НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (полинуклеотиды), биополимеры, осуществляющие хранение и
передачу генетич. инфор-мации во всех живых организмах, а также участвующие в биосинтезе
белков.
Первичная структура нуклеиновых кислот представляет собой последовательность остатков
нуклеотидов. Последние в молекуле нуклеиновых кислот образуют неразветвленные цепи. В
зависимости от природы углеводного остатка в нуклеотиде (D-дезоксирибозы или D-рибозы)
нуклеиновые кислоты подразделяют соотв. на дезоксирйбонуклеи-новые (ДНК) и
рибонуклеиновые (РНК) к-ты. В молекуле ДНК гетероциклы, входящие в остаток нуклеотида,
представлены двумя пуриновыми основаниями - адeнином (А) и гуанином (G), и двумя
пиримидиновыми основаниями -тими-ком (Т) и цитозином (С); РНК вместо Т содержит урацил (U).
Кроме того, в нуклеиновых кислотах в небольших кол-вах обнаруживаются модифицированные (в
осн. метилированные) остатки нуклеозидов- т. наз. минорные нуклеозиды, к-рыми особенно
богаты транспортные рибонуклеиновые кислоты (тРНК). Отдельные нуклеотидные остатки
связаны между собой в полинуклеотидных цепях 3'-5'-фосфодиэфирными связями (см. ф-лу).
Стандартная запись нуклеотидной последовательности осуществляется в направлении от 5'-конца
к 3'-концу (каждый нуклеотид обозначают буквой, присвоенной основанию, к-рое он содержит;
напр., последовательность приведенного участка ДНК записывается как ACGT).
Св-ва ДНК и РНК различны. Так, РНК легко расщепляется щелочами до мононуклеотидов
(благодаря наличию группы 2'-ОН), в то время как полинуклеотидные цепи ДНК в тех же условиях
стабильны. Это структурное различие определяет и меньшую устойчивость к воздействию к-т Nгликозидных связей (связь между гетероциклом и остатком рибозы) в ДНК по сравнению с РНК.
Дсзоксирибонуклепновые кислоты. Нуклеотидный состав ДНК подчиняется ряду правил (т.наз. п р
а в и л а Ч а р г а ф-ф а), важнейшее среди к-рых-одинаковое содержание А и Т, G и С у любой
клеточной ДНК. Нуклеотидный состав РНК подобным правилам не подчиняется.
Пространствю структура ДНК описывается как комплекс двух полинуклеотидных
антипараллельных цепей (рис. 1), закрученных относительно общей оси, так что углеводфосфатные цепи составляют периферию молекулы, а азотсодержащие гетероциклы направлены
внутрь (д в о й н а я с п и р а л ь У о т с о н а-К р и к а). Антипараллельность полинуклеотидных
цепей выражается в том, что на одном и том же конце спирали одна полинуклеотидиая цепь
содержит (незамещенную или замещенную) группу 5'-ОН, а другая 3'-ОН. Фундам. св-во двойной
спирали ДНК состоит в том, что ее цепи комплементарны друг другу (см. Комплементарностъ)вследствие того, что напротив А одной цепи всегда находится Т другой цепи, а напротив
G всегда находится С. Комплементарное спаривание А с Т и G с С осуществляется посредством
водородных связей. Классич. двойная спираль Уотсона-Крика получила назв. В-формы ДНК. Онаправозакрученная, плоскости гетероциклич. оснований перпендикулярны оси спирали, а число
пар остатков нуклеотидов на один виток спирали равно примерно 10; расстояние между витками
3,4 нм. При изменении ионной силы и состава р-рителя двойная спираль изменяет свою форму и
даже может превращ. в левозакрученную спираль (т.наз. Z-форму), к-рая содержит в одном витке
ок. 12 остатков нуклеотидов. При дегидратации В-формы образуется А-форма ДНКправозакрученная двойная спираль, содержащая в одном витке ок. 11 остатков нуклеотидов,
плоскости гетероциклич. оснований повернуты примерно на 20° относительно перпендикуляра к
оси спирали. Двойная спираль ДНК способна денатурировать (напр., при повышении т-ры) с
полным расхождением комплементарных цепей, к-рые сохраняют способность к ассоциации с
восстановлением (рекатурацией) двойной спирали при возвращении к исходным условиям.
