Апоптоз («запрограммированная» гибель клеток)

Российский Государственный Медицинский университет.
Кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии РГМУ
Реферат на тему:
Перспективы регуляции процесса апоптоза в
фармакологических целях, а также механизмы
его регуляции и их изучение.
МБФ
Группа № 472
Студент: Киреев А.В.
Руководитель: д.м.н, профессор Карева Елена Николаевна
Москва, 2008
1
Апоптоз («запрограммированная», гетенически обусловленная гибель клеток) – это
очень важный биологический процесс. Он необходим для организма, так как благодаря
ему возможна элиминация организмом клеток, и это явление имеет место во всех высших
организмах. Апоптоз – один из важнейших процессов, происходящих в процессе
онтогенеза и эмбриогенеза. В данном случае он имеет место как у животных (например, в
процессе метаморфоза членистоногих), так и у человека (например, развитие
конечностей). Нарушения в процессе апоптоза могут привести к тяжёлым последствиям.
Ещё один из примеров – это апоптоз в пролиферирующих тканях организма, например, в
печени и надпочечниках. Так же апоптоз наблюдается при некоторых патологических
состояниях.
Актуальность проблемы изучения апоптоза состоит в том, что изучив механизмы,
которые имеют место в процессе апоптоза, можно научиться управлять этим процессом.
Это может использоваться, например, при лечении раковых заболеваний, так как запустив
апоптоз в раковых клетках мы тем самым избавимся от них, причём таким способом, что
это не будет загрязнять организм. Процесс апоптоза имеет место также при ишемии
миокарда. При этом происходит активация рецептора для фактора некроза опухолей
(TNFα), в результате чего запускается процесс апоптоза. Но при ишемии также идёт и
активный некроз миокарда (это можно увидеть на схеме 1):
Схема 1. Процессы, которые приводят кардиомиоцит к гибели при
ишемии.
По данной схеме видно, что при ишемии миокарда может происходить гибель
кардиомиоцитов. Это происходит либо путём некроза, либо путём апоптоза по
указанным в схеме механизмам (рисунок и информация была взята из книги «Rang and
Dale’s Pharmacology», H.P. Rang, M.M. Dale, J.M. Ritter, R.J. Flower, 2007)
В процессе некроза всё содержимое клетки, подвергшейся некрозу, выходит наружу, тем
самым загрязняя пространство рядом с другими клетками, т.е. имеется токсический
эффект, который неблагоприятен для организма. В процессе апоптоза такого загрязнения
не происходит, так как идёт образование апоптотических телец, которые затем
фагоцитируются макрофагами. В условиях острой ишемии это гораздо более
благоприятно, чем гибель клетки по механизму некроза. Тем самым, стимулируя процесс
апоптоза в данном участке, а не некроза, для сердечной мышцы создаются более
2
благоприятные условия. Кроме того, регулировка и управление процессом апоптоза
может быть важна и при лечении других патологий.
Во первых, апоптоз – сравнительно малоизученный процесс, и его изучение поможет
понять одно из фундаментальных явлений природы. Также изучение апоптоза поможет
найти механизмы, с помощью которых этим процессом можно будет управлять. В одних
случаях необходимо его «запускать», в других, наоборот, не давать этому процессу
развиваться. Например, одним из самых эффективных средств лечения онкологических
заболеваний было бы запускать процесс апоптоза в опухолевых клетках. Причём, лучше
всего добиться того, чтобы вещество, стимулирующее апоптоз, действовало только на
опухолевые клетки, и на самых ранних стадиях, и тогда все онкологические заболевания
были бы полностью искоренены. Процесс же «торможения» апоптоза позволит увеличить
продолжительность жизни отдельных клеток в тканях организма.
Для того, чтобы можно было управлять процессом апоптоза, необходимо знать его
молекулярные механизмы. В данной работе будут показаны эти механизмы, а также
данные исследований, с помощью которых эти механизмы изучаются.
Новизна проблемы заключается в том, что на данный момент фармакологических
препаратов, которые были бы созданы и использовались бы непосредственно для того,
чтобы влиять на процесс апоптоза не существует. Но с их появлением они, возможно,
могли бы успешно использоваться в медицине как сами по себе, так и комбинировано с
другими препаратами.
Процесс апоптоза – это очень древний процесс. В процессе эволюции он, как считается,
возник для того, чтобы регулировать численность самых простых многоклеточных
организмов. Есть гипотеза, что одним из первых живых организмов, у которых появился
процесс апоптоза, является Volvox, который относится к роду подвижных колониальных
зелёных водорослей (рисунок 1.)
Рисунок 1. Колонии Volvox (фотография, взята с сайта
http://www.nkj.ru/archive/articles/5133/)
Volvox -это один из самых простых организмов, имеющий генетически
детерминированную физическую смерть.
Процесс апоптоза может запускаться по различным причинам, но эти причины могут
иметь внешнее и внутреннее происхождение. Под внешним происхождением понимается
влияние на клетку внешних условий (например, взаимодействие различных веществ),
чаще всего ферментов на клеточные рецепторы, расположенные на внешней стороне
цитоплазматической мембраны. Внутренние – это процессы, запускающими апоптоз
только внутриклеточными механизмами. Схему апоптоза можно представить таким
образом, как на рисунке 2:
3
Рисунок.2. Два варианта развития апоптоза.
На этом рисунке виден механизм развития апоптоза. С правой стороны показан
процесс, индуцированный внешними, внеклеточными факторами, с левой стороны – запуск
апоптоза внутриклеточными факторами. При внутриклеточно-индуцированном запуске
процесса апоптоза происходит резкое увеличение внутри митохондрий пероксидазной
активности цитохрома ц (cytochrome c) (вероятнее всего под специфическим действием
на него липидов, схожих по строению и свойствам с содиумдодецилсульфатом (SDS)), в
результате чего цитохром ц выходит из митохондрий в цитоплазму клетки. Далее он
взаимодействует с белком Apaf-1, который, предположительно, тоже выходит из
митохондрий, и далее комплекс цитохром ц – Apaf-1 взаимодействуют с молекулой АТФ
(Аденозинтрифосфат, dATP), и далее соединяются с ферментом прокаспазой 3
(procaspase-3), и к этому комплексу присоединяется прокаспаза-9 (procaspase-9), и в
комплексе этих соединений она превращается в активную каспазу-9 (active caspase-9). В
результате хода всех этих реакций образуется апоптотичексое тельце (apoptosome
complex), и в нём фермент прокаспаза-3 (procaspase-3) превращается в активную каспазу-3
(active caspase-3), и далее происходит каскад ферментативных реакций, в результате
которых происходит процесс апоптоза, и клетка погибает естественным путём.
