reaction Mix (Red) Категория опасности Отсутствует Объе м 1200 мкл Кол -во 2 шт Отсутствует 630 мкл 1 шт. 7 вода) Позитивный контроль (бежевая) Positive Control (Beige ) ДНК полимераза Taq DNA (Mint) Taq DNA polymerase (Mint) Руководство пользователя на английском языке Handbook дезоксирибонуклеиновая кислота водный фермента полимеразы Жидкость Отсутствует 320 мкл 1 шт. раствор Жидкость ДНК Отсутствует 75 мкл 1 шт Отсутствует - 1 шт Бумага 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Общие сведения Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» представляет собой готовый к применению набор для выявления мутаций в онкогене BRAF (кодон V600E) методом ПЦР в реальном времени на приборе Rotor-Gene Q. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» позволяет выявлять следующие мутации в сравнении с контрольной геномной ДНК дикого типа: V600E common (GAG)* V600E complex (GAA) and V600D (GAT) ** V600K (AAG) *** Используемые методы обладают высокой избирательностью и в зависимости от общего количества ДНК в образце, позволяют выявлять невысокий процент мутантной ДНК на фоне геномной ДНК дикого типа. Чувствительность и селективность набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» намного выше по сравнению с такими технологиями как секвенирование. * чувствительность – достигает 1,27% ** определяет мутации, но не различает их между собой *** обнаружение данной мутации зависит от достаточного копий V600K. 300 копий V600K наблюдается, когда значение порогового цикла достигает CT 34.7 8 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Пользователь должен всегда обращать внимание на следующее: Пользуйтесь стерильными наконечниками с фильтрами для дозаторов и следите за тем, чтобы дозаторы были откалиброваны в соответствии с инструкциями производителя. Храните образцы, положительные контроли и экстрагированную ДНК из образцов отдельно от других реактивов. Добавляйте их в реакционную смесь также на отдельном рабочем участке. Перед началом анализа тщательно размораживайте все компоненты при комнатной температуре (15–25°C). После размораживания перемешайте компоненты (переворачивая каждую пробирку по 10 раз) и кратковременно центрифугируйте. Проявляйте крайнюю осторожность, чтобы избежать загрязнения ПЦР синтетическим контрольным материалом. Мы рекомендуем использовать отдельные специально для этого предназначенные дозаторы для приготовления реакционных смесей и добавления матричной ДНК. Приготовление и раскапывание реакционных смесей должно производиться в отдельном помещении в ламинаре, где не производится раскапывание образцов. Пробирки Rotor-Gene Q не должны открываться по окончании ПЦР-анализа. Информация по технике безопасности Работая с реактивами, всегда надевайте подходящий лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки. Весь химический и биологический материал должен считаться потенциально опасным. Пробы являются потенциальным источником инфекции, и с ними следует обращаться соответствующим образом. Утилизируйте отходы проб и анализов в соответствии установленным правилам. 5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ Оборудование и реактивы, приобретаемые отдельно При работе с реактивами всегда надевайте лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки. За дополнительными сведениями обращайтесь к соответствующим паспортам безопасности (MSDS), имеющимся у поставщика продукта. Набор реагентов для выделения ДНК (см. «Выделение ДНК») Специальные регулируемые дозаторы для приготовления мастер-микса для ПЦР Специальные регулируемые дозаторы для добавления геномной ДНК* Стерильные наконечники с фильтрами для пипеток 9 Настольная центрифуга* с ротором для 2-мл реакционных пробирок Прибор Rotor-Gene Q 5plex HRM* или Rotor-Gene Q серии 6* с каналами флуоресценции для Cycling Green and Cycling Yellow Программное обеспечение для Rotor-Gene Q версия 2.0.2 Стрипованные пробирки и колпачки, 0,1 мл, для использования с 72-гнездным ротором (№ по каталогу 981103 или 981106) Стерильные микроцентрифужные пробирки для приготовления мастер - миксов. 6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ ДНК, выделенная с использованием набора реагентов для выделения ДНК QIAGEN (Кат.№ 56404) из парафинизированных блоков опухолевой ткани, предварительно зафиксированной в забуференном формалине. 