Подробно изучены также кон-формации фрагментов ДНК.
Рис. 1. Двойная спираль ДНК (стрелками показано направление полинуклеотидной цепи). .
Установлено, чго молекула ДНК в клетке представляет собой совокупность генов, регуляторных
участков (последовательностей, связывающихся с регуляторными белками и управляющих
уровнем экспрессии генов), районов, участвующих в организации генов в хромосомах, а также
последовательностей, ф-ции к-рых еще не известны.
У прокариот (бактерии и синезеленые водоросли) ДНК организована в виде компактного
образования-н у к л е о и-д а, к-рый содержит всю хромосомную ДНК клетки длиной в неск.
миллионов пар нуклеотидов (м.п.н.). Кроме того, у мн. прокариог и эукариот (все организмы, за
исключением прокариот) обнаружены ьнехромосомные ДНК (т. наз. плаз-миды)размером от неск.
тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) до неск. десятков т.п.н. (м.п.н. и т.п.н.-принятые единицы длины
двухцепочечной молекулы нуклеиновых кислот)-
Мн. ДНК образуют кольцевые структуры. В том случае, если обе полинуклеотидные цепи ДНК
ковалентно непрерывны, ДНК может находиться в сверхспирализованной (сверхскрученной)
форме (рис. 2). В клетках сверхспирализация осуществляется ферментами ДНК-гиразами
(топоизомеразами II).
Хромосомные ДНК эукариот локализованы в клеточном ядре, где вместе с гистонами и
негистоновыми белками образуют хроматин -ну-клеопротеид, из к-рого организованы
хромосомы. Размеры ДНК в отдельных эукариотич. хромосомах колеблются в широких пределахот 103 до 105 т.п.н.
Рис. 2. Сверхспирализация двухцепочечной кольцевой ДНК под действием ДНК-гиразы: 1 кольцевая форма ДНК; 2 - сверхспирализованная форма ДНК.
Геномы мн. вирусов бактерий (бактериофагов), животных и в более редких случаях растений
представлены ДНК. Такие клеточные органеллы, как митохондрии и хлоропласты, имеют также
свою собственную ДНК размером от неск. десятков до неск. сотен т.п.н.
Биосинтез ДНК осуществляется в результате репликации-точного самокопирования
(самовоспроизведения) путем синтеза новой молекулы ДНК на исходной ("материнской"), к-рая
играет роль матрицы. Этот процесс осуществляется под действием фермента ДНК-полимеразы.
Матрицей для синтеза ДНК может служить также однотяжевая (одноцепочечная) РНК,
комплементарное копирование к-рой осуществляет фермент обратная транскриптаза.
Рибонуклеиновые кислоты. РНК, как правило, построены из одной полинуклеотидной цепи,
характерный элемент вторичной структуры к-рой - "шпильки", перемежающиеся однотяжевыми
участками (рис. 3). Шпилька - двутяжевая спиральная структура, образующаяся в результате
комплементарного спаривания оснований (А с U и G с С). Шпильки и соединяющие их однотяжевые участки РНК укладываются в компактную третичную структуру. Для тРНК вторичная
структура имеет характерную форму, к-рую наз. "клеверным листом". Известны редкие примеры
целиком двухспиральных молекул РНК.
Двухспиральные гибридные комплексы (ДНК и РНК) м.б. искусственно получены из
комплементарных однотя-жевых ДНК и РНК. Функциональноактивные РНК имеют размер от 70150 до неск. тысяч нуклеотидных остатков. Биосинтез РНК (транскрипция)обычно происходит в
результате комплементарного копирования ДНК-матрицы, к-рое осуществляет фермент РНКполимераза.
Известно неск. типов РНК. Рибосомные рибонуклеиновые кислоты, связываясь с рибосомными
белками, образуют рибосомы, в к-рых осуществляется синтез белка. Матричные
рибонуклеиновые кислоты служат матрицами для синтеза белков (трансляции). тРНК
осуществляют связывание соответствующей аминокислоты и ее перенос к рибосомам.