При внеклеточной активации процесса апоптоза вещества, которые вызывают
апоптоз, действуют на рецептор CD95L, расположенный на внешней стороне
цитоплазматической мембраны клетки. В результате этого фермент прокаспаза-8
(procaspase-8) превращается в каспазу-8 (caspase-8), затем каспаза-8 действует на белок
Bid, превращая его в tBid, и при этом каспаза-8 превращается в прокаспазу-3(procaspase-3).
Белок tBid действует на митохондрии, вызывая внутри неё действие липидов на цитохром
ц, в результате чего пероксидазная активность цитохрома ц увеличивается, и он выходит
в цитоплазу клетки. Далее процесс идёт точно также, как и при индуцированном
внутриклеточно запуска механизма апоптоза (MacFarlane, 2004) .
4
Очень важное значения в развитии апоптоза имеют свободнорадикальные реакции.
Например, это взаимодействие цитохрома ц с пероксидом водорода.
Ранее было выяснено, что во время апоптоза в цитоплазме клеток присутствует цитохром
ц (cytochrome C) – (Byung-Min Chii, Hyun-Ock Pae, Seon I Jang, Young-Myeong Kim and
Hun-Taeg Chung. Nitric oxide as a Pro-apoptotic as well as Anti-apoptotic Modulator//Journal
of Biochemistry and Molecular Biology, Vol.35, No.1, January 2002, pp116-126), которыц туда
попадает из-за того, что в процессе апоптоза происходит разрыв мембраны митохондрий,
у которых между мембранами находится цитохром ц (cytochrome C), в результате чего
цитохром оказывается в цитоплазме. Процесс разрыва митохондриальной мембраны
связан с появлением в результате различных процессов пероскидазной активности у
цитохрома. В частности, к её появлению приводит взаимодействие активного центра
молекулы цитохрома с пероксидом водорода. В наших экспериментах пероксидазная
активность будет возникать именно таким образом. Основной компонент активного
центра цитохрома ц является железо, поэтому, фактически, перекись водорода
взаимодействует с атомом железа. Реакцию можно представить таким образом:
H2O2+Fe2+→ Fe3++HO-+HO. , эту реакцию называют реакцией Фентона (Ю.А.Владимиров.
Свечение, сопровождающее биохимические реакции//Биология//соровский
образовательный журнал,№6,1999, стр25-32). Схема строения цитохрома ц показана на
рисунке 3:
а
б
5
в
г
Рисунок 3. На рисунке 3а изображена молекула цитохрома ц. На данном рисунке
молекула показана с Ван-Дер-Ваальсовыми радиусами, т.е. показаны радиусы в тех
пределах, в которых теоретически могут находиться электроны. Этот рисунок наиболее
правдоподобно показывает «внешний вид» молекулы, но в данном случае трудно
определить различные структуры молекулы, и не видно активного центра.
На рисунке 3б изображена молекула цитохрома ц в виде, при котором видна α-спираль
и β-складчатый слой вторичной структуры белка, можно видеть строение третичной
структуры белка, и виден активный центр белка с атомом железа.
На рисунке 3в показаны 6 координационных связей атома железа в молекуле цитохрома
ц, а так же видна молекула триптофана, которая расположена близко к активному
центру с атомом железа.
На рисунке 3г показан активный центр цитохрома ц: тетрапирольное кольцо и атом
железа. (Bushnell, G.W., Louie, G.V., Brayer, G.D. High-resolution three-dimensional structure of horse
heart cytochrome c. J.Mol.Biol. v214 pp. 585-595, 1990).
Проанализировав все эти данные, мы предположили, что пероксидазная активность
гемового центра цитохрома ц является одной из важных составляющих для развития
апоптоза. Для подтверждения гипотезы мы проделали несколько опытов.
Сначала мы решили проверить наличие пероксидазной активности цитохрома ц, и
влияние на неё липидных молекул. Для этого мы взяли раствор цитохрома ц, добавили
туда перекись водорода (H2O2),люминол , и липид содиумдодецилсульфат (C12H25NaO4S)
– далее на графиках он будет обозначаться как SDS. Его мы взяли потому, что в
митохондриях содержится много липидов, которые могут запустить апоптоз. Липид при
взаимодействии с цитохромом ц (далее на графиках он будет обозначаться, как Cyt C)
(который является белком с гемовым центром, содержащим железо) изменяет третичную
структуру белка, в результате чего от гемового центра отходят аминокислоты метионин
80 и триптофан 59 (см.рис.3), благодаря чему молекулам пероксида водорода легче
проникнуть к атому железа. При действии на железо (которое в обычном состоянии в
цитохроме имеет степень окисления +3 (Fe3+)) (в реакции Фентона описан процесс
взаимодействия со свободным атомом железа, поэтому там он имел заряд +2, в связанном
состоянии атом железа в цитохроме ц имеет заряд +3) теряет 2 электрона, и переходит в
состояние со степенью окисления +5 (Fe5+) (это состояние называют compound 1), затем
железо может забрать электрон у какой-либо лежащей рядом аминокислоты и перейти в
состояние со степенью окисления +4 (Fe4+) (это состояние называется compound 2).В
6
результате этой реакции из OH остатка от перекиси водорода и освободившегося
электрона образуется гидроксил-радикал HO.,который далее взаимодействует с
молекулой люминола, которая есть в растворе. Эта реакция имеет несколько стадий (
рисунок.4.)
Рисунок.4. Реакция взаимодействия гидроксил-радикала с люминолом.
В результате этой реакции происходит испускание кванта света (в данном случае это –
сверхслабое свечение, которое мы можем зафиксировать с помощью приборов)
(Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как
инструмент в медико-биологических исследованиях //Биология//Соровский
образовательный журнал, том 7 №1, 2001, стр.16-23, рисунок 4 взят из этого же
источника).