7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА Протокол 1: Оценка проб Определение суммарной ДНК в пробах Перед началом работы прочитайте «Важные замечания. Перед тем, как начать работу по протоколу ознакомьтесь с инструкцией к прибору RotorGene Q. Действия перед началом работы Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены, перемешаны (переворачиванием пробирки, 10 раз) и кратковременно центрифугированы. Перед каждым применением убедитесь, что Taq ДНК-полимераза находится при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугируйте пробирку для локализации фермента на дне пробирки. Ход работы 1. Разморозьте контрольную реакционную смесь (Ctrl) и положительный контроль (ПК) BRAF при комнатной температуре (15–25°C) в течении 60 минут. Когда контрольная реакционная смесь (Ctrl) и положительный контроль (ПК) BRAF растают, перемешайте их, переворачивая каждую пробирку 10 раз во избежание локализованного скопления солей. 2. Приготовьте достаточное количество мастер-миксов (контрольная реакционная смесь (Ctrl) плюсTaq ДНК-полимераза (Taq)) для проб ДНК, одну реакцию положительного контроля и одну реакцию отрицательного контроля (ОК) в соответствии с объемами, * Все приборы должны быть поверены и откалиброваны в соответствии с рекомендациями производителя. 10 приведенными в Таблице 7.1. Добавьте в расчет реактивы для 1 дополнительной пробы. Мастер-микс содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за исключением образца. Не встряхивайте Taq ДНК-полимеразу (Taq) на вортексе, так как это может инактивировать фермент. Убедитесь, что Taq ДНК-полимераза перед использованием находится при комнатной температуре. Кратковременно центрифугируйте флакон, чтобы быть уверенным, что весь фермент находится у дна пробирки. Пипеткой отберите ДНК-полимеразу (Taq), размещая наконечник пипетки прямо под поверхностью жидкости во избежание обволакивания наконечника избытком фермента. Таблица 7.1. Приготовление контрольного мастер-микса Мастер микс Анализ Контрольный анализ Контрольная реакционная Taq смесь (Ctrl)* (Taq)* 19.8 мкл 0.2 мкл ДНК-полимераза * При приготовлении мастер-микса готовьте так, чтобы хватило еще на 1 пробу. 3. Перемешайте мастер-микс, аккуратно втягивая и выпуская пипеткой. Сразу же добавьте 20 мкл мастер-микса в каждую пробирку Rotor-Gene. 4. В пробирки немедленно добавьте по 5 мкл образца, BRAF -положительного контроля (ПК) и воды, свободной от нуклеаз (H2O) (для ОК). 5. Закройте пробирки для ПЦР и разместите их в соответствующих положениях в диск Rotor-Disc™. Если ротор загружен неравномерно, уравновесьте его дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q. После переноса пробирок в ротор мы рекомендуем визуально проверить, все ли пробирки содержат одинаковый объем. 6. Сразу же поместите Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q. Проследите, чтобы запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для предотвращения случайного открывания пробирок при анализе. 7. Для оценки проб создайте температурный профиль в соответствии со следующими этапами. Установка общих параметров анализа Рис. 7.1, 7.2, 7.3 Первоначальная активация фермента горячего Рис. 7.4, 7.5 старта Амплификация ДНК Рис. 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 Подгонка флуоресцентных каналов Рис. 7.8 Запуск анализа Рис. 7.10 11 Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2. Пожалуйста, найдите дальнейшие сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q в руководстве по применению прибора. На иллюстрациях эти установки обведены толстыми черными рамками. Иллюстрации показаны для приборов Rotor-Gene Q. 8. Дважды щелкните значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2. На рабочем столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q, выберете вкладку “Advanced” (Усложненный) в появившемся диалоговом окне “New Run” (Новый анализ). 9. Для создания нового шаблона выберите “Empty Run” (Холостой запуск), а затем нажмите “New” (Новый), чтобы ввести “New Run Wizard” (Мастер нового запуска). 10. Выберите 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметьте, что запирающее кольцо присоединено. Поставьте галочку в квадрате “Locking Ring Attached” (Запирающее кольцо присоединено) и нажмите “Next” (Далее) (Рис. 7.1). Рис. 7.1. Диалоговое окно «Мастер нового запуска. 11. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции и добавьте любые дополнительные примечания. Щелкните “Next” (Рис. 7.2). 12 Рис. 7.2. Установка общих параметров анализа. 