Обнаружены т.наз. малые ядерные РНК, участвующие в превращ. первичных продуктов
транскрипции в функционирующие молекулы; т.наз. антисмысловые РНК участвуют в регуляции
биосинтеза белка и репликации плазмидных ДНК. В виде РНК представлены геномы мн. вирусов
(РНК-содержащие вирусы), в к-рых матрицами для синтеза РНК служат вирусные РНК. Нек-рые
РНК обладают ферментативной активностью, катализируя расщепление и образование
фосфодиэфирных связей в своих собственных или др. молекулах РНК.
Определение первичной структуры (секвенирование) нуклеиновыхкислот. Секвенирование
нуклеиновых кислот позволяет определить в одном эксперименте последовательность
нуклеотидов в ДНК или РНК, содержащих неск. сотен мономерных звеньев. Методы основаны на
общем принципе - определении с помощью высоко-разрешающего электрофореза в
полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотида длины всех возможных фрагментов
секвенируемого участка нуклеиновой кислоты, содержащих на одном конце одну и ту же
последовательность нуклеотидов (гомогенный фрагмент), а на другом-один и тот же нуклео-тид.
Такие фрагменты получают двумя разл. способами. В первом случае (метод Максама-Гилберта)
гомогенный фрагмент ДНК или РНК, предварительно меченный радиоактивной меткой по одному
из концов, расщепляют хим. агентами, специфичными к одному из четырех нуклеотидных
остатков (A, G, С, Т или U); в случае РНК этот процесс осуществляют также специфич.
рибонуклеазами. Расщепление ведут в таких ограничивающих условиях, когда в каждой молекуле
нуклеиновой кислоты расщепляется только одна меж-нуклеотидная связь рядом с нуклеотидом
данного типа, независимо от его положения в цепи. Такую операцию проводят для каждого из
четырех нуклеотидных остатков и по длинам образующихся радиоактивных фрагментов
определяют положение каждого нуклеотида в цепи нуклеиновой кислоты.
В др. случае (м е т о д С е н г е р а) используют олиго- или полинуклеотидную затравку (праймер)
известной длины, коплементарную определенному участку нуклеиновой кислоты. Затравку
наращивают с помощью ДНК-полимеразы, останавливая синтез на одном из четырех типов
нуклеотидных остатков с равной вероятностью, независимо от его положения в цепи. Для этого к
смеси четырех прир. субстратов ДНК-полимеразы добавляют т.наз. терминатор (обычно 2', 3'-дидезоксинуклеозидтрифосфат) - аналог определяемого нукле-отидного остатка, попадание к-рого
на 3'-конец растущей цепи останавливает синтез. При этом радиоактивная метка вводится либо в
затравку, либо в субстрат. Операцию повторяют для каждого из четырех нуклеотидов; длину
образующихся радиоактивных фрагментов определяют стандартным способом. Эти методы в
настоящее время удалось полностью автоматизировать (заменив в ряде случаев радиоактивную
метку на флуоресцентную) и тем самым в тысячи раз повысить скорость секвенирования ДНК.
Получение нуклеиновых кислот. В клетках нуклеиновые кислоты связаны с белками, образуя
нуклеопротеиды. Выделение нуклеиновых кислот сводится преим. к очистке их от белков. Для
этого препараты, содержащие нуклеиновые кислоты, обрабатывают ПАВ и экстрагируют белки
фенолом. Послед, очистка и фракционирование нуклеиновых кислот проводятся с помощью
ультрацентрифугирования, разл. видов жидкостной хрома-тографии и гель-электрофореза. Для
получения индивидуальных нуклеиновых кислот обычно используют разл. варианты последнего
метода.
Совр. методы хим. синтеза нуклеиновых кислот позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в
т.ч. целые гены. Методич. основы хим.-ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X.
Кораной. Они включают: 1) хим. синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов, из к-рых затем в результате комплементационных взаимод. выстраиваются дуплексы фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях; 2)
соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4
ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетич. однотяжевых олигонуклеотидов проводят в
неск. этапов (рис. 4). Сначала (а) собирают небольшие дуплексы с "липкими" концами (однотяжевыми комплементарными участками), из к-рых затем последовательно (б, в и т. д.)