Перед описанием экспериментов и опытов сначала коротко об обозначениях
концентраций и единиц измерений. Для обозначения концентраций в некоторых случаях
мы использовали абсолютную концентрацию образца в данном растворе (она измерялась
в молях или миллимолях, но для обозначения концентрации SDS часто будет
использоваться обозначение концентрации, относительно цитохрома ц (cyt c). Эти
значения показывают, во сколько раз концентрация SDS в образце при данном опыте
отличается от концентрации цитохрома ц. Например, обозначение 1 к 1, или
относительная концентрация равна 1 означает, что если концентрация цитохрома ц в
растворе составляет 10 мМ, то концентрация SDS тоже составляет 10 мМ, а обозначение 1
к 100 или относительная концентрация 100 показывает, что концентрация SDS в 100 раз
больше, чем концентрация цитохрома ц.
Обозначением у.е. (условные единицы) обычно обозначают интенсивности свечения
по сравнению с некоторым нулём, т.е. за 0 при измерении хемилюминесценции принято
значение, при котором на фотоэлектронный умножитель не падает свет, при измерении
спектра поглощения за 0 принимается спектр поглощения фосфатного буфера (который
практически прозрачен).
b
При вычислении светосуммы мы пользовались формулой S   y( x)dx , т.е. вычисляли
a
светосумму, как площадь по кривой, полученной в результате измерения. Для вычисления
использовали численный метод разбиения на прямоугольники.
Также для обозначения содиумдодецилсульфата часто будет применяться обозначение
SDS, для обозначения цитохрома ц – Cyt C.
Для проверки того, что пероксидазная реакция в данном случае есть, мы использовали
метод измерения хемилюминесценции. Принцип метода заключается в том, что мы
измеряем сверхслабое свечение, которое имеет место быть при данной реакции. Раствор
7
мы помещаем в кювету, и свет, выходя из неё, попадает на фотоэлектронный умножитель,
который соединён либо с самописцем, либо с компьютером.
Нам необходимо было, во первых, доказать, что пероксидазная активность имеет
место, а во вторых, найти, в каких концентрациях и в каком соотношении брать цитохром
и содиумдодецилсульфат, чтобы хемилюминесценция была наиболее ярко выражена, и
при этом, чтобы использовать, по возможности, меньшее количество SDS и цитохрома .
Для этого мы делали опыт при соотношении концентраций цитохрома ц и
содиумдодецилсульфата от 1 к 0 до 1 к 4000. Для проведения экспериментов мы готовили
1 мл раствора, который во всех опытах содержал 10 мкл 1 мМ цитохрома ц, 50 мкл 2 мМ
перекиси водорода и 100 мкл люминола. Остальные 840 мкл составляли буферный
раствор и SDS, содержание которых в каждом опыте различалось. 10 мкл 1 мМ цитохрома
получились разведёнными в 100 раз, и его абсолютная концентрация составила 0,1 мМ,
или100 мкМ. Результаты опытов показаны на диаграмме 1. По ней видно, что с
увеличением содержания SDS интенсивность хемилюминесценции увеличивается:
Интенсивность хемилюминесценции в зависимости от
соотношения концентраций Cyt C и SDS
1к0
10
Интенсивность хемилюминесценции
(у.е)
1 к 50
9
8
1 к 100
7
1 к 200
6
5
1 к 400
4
1 к 800
3
2
1 к 1000
1
1 к 2000
0
0
100
200
300
Время (с)
400
500
600
1 к 4000
Диаграмма 1:
На графике 1 изображены результаты измерений хемилюминесценции раствора
цитохрома ц и содиумдодецилсульфата (SDS) в разных концентрационных
соотношениях. p<0.05
По оси абсцисс отложено время измерения в секундах, по оси ординат –
интенсивность хемилюминесценции. Кривыми показана кинетика
хемилюминесценции. На правой стороне диаграммы расположена колонка, с
помощью которой по цвету можно определить, какое концентрационное
соотношение имеет та или иная кривая.
По данным Диаграммы 1 можно определить зависимость светосуммы от соотношения
концентрация цитохрома и содиумдодецилсульфата. Данные показаны на диаграмме 2 и в
таблице 1:
8
Соотношение концентраций SDS к
цитохрому С
0
50
100
200
400
800
1000
2000
4000
Таблица 1.
Светосумма
1.573933
0.243033
0.246592
1.242092
8.437692
11.86132
8.9853
10.68142
12.68086
По этим данным была построена диаграмма 2, с помощью которой можно увидеть
наиболее эффективное соотношение концентраций для цитохрома ц и
содиумдодецилсульфата.
Зависимость светосуммы от соотношения
концентрации cyt-c SDS
14
Светосумма (у.е.)
12
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
400
500
600
700
Соотношенеие концентраций cyt-c и SDS
Диаграмма 2. Зависимость светосуммы от соотношения концентрации цитохрома и
содиумдодецилсульфата. p<0.05 .
По оси абсцисс отложено соотношения концентраций цитохрома и
содиумдодецилсульфата, по оси ординат – светосумма в условных единицах. Красной
стрелкой показано эффективное соотношение концентраций, которое мы будем
использовать в дальнейших опытах.
В обоих случаях мы измеряли хемилюминесценцию 1 мл раствора, который всегода
содержал 100 мкл 50 мМ раствора люминола и 50 мкл 2мМ раствора пероскида водорода,
9
так как эти концентрации являются наиболее приемлемыми (А.Н. Осипов, Г.О. Степанов,
Ю.А. Владимиров, А.В.Козлов, В.Е.Каган. Регуляция пероксидазной активности
цитохрома ц с помощью оксида азота и лазерного излучения//Биохимия, 2006, том 71,
вып. 10, стр.1392-1398).
Данные опыты показывают, что цитохром ц обладает пероксидазной активностью, и
что при добавлении содиумдодецилсульфата пероксидазная активность увеличивается, но
при соотношениях молярных концентраций 600 SDS на 1 цитохром кривая выходит на
плато, т.е. с этого момента увеличении относительной концентрации SDS к цитохрому
увеличивает пероксидазную активность намного меньше, чем до значения 1 к 600.
На следующей диаграмме приведены опыты с тетраолеоилкардиолипином (TOCL) Это
липид, который содержится в митохондриях клеток, и теоретически может
непосредственно влиять на цитохром С. Видно, что концентрации, при которых
пероксидазная активность цитохрома С становится высокой, гораздо ниже, цем
концентрации SDS-а. Это связано с тем, что SDS, являясь детергентом, поверхностно
взаимодействует с молекулой цитохрома С, в то время, как TOCL двумя из своих
гидрофобных хвостов может проникать к центру молекулы цитохрома, и влиять на него
изнутри.