12. Щелкните кнопку “Edit Profile” (Редактировать профиль) в следующем диалоговом окне “New Run Wizard” (Рис. 7.3) и запрограммируйте температурный профиль в соответствии с информацией на следующих этапах. Рис. 7.3. Редактирование профиля 13 13. Щелкните кнопку “Insert after” («Ввести после») и выберите “New Hold at Temperature” («Новая выдержка при температуре») (Рис. 7.4). Щелкните “60”, чтобы изменить температуру на 95°C. Рис. 7.4. Первоначальный этап инкубации при 95°C. 14. Щелкните “60°C” И замените “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C, щелкните “1” для замены “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкните кнопку “Insert After” («Ввести после»), а затем выберите “New Cycling” («Новая амплификация») (Рис. 7.5). Рис. 7.5. Начальный этап инкубации при 95°C. 15. Установите число циклов на 40, нажав число. Выберите “95°C на 20 секунд”. Установите время “20 secs” («20 с») (Рис. 7.6). 14 Рис. 7.6. Этап амплификации при 95°C. 16. Поместите засветку на “60°C for 20 secs”. Установите время до 60 секунд и температуру до 55°C. Выберите кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 7.7). Рис. 7.7. Этап амплификации при 55°C. 15 17. В панели “Available Channels” («Доступные каналы») выберите “Yellow” («Желтый») и “Green” («Зеленый») каналы для запроса, подсвечивая их, а затем нажмите “>”, чтобы перенести их в панель “Acquiring Channels” («Запрашиваемые каналы») (Рис. 7.8). Рис. 7.8. Запрос на этапе амплификации при 55°C. 18. Поставьте подсветку на “72°C for 20 secs” и удалите этот раздел, затем нажмите “OK” (Рис. 7.9). Рис. 7.9. Этап устранения расширения. 16 19. Щелкните “Next” для сохранения шаблона, выберите “Save Template” («Сохранить шаблон»), а затем сохраните шаблон в папку шаблонов. 20. Проверьте программирование и затем щелкните “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения файла анализа и его запуска (Рис. 7.10). Рис. 10. Запуск анализа. 21. После запуска анализа появляется новое окно, в котором вы теперь можете либо ввести названия проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести их позже. 22. Сохраните все данные в соответствующей папке. См. п.8. Анализ данных. 23. По окончании анализа проанализируйте данные. 24. Определите значения CT отрицательного контроля (ОК), чтобы убедиться в отсутствии загрязнения, дающего положительную амплификацию, в канале FAM (CT <40) или неудачного внутреннего контроля в канале HEX (значения CT <33 и> 37), указывающего на проблему с постановкой. Положительный контроль BRAF (ПК) давать контрольные значения CT (канал FAM) между 24.13–30.13. Данные анализа проб не должны учитываться, если хотя бы один из 2 контролей оказался неудачным. Значение контроля проб CT между CT 24.25–30.00: Это - приемлемый диапазон, присутствует достаточное количество ДНК для оптимальной работы набора реагентов. Значение контроля проб CT между >30.00–35.00: интерпретируйте с осторожностью, так как очень низкий уровень мутаций может не обнаруживаться. 17 Значение контроля проб CT между >35.00–45.00: В таких пробах присутствует лишь несколько пригодных к амплификации копий ДНК, и мутации можно увидеть только если большинство копий мутировало. Примечания: Если проба дает позднее значение CT для контроля, внутренний контроль пробы CT должен сравниваться с отрицательным контролем. Если внутренний контроль пробы замедленный или отрицательный по сравнению с ОК, может происходит ингибирование реакции. Разведение пробы может снизить действие ингибитора, однако это также разбавит ДНК. Разведение пробы: Контроль CT <24,25 перегрузит анализы мутаций. Пробы с контролем CT <24,25 должны разбавляться. Чтобы увидеть каждую мутацию на низком уровне, концентрированные пробы должны разбавляться так, чтобы были в пределах >24,25 и <30.00, основываясь на том, что разбавление вдвое увеличит CT на 1. Протокол 2: Выявление мутаций в гене BRAF и анализ данных Выявление мутаций BRAF и анализ данных Перед началом работы прочитайте «Важные замечания». Перед тем, как начать работу по протоколу ознакомьтесь с инструкцией к прибору RotorGene Q. Для эффективного использования набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)», образцы должны быть сгруппированы в партии 24. Меньший размер партии 12 также допустим, но постановка менее 12 реакций можно будет протестировать данным набором меньшее число проб. Для каждой пробы ДНК в одном и том же ПЦР-анализе должны ставиться контроль и проба на мутации во избежание вариаций от анализа к анализу. Действия перед началом работы: Перед каждым применением все реактивы должны быть полностью разморожены, перемешаны (переворачивая 10 раз) и кратковременно центрифугированы. Перед каждым применением убедитесь, что Taq ДНК-полимераза находится при комнатной температуре (15–25°C). Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы собрать фермент на дне. Ход работы 1. Разморозьте реакционные смеси и положительный контроль BRAF при комнатной температуре (15–25°C). Когда реакционные смеси и положительный контроль BRAF растают, перемешайте их, переворачивая каждую пробирку по 10 раз во избежание локального концентрирования солей. 2. Выполните предварительный запуск Rotor-Gene Q. 18 Примечания: Можно не проводить данную процедуру, если прошло не более 90 минут после использования прибора. Предварительный запуск занимает приблизительно 42 минуты, см. п.8.5: Выполнение предварительного запуска”. 3. Приготовьте достаточное количество мастер-миксов (контрольная реакционная смесь (Ctrl) плюсTaq ДНК-полимераза (Taq)) для проб ДНК, одна реакция положительного контроля и одна реакция отрицательного контроля без матрицы в соответствии с объемами, приведенными в Таблице 7.2. Включите реактивы для 1 дополнительной пробы. Мастер-микс содержит все компоненты, необходимые для ПЦР за исключением пробы. Таблица 7.2. Приготовление контрольного мастер-микса Мастер микс Анализ Контрольная реакционная Taq ДНК-полимераза смесь (Ctrl)* (Taq)* 19.8 мкл 0.2 мкл Анализ мутаций V600E 19.6 мкл 0.4 мкл Контрольный анализ * При приготовлении мастер-микса готовьте так, чтобы хватило еще на 1 пробу. 4. Перемешайте аккуратно мастер-микс пипетированием. Сразу же добавьте по 20 мкл мастер-микса в каждую пробирку Rotor-Gene Q. 5. Немедленно добавьте по 5 мкл пробы, EGFR-положительного контроля и воды, свободной от нуклеаз для отрицательного контроля в каждую пробирку Rotor-Gene Q. Каждая проба ДНК должна сравниваться как с контролем, так и со всеми мутационными анализами. Расположение показано в Таблице 7.3. Таблица 7.3. Расположение контрольных (Ctrl) и мутационных анализов Ctrl V600E Ctrl V600E Ctrl V600E Контроли ПК ОК 1 9 2 10 3* 11* 4* 12* 5* 13* 6* 14* Пробы 1 17 18 19 20 21 22 2 25 26 27 28 29 30 3 33 34 35 36 37 38 4 41 42 43 44 45 46 5 49 50 51 52 52 54 6 57 58 59 60 61 61 7 65 66 67 68 69 70 Ctrl V600E 7* 8* 23 24 31 32 39 40 47 48 55 56 63 64 71 72 15* 16* * Бланк 6. Закройте пробирки Rotor-Gene Q и разместите их в соответствующих положениях в роторном диске. Если ротор загружен неравномерно, уравновесьте его дополнительными пустыми пробирками Rotor-Gene Q. 19 7. Сразу же поместите Rotor-Disc в прибор Rotor-Gene Q. Проследите, чтобы запирающее кольцо прибора Rotor-Gene Q размещалось на верхней части ротора для предотвращения случайного открывания пробирок при анализе. 8. Для оценки проб создайте температурный профиль в соответствии со следующими этапами. Установка общих параметров анализа Рис. 7.11 – 7.13 Первоначальная активация фермента горячего Рис. 7.14, 7.15 старта Амплификация ДНК Рис. 7.16, 7.17 Подгонка флуоресцентных каналов Рис. 7.18, 7.19 Запуск анализа Рис. 7.20 Все спецификации относятся к программному обеспечению Rotor-Gene Q версии 2.0.2. Пожалуйста, найдите дальнейшие сведения по программированию приборов Rotor-Gene Q в руководстве по применению прибора. На иллюстрациях эти установки обведены толстыми черными рамками. Иллюстрации показаны для приборов Rotor-Gene Q. 8. Дважды щелкните значок программы Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2 на рабочем столе компьютера, присоединенного к прибору Rotor-Gene Q. Выберите вкладку “Advanced” («Усложненный») в появившемся диалоговом окне “New Run” («Новый запуск»). 9. Для создания нового шаблона выберите “Empty Run” («Холостой запуск»), а затем нажмите “New” («Новый»), чтобы ввести “New Run Wizard” («Мастер нового запуска»). 11. Выберите 72-Well Rotor (72-гнездный ротор) в качестве типа ротора. Отметьте, что запирающее кольцо присоединено. Поставьте галочку в квадрате “Locking Ring Attached” («Запирающее кольцо присоединено») и нажмите “Next” («Далее») (Рис. 7.11). Рис. 7.11. Диалоговое окно «Мастер нового запуска». 20 12. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции и добавьте любые дополнительные примечания. Щелкните “Next (Рис. 7.12). Рис. 7.12. Установка общих параметров анализа. 