формируют более протяженные структуры. Т. обр. могут быть получены искусств. фрагменты ДНК
большой длины и с любой нуклеотидной последовательностью. С помощью генетич. инженерии
возможно клонирование (получение в индивидуальном виде и размножение) искусств. ДНК.
Рис.4. Схема синтеза полидезоксинуклеотида: 1,- соотв. 5'- и 3'-конец олигонуклеотидов; 3комплементарные участки концов дуплексов (:липкие: концы); а,б и в-стадии образования
дуплексов (все стадии катализируются Т4 ДНК-лигазой).
Синтез олигодезоксинуклеотидов Корана осуществил т. наз. фосфодиэфирным методом по схеме:
К динуклеотиду со своб. 3'-гидроксильной группой присоединяют таким же способом
динуклеотид с незащищенной 5'-фосфатной группой и т.д. (т.наз. блочный метод синтеза):
Несмотря на малую эффективность этого метода, были синтезированы олигонуклеотиды,
содержащие до 16 звеньев, из к-рых были собраны первые синтетич. гены. Фосфоди-эфирный
метод образования межнуклеотидных связей, использованный Кораной, имеет история,
значение. Однако разработанные им приемы введения и избират. удаления защитных групп
широко используются в др. методах синтеза нуклеиновых кислот.
Важным шагом в совершенствовании синтеза олигонукле-отидов явилась разработка т.наз.
фосфотриэфирного метода, к-рый осуществляют по схеме:
Образующийся динуклеотид далее (после частичного деблокирования фосфата) конденсируют
аналогичным образом с др. динуклеотидом и т.д. Применение этого способа, в к-ром используют
защиту фосфатной группы, позволило значит. сократить время синтеза и повысить выходы олигонуклеотидов.
Параллельно этим методам, к-рые осуществляют в р-рах, разрабатывались твердофазные способы
синтеза нуклеиновых кислот. В последнем случае процесс проводят в двухфазной системе;
нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный
компонент и необходимые реагенты находятся в р-ре.
Обычно в этом случае на первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью "якорной" группы к
нерастворимому полимеру. Затем его 5'-гидроксильную группу деблокируют и конденсируют с
нуклеотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного
динуклеозидмонофосфата деблокируют защитную группу в положении 5' и присоединяют след.
нуклеотид и т.д.
Наиб. распространенные методы твердофазного синтеза олигонуклеотидов основаны на
использовании нуклеотидного компонента, содержащего Р(III). В т.наз. амидофосфитном-способе
(рис. 5) нуклеотидным компонентом является эфир 3'-амидофосфита дезоксинуклеозида.
Достаточно устойчивые амидофосфиты при протонировании в присут. тетразола превращ. в
сильные фосфорилирующие агенты. Схема также включает блокирование непрореагировавшей
3'-гидроксигруппы достраивающегося олигонуклеотида (кэпирование) и окисление
межнуклеотидного фосфита. На рис. показан один цикл наращивания цепи, к-рый длится 5-7 мин
и далее повторяется. После завершения синтеза удаляют защитные группы с межнуклеотидных
фосфатов, отделяют олигонуклеотид от носителя, деблокируют группы NH2 гетероциклов.
Липофильную группу (МеО)2Тr удаляют после первого хроматографич. разделения.
Рис. 5. Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов амидофосфитным методом; П полимерный носитель, Ру- пиридин.
Др. метод основан на использовании гидрофосфориль-ного производного нуклеозида:
П-полимерный носитель
После снятия 5'-защитной диметокситритильной группы возможно присоединение след.
нуклеотида. Окисление межнуклеотидных фосфитных групп проводят после завершения синтеза
олигонуклеотида.
Стандартность операций в твердофазном синтезе олиго-нуклеотидов явилась основой для
автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с
помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов
реагентов и р-рителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с
закрепленным на нем первым нукле-озидом. После окончания синтеза и отделения полностью
защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и
анализ синтезир. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода
в автомате-синтезаторе за неск. часов получают 30-40-звен-ные олигонуклеотиды; возможен
синтез более чем 100-звен-ных фрагментов ДНК. Разработаны синтезаторы, позволяющие
проводить одновременно синтез неск. олигонукле-отидов.