Кинетика хемилюминесценции с разными
концентрациями тетраолеоилкардиолипина
8
50 TOCL
7
40 TOCL
6
20 TOCL
Время (с)
5
15 TOCL
4
10 TOCL
3
8 TOCL
2
6 TOCL
1
4 TOCL
0
0
50
100
150
200
250
Интенсивонсть хемилюминесценции (у.е.)
300
2 TOCL
10
Зависимость светосуммы хемилюминесценции цитохрома
с в смеси с кардиолипином от концентрационных
соотношений
300
Светосумма
250
200
150
100
50
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
c(TOCL)/c(CytC)
В следующем этапе исследования нам надо подробнее узнать механизмы воздействия
SDS на Cyt C, а также лучше понять, что происходит с самой белковой молекулой. Для
этого мы будем измерять спектр поглощения цитохрома ц в присутствии SDS в различных
концентрациях. При добавлении в раствор цитохрома ц раствора SDS, у цитохрома ц
начинает изменяться третичная структура белка, т.е. изменяется конформация, и при этом
происходит отдаление метионина 80 от гемового центра, в результате чего оптическая
плотность при длине волны около 695 нм уменьшается (Silke Oellerich, Hainer Wackerbarth, Peter
Hildebrandt. Conformational equilibria and dynamics of cytochrome C induced by binding of sodium dodecyl
sulfate monomers and micelles//Eur Biophys Journal (2003) 32. pages 599-613).
Принцип метода спектроскопии заключается в том, что многие вещества поглощают
свет определённых длин волн. Самый простой пример этого – это жидкость какого-либо
цвета. Мы можем видеть цвет жидкости, потому, что жидкость поглощает свет в том
диапазоне длин волн, каким цветом мы видим жидкость. Длина волны поглощения
зависит от различных квантовомеханических параметров. Принцип спектрофотомерии
основан именно на этом явлении. Эксперимент проводится таким образом: в специальный
прибор (спектрофотометр) ставят кювету с исследуемым раствором, за нем через кювету
пропускают цвет с разными длинами волн, и в том участке длин волн, где будет
происходить поглощение, будет наблюдаться высокая оптическая плотность,
интенсивность света, попавшего на детектор, на который попадает вышедший из кюветы
свет, будет меньше, чем интенсивность света, который вышел из источника света. Этот
процесс описывается с помощью закона Бугера-Ламберта-Бера, который математически
выражается так:
I

 cl
I 
0
Где I – это интенсивность света, падающего на кювету (размерность Дж/(с*м2)), I0 –
интенсивность света, вышедшего из кюветы. ℮ - экспонента (приблизительно равна 2,7), ε
– молярный коэффициент поглощения (фактически, при спектрофотометрических опытах
11
мы будем оценивать именно его), с – молярная концентрация вещества, l – ширина
кюветы (или, если точнее, длина пути, пройденная светом). У цитохрома ц есть три пика
в спектре поглощения в видимой области длин волн: это полоса Саре – 417 нм, которая
обусловлена поглощением самого гемового комплекса. Ещё мы видим увеличение
оптической плотности в районе 550 нм, а при большом разрешении спектра можно
увидеть пик в районе 695 нм.
На рисунке 5 представлен принцип спектрофотометрического исследования.
Большинство соединений и молекул имеют свой спектр поглощения, и при некоторых
изменениях иногда он может немного изменяться (в нашем случае это изменение
конформации белковой молекулы цитохрома ц). В нашем случае это происходит при
взаимодействии SDS, в частности, в нашем случае это влияет на изменение величины
оптической плотности в определённых участках спектра.
Источник
света
I0
I Светоприёмник
Кювета с исследуемым веществом
На данном рисунке видно, что источник испускает свет во всём видимом
диапазоне, однако, проходя кювету с веществом, которое поглощает свет в
жёлто – зелёной области, выходят только тем световые волны, которые
имеют длину волны, отличную от спектра поглощение вещества,
находящегося в кювете. Поэтому в желто-зеленой области, в данном
случае, будет большая оптическая плотность, и график оптической
плотности будет выглядеть примерно вот так (рис.5):
Оптическая
плотность
Рисунок 5. Основные принципы метода спектрофотометрии.
12
Далее влияние SDS на цитохром ц мы исследовали методом спектроскопии.
Стандартный спектр поглощения цитохрома ц (при его концентрации в буферном
растворе 20 мкМ) выглядит таким образом (диаграмма 3.). На диаграмме 3 мы видим
только 2 пика. Пик в района 695 нм мы видеть не можем, так как для того, чтобы его
увидеть, нам нужен гораздо более маленький масштаб, чем на диаграмме 3.
Пик 695 представлен на диаграмме 4.
Для проведения опыта мы брали кювету на 3 мл, подбирали соответствующие
концентрации Cyt C и SDS в расчете на то, чтобы вместе с фосфатным буфером объём
исследуемого раствора составлял 3 мл.
Спектр поглощения 20 мкМ Cyt C
1.8
Оптическая плотность
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
350
450
550
650
750
Длина волны (нм)
Диаграмма 3. Спектр поглощения 20 мкМ цитохрома ц.
По оси абсцисс на данной диаграмме отложена длина волны (нм), по оси ординат –
значение оптической плотности (у.е.).
При данной концентрации спектр имеет 3 пика, из которых на диаграмме видны
только 2 из них (пик на 420 нм и 540 нм), третий пик (695 нм) на диаграмме не виден
из-за большого масштаба диаграммы.
13
Пик в районе 695 нм можно увидеть, делая измерения в узком интервале оптической
плотности, Результат показан на диаграмме 4. По оси абсцисс на нем взята оптическая
плотность в промежутке от 0,05 до 0,1 у.е., а также для более удобного просмотра и
анализа результатов кривая спектра поглощения по оси абсцисс (на ней отложена длина
волны нм) взята в интервале от 650 до 710 нм. На этих интервалах пик 695 виден очень
хорошо, и можно легко увидеть, как уменьшается спектр поглощения в промежутке
данных длин волн при добавлении SDS.