13. Щелкните кнопку “Edit Profile” («Редактировать профиль») в следующем диалоговом окне “New Run Wizard” (Рис. 7.13) и запрограммируйте температурный профиль в соответствии с информацией на следующих этапах. 21 Рис. 7.13. Редактирование профиля. 14. Щелкните кнопку “Insert after” («Ввести после») и выберите “New Hold at Temperature” («Новая выдержка при температуре») (Рис. 7.14). Щелкните “60”, чтобы изменить температуру на 95°C. Рис. 7.14. Начальный этап инкубации при 95°C. 14. Щелкните “60°C” И замените “Hold Temperature” («Температура выдержки») на 95°C, щелкните “1” для замены “Hold Time” («Время выдержки») на 15 мин. Щелкните кнопку “Insert After” («Вести после»), а затем выберите “New Cycling” («Новая амплификация») (Рис. 7.15). Рис. 7.15. Начальная инкубация при 95°C. 22 16. Установите число циклов на 40, нажав число. Выберите “95°C на 20 секунд”. Установите время на 30 секунд (Рис. 7.16). Рис. 7.16. Этап амплификации при 95°C. 17. Поместите подсветку на “60°C” на 20 секунд. Установите температуру 55°C и время 60 секунд. Выберите кнопку “Not Acquiring” («Не запрашивать») (Рис. 7.17). Рис. 7.17. Этап амплификации при 55°C. 23 18. В панели “Available Channels” (Доступные каналы) выберите “Yellow” (Желтый) и “Green” («Зеленый») - каналы для запроса, подсвечивая их, а затем нажмите “>”, чтобы перенести их в панель “Acquiring Channels” (Запрашиваемые каналы) (Рис. 7.18). Кликните «ОК» Рис. 7.18. Запрос на этапе 60°C. 19. Поставьте подсветку на “72°C for 20 secs” и удалите этот раздел, затем нажмите “OK” (Рис. 7.19). Рис. 7.19. Этап удаления расширения. 24 20. Щелкните кнопку “Gain Optimisation” («Оптимизация результатов») (Рис. 7.20). Рис. 7.20. Оптимизация результатов. 20. Щелкните “Next” для сохранения шаблона, выберите “Save Template” («Сохранить шаблон»), а затем сохраните шаблон в папку шаблонов. 21. Проверьте сводку и затем щелкните “Start Run” («Запустить анализ») для сохранения файла анализа и его запуска (Рис. 7.21). Рис. 7.21. Запуск анализа. 25 22. После запуска анализа появляется новое окно, в котором можно либо ввести название проб, либо щелкнуть “Finish” («Закончить») и ввести их позже. 23. Сохраните все данные в соответствующей папке. 24. По окончании анализа проанализируйте данные. Информацию об анализе данных см. п.8. 8. РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ Анализ данных на приборе Rotor-Gene Q Следует проверять графики на Rotor-Gene Q во всех реакциях. Изредка наблюдается усиление флуоресцентного сигнала отрицательного контроля без матрицы (ОК) и в отрицательных пробах. При встрече с подобной ситуацией и при наличии значения C T пользователю нужно отличить истинный случай усиления сигнала, который указывает на загрязнение отрицательного (ОК) от истинной амплификации и от линейного роста флуоресценции, который может возникнуть из-за флуоресцирующего артефакта. 8.1 Анализ отрицательного контроля (без матрицы) Рис. 8.1 и 8.2 показывают два примера поведения отрицательных контролей (ОК) с инструкциями, как следует обращаться с данными графиков этих типов. На Рис. 8.1 видна нелинейная, т.е. истинная амплификация, возникшая из-за загрязнения: этот анализ следует отбросить, а пробы протестировать повторно. На Рис. 8.2 видна линейная амплификация отрицательного контроля. При данных обстоятельствах должна проверяться исходная флуоресценция: соответствующий график исходной флуоресценции показан на Рис. 8.3, демонстрируя линейный рост флуоресценции, а не истинное событие амплификации. Данные анализа могут быть использованы при условии, что прошли положительный и внутренний контроли. По сравнению с рис. 8.3, рис. 8.4 показывает исходные данные флуоресценции, где присутствует истинная амплификация. При этих обстоятельствах нужно отказаться от данных, образцы должны быть повторно проверены, поскольку это указывает на наличие контаминации. 26 Рис. 8.1. Загрязнение ОК в анализируемом анализе Рис. 8.2. Пример линейного роста флуоресценции в пробирке с ОК. 27 Рис. 8.3. Исходная флуоресценция. Рис. 8.4. Исходные данные флуоресценции, показывающие, что в пробирке с ОК амплификация происходит правильно. 