Синтез олигорибонуклеотидов ферментативным путем осуществляют обычно с использованием
рибонуклеаз (РНаз) или полинуклеотидфосфорилаз (ПНФаз). В первом случае р-цию осуществляют
по схеме:
R-H или остаток олигорибонуклеотида
В качестве нуклеотидного и нуклеозидного компонентов применяют мономеры или
олигонуклеотиды. Эту р-цию используют для синтеза ди-, три- и тетрарибонуклеотидов. При
увеличении длины олигорибонуклеотида начинает преобладать обратная р-ция (гидролиз
олигонуклеотида).
Для синтеза олигорибонуклеотидов с большим числом звеньев используют ПН Фазу:
РР-Остаток пирофосфорной н-ты
Хим. синтез олигорибонуклеотидов проводят в осн. с использованием тех же приемов, как и при
синтезе ДНК. Дополнит. трудности связаны с селективной защитой 2'-гидроксигруппы рибозы, а
также с неустойчивостью фос-фодиэфирной связи РНК в щелочной среде.
Длинные фрагменты РНК получают из коротких, соединяя их с помощью РНК-лигазы.
Историческая справка. Нуклеиновые кислоты открыты в 1869-72 Ф. Мишером в ядрах (отсюда
назв.: лат. nucleus-ядро) клеток гноя и в сперме лосося. В 1889 Р. Альтман выделил их в чистом
виде (им же предложен термин "нуклеиновые кислоты"). В 1944 О. Эйвери показал, что с
помощью ДНК наследств. признаки м. б. переданы от одной клетки к другой и что ДНК, т. обр.,
является "в-вом наследственности". Хим. строение нуклеиновых кислот изучалось школами А.
Косселя, П. Левина, Дж. Гулленда и А. Тодда и было окончательно установлено к нач. 50-х гг.
Макромол. структура ДНК (двойная спираль) установлена в 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком на
основании данных рентгеноструктурного анализа, полученных Р. Франклин и М. Уилкинсом.
Нуклеотидный состав ДНК и РНК из многих объектов изучен Э. Чаргаффом и А. Н. Белозерским в
40-50-х гг. Изучение первичной структуры нуклеиновых кислот начато с сер. 60-х гг. с установления
нуклеотидной последовательности тРНК (Р. Холли). Ф-ции большинства РНК установлены к нач.
60-х гг. Было показано, что они участвуют в реализации генетич. информации, закодированной в
ДНК.
П. Доти и А. С. Спириным исследовано макромол. строение РНК. В сер. 70-х гг. разработаны
эффективные методы расшифровки первичной структуры ДНК и РНК (методы Максама-Гилберта и
Сенгера), к-рые в сочетании с методами генетич. инженерии позволили в течение след.
десятилетия определить нуклеотидные последовательности мн. генов, плазмид, вирусных ДНК и
РНК, рРНК и др. Разработаны приемы обработки этой информации с использованием ЭВМ. В 70-х
гг. Кораной разработаны методы синтеза ДНК; им впервые синтезированы прир. гены
(аланиновой и тиразиновой транспортных РНК). Начиная с сер. 70-х гг. создавались методы
получения рекомбинантных нуклеиновых кислот (образуются, напр., в результате встраивания
участка ДНК, в т.ч. гена, в плазмиду; см. Генетическая инженерия), к-рые существенно расширили
возможности структурно-функцион. исследований нуклеиновых кислот и создали базу для
использования достижений мол. биологии и генетики в биотехнологии. В 80-е гг. разработаны
эффективные методы химического (в т.ч. автоматического) синтеза олигонуклеотидов и крупных
фрагментов ДНК, к-рые широко используют для изучения структуры и ф-ций нуклеиновых кислот.
Лит.: Шабарова 3. А., Богданов А. А., Химия нуклеиновых кислот и их компонентов, М., 1978;
Страйер Л., Биохимия, пер. с англ., т. 3, М., 1985; Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д., Рекомбинантные
ДНК, пер. с англ., М., 1986; Зенгер В., Принципы структурной организации нуклеиновых кислот,
пер. с англ., М., 1987; Овчинников Ю.А., Биоорганическая химия, М., 1987, с. 295-397. А. А.
Богданов, 3. А. Шабарова.