Спектр поглощен ия Cyt C
0.1
Оптическая плотность (у.е.)
0.095
0.09
0.085
0.08
0.075
0.07
0.065
0.06
0.055
0.05
650
660
670
680
690
700
710
Длина волны (нм)
Диаграмма 4. Спектр поглощения цитохрома ц. По оси абсцисс отложена длина
волны в нм, по оси ординат – оптическая плотность ( в у.е.). Это тот же самый
опыт , что и опыт, показанный на диаграмме 3, но взят намного более маленький
масштаб по оси ординат (оптическая плотность), и для удобства немного уменьшен
масштаб по оси абсцисс (длина волны).
Далее мы добавляли к раствору цитохрома SDS, и снова проводили измерения.
Полученные результаты представлены на диаграмме 5.
На этой диаграмме видно, что с увеличением концентрации SDS оптическая плотность
на данном участке уменьшается, что связано с изменением конформации цитохрома ц, т.е.
мы видим, что наше предположение о том, что SDS изменяет конформацию белка
цитохрома ц подтвердилось. Теперь мы можем наглядно увидеть связь между
концентрацией SDS в растворе цитохрома ц и оптической плотностью (диаграмма 6).
Опыт мы проводили с концентрацией цитохрома ц 90мкМ, SDS в таком количестве,
чтобы он был в конкретной относительно Cyt C концентрации, а затем фосфатным
буфером объём раствора доводился до 3 мл, и образец помещался в спектрофотометр для
измерения спектра поглощения образца.
Результаты опытов представлены на диаграмме 5:
14
Зависимость спектра поглощения Cyt C + SDS от длины волны в разных
концентрациях
0.1
Оптическая плотность (у.е.)
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
650
660
670
680
690
Длина волны (нм)
700
710
Спектр поглощения Cyt C и SDS
в соотношении концентраций
[1:1]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 4]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 10]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 15]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 21]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 32]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 43]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 55]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 64]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 94]
Спектр поглощения Cyt C + SDS
в соотношении концентраций
[1 к 121]
Диаграмма 5. Зависимость спектра поглощения цитохрома ц и SDS от длины
волны в разных концентрациях.
На данной диаграмме по оси абсцисс отложена длина волны ( в нм) в интервале от
650 до 710 нм, по оси ординат отложена оптическая плотность в у.е. в интервале от
0 до 0,1 у.е. Данные масштабы позволяют нам чётко видеть спектр поглощения в
районе 695 нм, и позволяет видеть уменьшение оптической плотности с увеличением
содержания SDS в растворе. Отношение концентраций цитохрома ц и SDS можно
определить по цвету, используя столбец с обозначениями на правой стороне
диаграммы.
По данным эксперимента можно точно сказать, что оптическая плотность в данном
диапазоне длин волн уменьшается с увеличением концентрации содиумдодецилсульфата
в образце, что объясняется изменением конфигурации третичной структуры белка.
Теперь на основе этого можно построить график зависимости оптической плотности в
интервале длин волн от 605 до 710 нм от концентрации содиумдодецилсульфата в
исследуемом образце. Он представлен на диаграмме 6. По ней можно видеть, что с
увеличением концентрации SDS. Для большей наглядности на диаграмме представлена
линия, показывающая абсолютную концентрацию SDS в растворе с Cyt C в данном опыте
(в миллимолях).
15
2.007
120
2.002
100
1.997
80
1.992
60
1.987
40
1.982
20
1.977
Концентрация SDS
относительно Cyt C
Оптическая плотность
(у.е.)
Соотношение между концентрацией SDS и оптической
плотностью
0
0
2
4
6
8
10
Абсолютная концентрация SDS в растворе (мМ)
Диаграмма 6. Соотношения между концентрацией SDS и оптической плотностью.
На левой шкале диаграммы отложена оптическая плотность (у.е.), на правой –
концентрация SDS в отношении к 1 цитохрому. По оси абсцисс показана обсолютная
концентрация цитохрома ц в молях. Синей кривой показана зависимость изменения
оптической плотности от концентрации SDS, розовой кривой показано изменение
концентрации SDS в процессе эксперимента.
Данные, по которым построен график, представлены в таблице 2:
Оптическая
плотность
2.007
1.996
1.991
1.990
1.989
1.988
1.988
1.987
1.983
1.982
1.982
Абсолютная концентрация
(мМ)
0.09
0.36
0.9
1.35
1.89
2.88
3.87
4.95
6.03
8.46
10.89
Относительная
концентрация
1
4
10
15
21
32
43
55
67
94
121
Таблица 2.
С помощью спектрофотомерии мы увидели, что светосумма в районе 695 нм
уменьшается, что может говорить об изменении конформации белковой молекулы.
Чтобы подтвердить то, что SDS действительно изменяет конформацию цитохрома, мы
использовали метод флуориметрии.
Метод флуориметрии чем-то схож с методом спектрофотометрии, но отличие в том,
что измеряется количество света, которое выделило само вещество под действием на него
световых лучей, которые попали в кювету с исследованным веществом из источника
16
света. Свет, который испускается источником света, на приёмник не попадает. Принцип
флуориметрии показан на рисунке 6:
Светоприёмник
Свечение, которое испустили
молекулы под действием света,
идущего из источника.
Источник
света
Кювета с исследуемым веществом
Принцип флуориметрии состоит в том, что неспаренные электроны по действием света,
испущенного источником, переходят с самого низкого энергетического уровня (S0 –
синглетный нулевой уровень) на более высокий энергетический уровень, например, S1
уровень. Далее электрон вновь попадает на S0 уровень, и этот процесс может
сопровождаться испусканием кванта света. Процесс перехода может происходить тремя
путями: это либо переход с более высокого энергетического уровня сразу на S0,и при
этом испустив квант света. Этот процесс называют флуоресценцией. Либо сначала с
более высокого энергетического уровня электрон переходит сначала на триплетный (Т)
уровень, а затем на S0 уровень, также с испусканием кванта света, этот процесс
называют фосфоресценцией. Либо переход с более высокого энергетического уровня на
более низкий может проходить вообще без испускания света, и такой переход называют
безизлучательным. Это показано на схеме.
S2
S1
T1
S0
Поглощение
Флуоресценция
Фосфоресценция
Рисунок 6. Основные принципы флуориметрии.