8.2 Анализ проб и положительного контроля Рис. 8.5 и 8.6 показаны два примера амплификации в реакциях с пробами, с инструкциями, указывающими на то, как следует обращаться с данными этих типов графиков. На Рис. 8.5 представлен анализ с правильной амплификация в пробирке с пробой. Если анализ показывает такой тип сигмоидальной амплификационной кривой, то это истинная амплификация, и данные этого анализа могут быть использованы при 28 условии, что прошли положительный и внутренний контроли. Рис. 8.6 показывает линейную амплификацию в реакции с пробой. При этих условиях должны проверяться исходные данные флуоресценции: соответствующий график исходной флуоресценции показан на Рис. 8.7, указывая, что линейный рост на Рис. 8.5 соответствует линейному росту исходной флуоресценции. При условии, что прошли положительный и внутренний контроли, могут быть получены результаты проб для этих анализов. Рис. 8.5. Истинная амплификация в гнезде с пробой в анализируемой группе. Рис. 8.6. Пример линейного роста флуоресценции в двух гнездах с пробами. 29 Рис. 8.7. Исходная флуоресценция. 8.3 Анализ проб на приборе Rotor-Gene Q с использованием программного обеспечения Rotor-Gene серии 2.0.2 1. Используя программное обеспечение Rotor-Gene Q series (2.0.2), откройте соответствующий файл. 2. Пометьте пробы. 5. Находясь на странице исходного канала для каждого детектора/канала, щелкните “Options” («Возможности») и введите “Crop start cycles” («Урезать стартовые циклы»). На странице с “Remove data before cycle” («Удалить данные перед циклом») введите 15 и щелкните “OK”. 4. Щелкните “Analyse” («Анализировать»). На странице анализа щелкните “Cycling A (from 15), Yellow” (Амплификация А (с 15), Желтый»), чтобы проверить канал HEX. 5. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните “Slope correct” («Выправление наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»). 6. Установите порог 0.05 и отметьте значения CT. 7. На странице анализа щелкните “Cycling A (from 15), Green” («Амплификация А (с 15), Зеленый»), чтобы проверить канал FAM. 8. Динамическая пробирка должна быть подсвечена. Щелкните “Slope correct” («Выправление наклона») и “Linear scale” («Линейное масштабирование»). 9. Установите порог 0.05 и отметьте значения CT. 30 Анализ проб: ОК и внутренний контроль 1. Определите значения CT для ОК, чтобы удостовериться в отсутствии контаминации, дающей положительную амплификацию в сигнале FAM (CT меньше 45). См. п. 8.3 Анализ данных на Rotor-Gene Q. В пробирках с ОК сигнал HEX анализа внутреннего контроля должен давать положительный результат во всех 8 образцах (CT ≤35.00). Если в канале FAM есть положительная амплификация, а в сигнале HEX амплификация >35.00, результат должны быть исключены. 2. То же для всех других образцов; проверьте, чтобы каждая проба давала сигнал HEX от внутреннего контроля. Возможны 3 варианта: 2a. Если исследование внутреннего контроля дает положительный результат, (CT между 31–35), продолжите с анализ. 2b. Если внутренний контроль оказался неудачным(CT >35.00), но реакция FAM идет хорошо, продолжайте анализ, так как реакция FAM вытеснила реакцию внутреннего контроля. Это верно для реакций с положительным контролем FFPE-образцов. 2c. Если реакции в канале FAM и внутренний контроль не прошли, данные должны быть отброшены, поскольку в реакционной смеси могли присутствовать ингибиторы, приведшие к ложным отрицательным результатам. Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, но следует отметить, что ДНК также окажется разбавленной. 3. Значения CT контроля должны быть> 24.25 во избежание перегрузки анализа. Если значения CT контроля > 30.00–35.00, данные должны интерпретироваться с осторожностью. Если значения CT контроля > 35.00–40.00, то имеется только несколько копий амплификации. Анализ пробы: положительный контроль 1. В положительном контроле (BRAF) значения CT канала FAM должны лежать в интервале 24.13–30.13 2. Вычислите значение ΔCT следующим образом, удостоверившись в том, что значения CT как мутации, так и контроля от одной и той же пробы: [мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT 1. Значения ΔCT положительного контроля BRAF (ПК) должны попадать в интервалы значений, приведенные в Таблице 4. Таблица 4. Ожидаемые программой Rotor-Gene Q (2.0.2) значения положительного контроля (ПК) ΔCT Анализ Значение положительного контроля (ПК) ΔCT 2.5 - 6.5 V600E 31 Анализ проб: образцы пациентов 1. Вычислите значение ΔCT убедившись, что мутационное и контрольное значение CT от одной и той же пробы. [мутационный CT] – [контрольный CT] = ΔCT 2. В спорном случае сравните значение ΔCT для пробы с точкой отсечения для анализа (Таб. 5), удостоверившись, что для каждого анализа применена правильная точка отсечения. Точка отсечения это