17
Все эти схемы показывают основные принципы флуориметрии (Ю.А.Владимиров,
Е.В.Проскурнина. Лекции по медицинской биофизике//издательство МГУ//Москва.2007.
Но при этом при разных длинах волн интенсивность флуоресценции меняется, и у разных
веществ частота электронного возбуждения разная. У триптофана – это начальная
ультрафиолетовая область спектра.
Методом рентгеноструктурного анализа было выяснено, что у цитохрома ц рядом с
активным (гемовым) центром находится аминокислота триптофан,
(картинка с формулой триптофана взята из сайта
http://www.fizlabpribor.ru/Cas/153_94_6.php?NF=1) которая в первичной структуре белка имеет
положение 59 (Silke Oellerich, Hainer Wackerbarth, Peter Hildebrandt. Conformational equilibria and
dynamics of cytochrome C induced by binding of sodium dodecyl sulfate monomers and micelles//Eur Biophys
Journal (2003) 32. pages 599-613). SDS при действии на цитохром ц будет изменять его
конформацию, и при этом триптофан отдалится на некоторое расстояние, и под действием
ультрафиолетовых лучей в результате чего электроны перейдут на более высокий
уровень, а затем, в результате интерконверсии произойдет испускание кванта света (Ю.А.
Владимиров. Свечение, сопровождающее биохимические реакции//Биология//соровский
образовательный журнал, №6, 1999 стр.25-32). Без SDS этого свечения нет, так как
молекула триптофана находится очень близко к молекуле железа, и железо берёт УФ-лучи
на себя. Результаты эксперимента представлены на диаграмме 7. По данным,
полученным по диаграмме 7, построим таблицу (таблица 3) и диаграмму (диаграмма 8)
зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации SDS, содержащегося в
растворе с цитохромом ц. При нахождения светосуммы мы пользовались тем, что по
определению интеграл от функции даёт нам значение площади под кривой, которая, в
нашем случае, равна светосумме, так как по оси ординат у нас отложены величины,
эквивалентные количеству света.
Таблица 3.
Относительная
концентрация SDS
0
3
10
20
30
50
75
100
120
150
200
300
400
600
700
Светосумма флуоресценции
0.130011765
0.123817647
0.123364706
0.126635294
0.129158824
0.1639
0.200682353
0.204494118
0.213376471
0.221652941
0.232947059
0.247023529
0.270664706
0.270388235
0.2801
18
Флуорисценция Cyt C [10
mkM]
флуорисценция cyt C [ 10
mkM] + SDS [100 mkM]
0.55
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [10 mkM]
0.5
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [ 20 mkM]
Интесивность флуорисценции (у.е.)
0.45
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [3 mkM]
флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [75 mkM]
0.4
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [ 120 mkM]
0.35
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [150 mkM]
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [400 mkM]
0.3
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [200 mkM]
0.25
Флуорисценция Сyt C [10
mkM] + SDS [300 mkM]
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [400 mkM]
0.2
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [50 mkM]
0.15
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [30 mkM]
0.1
280
330
380
Длина волны (нм)
430
Флуорисценция Cyt C [10
mkM] + SDS [600 mkM]
Флуорисценция Cyt C [10
mkM ] + SDS [700 mkM]
Диаграмма 7. Зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны при
разной концентрации SDS. По оси абсцисс отложена длина волны (нм), по оси
ординат – интенсивность флуоресценции. С правой стороны показаны концентрации
SDS и соответствующие цвета на графике.
По графику видно, что с увеличением концентрации SDS интенсивность флуоресценции
увеличивается.С помощью этих данных можно построить зависимость между
интенсивностью флуоресценции и концентрацией SDS в растворе с цитохромом ц. Эта
зависимость представлена на диаграмме 8.
19
Зависимость между интенсивностью и
концентрацией SDS
Светосумма флуорисценции
0.3
0.28
0.26
0.24
0.22
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0
100
200
300
400
500
600
700
Концентрация SDS относительно Cyt C
Диаграмма 8. Зависимость интенсивности флуоресценции цитохрома ц от
концентрации SDS.
На данной диаграмме показана зависимость светосуммы флуоресценции в
зависимости от концентрации SDS в растворе цитохрома ц. По оси абсцисс
отложена концентрация SDS относительно цитохрома ц, по оси ординат –
светосумма флуоресценции. Концентрация цитохрома ц в каждом эксперименте – 10
мкМ.
Эти данные сходны с данными, полученными при экспериментах с кардиолипином:
Флуоресценция цитохрома с в смеси с тетраолеоилкардиолипином при различных
концентрационных соотношениях
Полиномиальный (100
tocl+cyt c)
Полиномиальный (80
tocl+cyt c)
0,6
Полиномиальный (60 tocl+
cytc)
Интенсивность флуоресценции
0,5
Полиномиальный (40
tocl+cytc)
0,4
Полиномиальный (30
tocl+cytc)
0,3
Полиномиальный (20
tocl+cyt c )
0,2
Полиномиальный (5
tocl+cyt c)
0,1
Полиномиальный (10
tocl+cyt c)
Полиномиальный (cyt c
only)
0
290
310
330
350
370
390
410
Длина волны, нм
Полиномиальный (cyt c
only)
20
Максимум флуоресценции
Зависимость максимума интенсивности флуоресценции
цитохрома С в смеси с тетраолеоилкардиолипином при длине
волны ~315нм от концентрационных соотношений
0,68
0,58
0,48
0,38
0,28
0,18
0
20
40
60
80
100
120
c(TOCL)/c(CytC)
Теперь, имея данные нескольких экспериментов, можно их сравнить.
Возьмем данные, полученные методом спектрофотометрии, и данные, полученные
методом флуориметрии. Оба эксперимента доказывают, что молекула SDS меняют
конформацию молекулы цитохрома ц, и чем больше таких молекул (т.е. чем больше
концентрация SDS), тем сильнее меняется конформация молекулы цитохрома ц.
Построим по данным экспериментам график (диаграмма 9). На этой диаграмме видно,
что при увеличении концентрации SDS в растворе уменьшается оптическая плотность, но
одновременно увеличивается интенсивность флуоресценции, причём эти изменения
пропорциональны друг другу. Это связано с тем, что при увеличении концентрации SDS
от гема отходит всё дальше метионин 80, из-за чего уменьшается оптическая плотность,
но одновременно более «доступным» для ультрафиолетовых лучей становится триптофан,
поэтому интенсивность флуоресценции возрастает. И, как мы видим на диаграмме 9, эти
прочесы происходят пропорционально, что подтверждает то, что было написано выше.
21
Сравнение светосумм, полученных с помощью метода
спектофотометрии и флуориметрии
0.08
0.22
0.21
0.07
0.19
0.05
0.18
0.17
0.04
0.16
0.03
0.15
0.02
Интенсивность
флуоресценции (у.е.)
Оптическая
плотность(у.е.)
0.2
0.06
0.14
0.01
0.13
0
0.12
0
20
40
60
80
100
120
Концентрация SDS по отношению к Cyt C
Спектрофотометрия
Флуориметрия
Диаграмма 9. Сравнение значений светосумм, полученных методами
спектрофотометрии и флуориметрии.
По данной диаграмме можно увидеть, что в результате увеличения концентрации
SDS уменьшается оптическая плотность, и увеличивается интенсивность
флуоресценции. По оси абсцисс отложена концентрация SDS относительно
цитохрома ц, по левой оси (сиреневый цвет) отложена оптическая плотность (в
условных единицах), по правой оси (голубой цвет) отложена интенсивность
флуоресценции (также в условных единицах).
Все проделанные опыты были проделаны с цитохромом в том виде, когда гем не был
связан с другими соединениями, и мы могли сразу наблюдать его пероксидазную
активность. Но для регуляции процесса апоптоза нам необходимо регулировать
пероксидазную активность цитохрома ц. Есть сведения, что полностью заблокировать
пероксидазную активность цитохрома ц может молекула оксида азота (NO), NO
присоединяется к железу, и мешает перекиси водорода добраться и прореагировать с
атомом железа. Оксид азота есть в организме человека, и он есть внутри клетки, поэтому,
в случае необходимости он может использоваться клеткой, как антиапоптотический
модулятор (Byung-Min Chii, Hyun-Ock Pae, Seon I Jang, Young-Myeong Kim and Hun-Taeg
Chung. Nitric oxide as a Pro-apoptotic as well as Anti-apoptotic Modulator//Journal of
Biochemistry and Molecular Biology, Vol.35, No.1, January 2002, pp116-126). Поэтому было
важно доказать, что оксид азота действительно может подавлять пероксидазную
активность цитохрома ц даже при наличии липида в растворе, например, SDS.
Для опытов мы брали концентрационное соотношение SDS к цитохрому ц 1 к 600, так
как это соотношение является наиболее эффективным (см. диаграмму 2.). Чтобы NO
провзаимодействовало с гемом, NO мы добавляем в виде раствора. Для приготовления
раствора берётся герметично закрытая ёмкость с буферным раствором, и в неё
прокачивается NO. Концентрация растворённого NO в таком растворе примерно 2 мМ.
Далее эксперимент проводился также, как и опыты, которые проводились до этого. Мы
22
провели несколько опытов с разными концентрациями NO в конечном растворе,
результаты представлены на диаграмме 10.
Кинетика хемилюминесценции при разных
концентрациях NO
100 mkl
NO
Интенсивность
хемилюминесценции (у.е)
8
7
200 mkl
NO
6
5
400 mkl
NO
4
3
500 mkl
NO
2
1
0
0
100
200
300
400
500
Без
добавлен
ия NO
600
Время (с)
Диаграмма 10. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от содержания в
растворе молекул NO (оксида азота).
По оси абсцисс отложено время измерения (с), по оси ординат отложена
интенсивность хемилюминесценции (у.е.). В правой части диаграммы указаны
объёмы добавленного 2мМ раствора NO (мкл), а также соответствующие этим
объёмам цвета кривых на графике.
Глядя на диаграмму, можно увидеть, что с повышением содержания NO в растворе
интенсивность хемилюминесценции резко понижается. Это говорит о том, что NO
снижает пероксидазную активность цитохрома ц. Зависимость между содержанием
раствора NO в образце с амплитудой максимального пика и светосуммой можно увидеть
по таблице и на диаграмме 11 и таблице 4.
Объём раствора NO
в образце (мкл)
Концентрация NO в
образце (мМ)
0
100
200
400
500
0
0.2
0.4
0.8
1
Амплитуда
максимального пика
(у.е.)
7.575
3.08
2.125
1.11
0.535
Светосумма
(у.е.)
12.58
1.97
1.38
0.49
0.28
23
Зависимость светосуммы и амплитуды максимального пика
хемилюминесценции от содержания NO в растворе
3
1.5
2.5
1
2
0.5
1.5
0
1
0.5
100
Зависимость
максимального
пика
хемилюминесценци
и от количества
добавленного
раствора NO
2
Светосумма (у.е.)
Амплитуда максимального пика
(у.е.)
3.5
-0.5
200
300
400
Зависимость
светосуммы
хемилюминесценци
и от количества
добавленного NO
-1
500
Количесто раствора NO, содержащегося в образце (мкл)
Диаграмма 11. Зависимость светосуммы и амплитуды максимального пика
хемилюминесценции от содержания NO в растворе.
По оси абсцисс отложен объём раствора NO, который содержался в конечной пробе.
На левой оси (синего цвета) отложена амплитуда сигнала хемилюминесценции, на
правой оси (розового цвета) – светосумма хемилюминесценции. Синей кривой
показана зависимость амплитуды максимального пика от содержания NO в
конечном растворе, красной кривой – зависимость светосуммы от содержания NO в
конечном растворе.
Таким образом, мы ясно видим, что с увеличением содержания оксида азота
пероксидазная активность цитохрома ц резко падает, что используется организмом для
торможения развития процесса апоптоза, и это же самое явление можно использовать в
медицинских целях.
Далее можно проделать такой опыт, чтобы узнать, как можно убрать оксид азота из
гемового центра. Для этого можно использовать лазер приемлемыми (А.Н. Осипов, Г.О.
Степанов, Ю.А. Владимиров, А.В.Козлов, В.Е.Каган. Регуляция пероксидазной
активности цитохрома ц с помощью оксида азота и лазерного излучения//Биохимия,
2006, том 71, вып. 10, стр.1392-1398). Опыт проводится следующим образом: готовиться
образец (точно также, как до этого в опытах с NO, раствора NO добавляем 200 мкл), но
перед тем, как проводить измерения хемилюминесценции, держит образец 15 мин под
лазерным излучением. Для чистоты эксперимента проделаем такой же опыт, но образец 15
мин. просто будет стоять на воздухе. Результаты представлены на диаграмме 12.