расположенная выше точка, в которой положительный сигнал мог быть благодаря фоновому сигналу праймера ARMS для ДНК дикого типа. Если значение ΔCT пробы выше точки отсечения, оно классифицируется как отрицательное или за пределами чувствительности набора. Если значение ΔCT выше точки отсечения, это классифицируется как отсутствие мутации в образце или недостаточной чувствительностью набора. Если значение ΔCT ниже точки отсечения, это классифицируется как наличие мутации в образце. Таблица 5. Усеченные значения программы Rotor-Gene Q (2.0.2) Анализ Значение ΔCT точки отсечения V600E 10 8.4 Дополнительная информация о мутациях Номера COSMIC взяты из Каталога соматических мутаций при раке (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Таблица 6. Перечень мутаций и номера по COSMIC Анализ V600E V600E (комплекс ) V600D V600К Экзон 15 15 15 15 Замена основания 1799Т>А 1799 1800TG>AA (комплекс) 1799 1800GT>AN (комплекс) 1798 11799GT>AA (комплекс) Номер COSMIC 476 475 477 473 8.5 Предварительный запуск 1. Добавить по 25 мкл воды без нуклеаз в пробирки. 32 2. Поместите пробирки в 72 – луночной ротор прибораRotor-Gene Q . Удостоверитьсято, что пробирки зафиксированы кольцом для предотвращения случайного открытия пробирок во время термоциклирования. 3. Для создания файла «Предварительного запуска» задайте температурный профиль. 4. Щелкните “New”, затем щелкните два раза на папке маркированной “Empty run” (Холостой пробег) (Рисунок 28). Рис. 28. Диалоговое ркно «Новый запуск» (New Run). 5. Выбирите 72-луночный ротор, удостоверьтесь, что фиксирующее кольцо на месте и нажмите “Next”. Рис. 29. Диалоговое окно «Мастер нового запуска». 33 6. Вставьте имя оператора, введите 25 мкл в качестве объема реакции и добавьте любые дополнительные примечания. Щелкните “Next (Рис. 30). Рис. 30. Установление параметров для предварительного запуска. 7. Выберите «Редактировать профиль» (Edit profile) (Рис.31) Рис. 31. Установка параметров анализа. 34 8. Щелкните «Insert after» (Рис.32). Рис. 32. Вставить шаг цикла. 9. Щелкните «Установка новой температуры» (New hold at temperature) (Рис.33) Рис. 33. Изменение температурного режима 10. Установка температуры на 95 °C и времени 10 минут.. Рис. 34. Начальный шаг инкубации в 95°C 35 11. Щелкните «Вставить после» (Insert after), затем «Новый цикл» (New cycling) Рис. 35. Начальный шаг инкубации в 95°C 12. На шаге 95°C выставить время 1 сек. (Рис. 36). Рис. 36. Шаг цикла 95°C 36 13. На шаге 60°C выставить время 1 сек. (Рис. 37). Рис. 37. Шаг цикла 60°C 14. Щелкните на шаге 72°C (Рис.38) Рис. 38. Выбрать дополнительный шаг цикла 72°C 37 15. Щелкните на минус (“-“) в верхней правой стороне экрана, установите 72°C, затем нажмите «ОК» (Рис. 39). Количество циклов – 45. Рис. 39. Удалить дополнительный шаг цикла 72°C 16. Щелкните «Next» (Рис.40). Рис. 40.Пропустиь установку канала и начать оптимизацию 38 17. Щелкните «Save template» и введите подходящее имя (Рис.41). Рис. 41. Сохраните шаблон 18. Сохранить файл для дальнейшего использования (рисунок 42). Для того, чтобы открыть подходящий файл, щелкните два раза на выбранный файл. Рис. 42. Выбрать «warm-up run» (предварительный запуск). 39 19. Щелкните “Next” (Следующий), затем «New Run Wizard» (Мастер нового запуска) и щелкните «Start Run» (Начните запуск) для запускаанализа (Рис. 43). Рис. 43. Начать предварительный запуск. 9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА Хранение Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» доставляется в сухом льду и по прибытию должен также оставаться замороженным. Если по прибытии набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» не заморожен, при транспортировке вскрывалась внешняя упаковка, посылка не содержит упаковочного листа, руководства или реактивов, пожалуйста, свяжитесь с одним из отделений Технической службы QIAGEN или местных дистрибьюторов. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» хранят при температуре от –15°C до –25°. Для обеспечения оптимальной активности и производительности праймеров Scorpions® набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» должен быть защищен от света во избежание дезактивации флуоресцентной метки. При хранении в рекомендуемых для этого условиях и в исходной упаковке набор стабилен до даты окончания срока хранения, указанной на этикетке. Следует избегать повторного оттаивания-замораживания. Мы рекомендуем максимум 7 циклов замораживания-оттаивания. 40 Ограничение использования Полученные результаты должны интерпретироваться в контексте всех соответствующих клинических и лабораторных исследований и не должны применяться для диагностики отдельно. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» должен использоваться только персоналом, специально проинструктированным и обученным диагностике in vitro и работе на Rotor-Gene Q. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» валидирован для ДНК, выделенной из парафинизированных блоков, предварительно фиксированного в забуференном формалине образцов опухолевой ткани с использованием набора реагентов для выделения ДНК QIAGEN (Кат.№ 56404). Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для применения только в амплификаторе для проведения ПЦР в реальном времени Rotor-Gene Q серии 5plex HRM. Для получения оптимальных результатов необходимо строгое соответствие руководству по применению набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)». Реактивы должны готовиться согласно рекомендациям данной Инструкции. В противном случае, возможно, получить некорректные результаты. Важно, чтобы количество и качество ДНК в пробе определялось непосредственно перед проведением анализа данной пробы с использованием набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)». Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» имеет дополнительную контрольную смесь (Ctrl) для определения значения порогового цикла (CT), приемлемого для анализа. Следует обращать внимание на даты окончания срока годности и условия хранения, напечатанные на коробке и этикетках всех компонентов. Не используйте компоненты с истекшим сроком годности или неправильно хранившиеся. Руководство по устранению неисправностей Руководство по устранению неполадок может помочь в решении проблем, которые могут возникнуть. Подробнее см. также страницу «Часто задаваемые вопросы» в Центре технической поддержки: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Комментарии и советы Нет сигнала с положительным контролем KRAS (ПК) на флуоресцентном канале Cycling Green a) Выбранный флуоресцентный Для анализа данных выберите канал флуоресценции канал для анализа данных ПЦР не Cycling Green для аналитической ПЦР EGFR и 41 соответствует данному протоколу флуоресцентный канал Cycling Yellow для ПЦР внутреннего контроля. Сравните температурный профиль с протоколом. b) Неправильное программирование температурного профиля прибора Rotor-Gene c) Неверная конфигурация ПЦР Проверьте свою работу пошагово с помощью схемы расположения образцов и при необходимости повторите ПЦР. d) Условия хранения для одного Проверьте условия хранения и дату окончания или нескольких компонентов срока хранения (см. этикетку набора) реактивов и набора не соответствует при необходимости используйте новый набор. инструкциям, данным в разделе «Доставка и хранение» e) Срок хранения набора истек Проверьте условия хранения и дату окончания срока хранения (см. этикетку набора) реактивов и при необходимости используйте новый набор. Комментарии и советы Сигналы отрицательных контролей в канале флуоресценции Cycling Green для аналитической ПЦР a) В ходе подготовки ПЦР произошло Повторите ПЦР с новыми реактивами в загрязнение нескольких повторах. По возможности закрывайте пробирки для ПЦР сразу после добавления пробы, предназначенной для тестирования. Регулярно проводите санитарную обработку рабочего пространства и инструментов. b) При экстракции произошло загрязнение Повторите экстракцию и ПЦР пробы, предназначенной для тестирования, с использованием новых реактивов. Регулярно проводите санитарную обработку рабочего пространства и инструментов.. Техническая поддержка ООО «ИнтерЛабСервис» - официальный дистрибьютор продукции компании QIAGEN. Мы справедливо гордимся оперативностью и уровнем профессионализма в отношении оказания консультационной поддержки в отношении продукции QIAGEN всем пользователям. 42 Сервисная служба ООО «ИнтерЛабСервис» предоставляет всестороннюю сервисную поддержку лабораторного оборудования, как в научно-исследовательских, так и в диагностических лабораториях с целью гарантии его продолжительной успешной работы. Клиенты компании «ИнтерЛабСервис» являются важным источником информации, полезной как для ученых и клиницистов. Мы будем рады, если вы свяжетесь с нами, если у вас есть какие-нибудь советы касательно продуктов, новых способов их применения и новых методов. 43