24
Кинетика хемилюминесценции в различных опытах
Интенсивность хемилюминесценции
(у.е.)
10
Хемилюминесценци
я 10 мкМ Cyt C +
4000 мкМ SDS
9
8
7
6
Хемилюминесценци
я 10 mkM Cyt C +
4000 мкМ SDS + 200
мкл NO
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
400
500
600
Хемилюминесценци
я 10 mkM Cyt C +
4000 mkM SDS + 200
мкл NO + действие
лазером в течении
15 мин
Время (с)
Диаграмма 12. Кинетика хемилюминесценции в различных опытах.
На данной диаграмме представлена кинетика хемилюминесценции четырёх опытов:
хемилюминесценции Cyt C + SDS, Cyt C + SDS + NO, Cyt C + SDS + NO + лазер.. По оси
абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат – интенсивность
хемилюминесценции в условных единицах. В правой части диаграммы находится
описание эксперимента, и соответствующий цвет кривой.
Мы видим, что образцы, в которых было NO, обладают гораздо большей
пероксидазной активностью.
Данные, полученные с помощью диаграммы 12, расположены в таблице 5.
Светосумма
Максимальный пик
Без NO и лазера
5.1436
8.025
NO
0.398658333
2.995
NO + лазер
2.43035
3.48
Таблица 5.
И, наконец, на диаграмме 13 представлены конечные результаты опытов с NO и
лазером:
25
100%
SDS
43%
37%
Контроль
NO
NO + лазер
Диаграмма 13. p<0.05. Конечные результаты опытов с NO и лазером.
Здесь представлена гистограмма, с помощью которой можно оценить влияние NO на
уменьшение пероксидазной активности, и влияние лазерного излучения на увеличение
пероксидазной активности цитохрома ц. Столбцами обозначены светосумма
хемилюминесценции. Рядом с верхним краем показаны значения этих величин в
процентах от контроля (т.е. [SDS]/[Cyt C] = 1/600, без добавления NO и без дейсивия
лазера), внизу – подписи о составе кюветы и условиях приведения эксперимента.
Сходные результаты получаются и для кардиолипина:
Кинетика хемилюминесценции TOCL при различных
опытах
10
9
CytC без
добавок
8
Время (с)
7
6
5
15 min NO
4
3
2
1
0
0
200
400
Интенсивность (у.е.)
600
15 min
NO+Laser
26
100%
TOCL
49%
31%
Контроль
NO
NO + лазер
Известно, что при лечении онкологических заболеваний часто используется облучение
лазером. Данные исследование могут объяснить механизм действия лазерного излучения
на раковые клетки.
Все эти работы показывают, что возможно регулирование пероксидазной активности
цитохрома ц, а значит, в перспективе, и искусственное регулирование процесса апоптоза,
причём как в сторону его запуска, так и в сторону его прекращения. Это обусловлено тем,
что пероксидазная активность цитохрома ц является одной из важнейших составляющих в
развитии процесса апоптоза. Это можно представить в виде такой схемы (рисунок 7):
27
Рисунок 7. Предполагаемая роль оксида азота и лазера в развитии апоптоза.
На данном рисунке представлен индуцированный внутриклеточно процесс апоптоза,
но прибавлена схема влияния NO и лазера. Синяя «скобка» NO как бы блокирует
выходящий из митохондрии цитохром ц, т.е. апоптоз развиваться не будет. Другая
синяя скобка (лазер) убирает скобку с NO, т.е. процесс, который был приостановлен
молекулами NO, снова пойдёт. (Степанов Г.О. Биофизические механизмы апоптоза //на
утверждение темы диссертационной работы).
В результате можно сделать выводы, что имеется возможность влияния на процесс
апоптоза, причём как с помощью физических воздействий (облучения лазером), так и
химического воздействия (с помощью NO или пероксида водорода). Всё это отражено на
рисунке 8:
28
Влияние на апоптотические
Цитохром
процессы
с
Лазе
р
NO
увеличивает
Пероксидазная
акт ивност ь цит охрома С
уменьшает
Регуляция
апопт оза
Лечение
заболеваний
Рисунок8.
Выводы:
Процессом апоптоза теоретически возможно управлять, в частности, с помощью
изменения его пероксидазной активности.
Пероксидазную активность можно регулировать, увеличивая концентрацию липидов в
растворе с цитохромом С, а также с помощью NO, и с помощью облучения лазером.
29
В данном реферате использовались не только данные, полученные из литературы, но и
результаты экспериментов, полученные непосредственно автором данного реферата. Все
опыты с SDS (измерение хемилюминесценции, флуориметрии, спекрофотометрии,
приготовление растворов, в том числе получение раствора оксида азота) проведены
непосредственно автором.
30
Список используемой литературы:
H.P. Rang, M.M. Dale. Pharmacology. Churchill Livingstone Elsevier, 2007
Thomas D. Polland, William C. Earnsnaw. Cell Biology. Saunders Livingstone, 2008
Byung-Min Chii, Hyun-Ock Pae, Seon I Jang, Young-Myeong Kim and Hun-Taeg
Chung. Nitric oxide as a Pro-apoptotic as well as Anti-apoptotic Modulator//Journal of
Biochemistry and Molecular Biology, Vol.35, No.1, January 2002, pp116-126
Bushnell, G.W., Louie, G.V., Brayer, G.D. High-resolution three-dimensional structure
of horse heart cytochrome c. J.Mol.Biol. v214 pp. 585-595, 1990
Silke Oellerich, Hainer Wackerbarth, Peter Hildebrandt. Conformational equilibria and
dynamics of cytochrome C induced by binding of sodium dodecyl sulfate monomers and
micelles//Eur Biophys Journal (2003) 32. pages 599-613
Ю.А.Владимиров. Свечение, сопровождающее биохимические
реакции//Биология//соровский образовательный журнал,№6,1999, стр25-32)
Ю.А. Владимиров. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как
инструмент в медико-биологических исследованиях //Биология//Соровский
образовательный журнал, том 7 №1, 2001, стр.16-23
31