Опубликовано в журнале «Репродуктивное здоровье в Беларуси

Опубликовано в журнале «Репродуктивное здоровье в Беларуси» - №2. - 2010
Инфекционный фактор, функциональное состояние эндокринной
системы и полиморфизм генов биотрансформации глутатион-Sтрансферазы (GSTТ1 и GSTM1) у детей с «атопической болезнью»
Беляева Л.М., Чакова Н.Н., Микульчик Н.В, Панулина Н.И., Буза Д.В., Крупнова Э.В.,
Михаленко Е.П., Кругленко С.С.
ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования»,
УЗ «4-я городская детская клиническая больница», г.Минск
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»
Рост
аллергической
патологии
прежде
отягощенностью по аллергическим болезням и
всего
связан
с
наследственной
ухудшением экологической среды
обитания человека [1,2,9].
Известно более 5 миллионов химических веществ (атмосферные поллютанты,
пестициды, фармацевтические препараты,
косметика, пищевые добавки
и
др.),
воздействию которых постоянно подвергается человек. Для большинства из них
установлена этиологическая связь с мультифакторными заболеваниями (МФЗ), к которым
относятся и хронические аллергические болезни - бронхиальная астма (БА), атопический
дерматит (АтД), аллергический ринит (АР)
[1,2,5]. Актуальность в связи с этим
приобретает идентификация в различных популяциях специфичных генов и средовых
факторов, взаимодействие которых формирует норму реакции устойчивости человека и
его адаптацию к изменяющейся среде обитания [4,5]. Хронические аллергические
заболевания (АЗ) – это болезни, при которых имеет место дисбаланс Th1/Th2 клеток,
нарушение неспецифического иммунитета, барьерных свойств кожи и слизистых, что
формирует
хроническое
воспаление,
усугубляемое
различными
инфекционными
факторами (вирусами, бактериями и грибами и др.). Взаимодействие между организмом
больного и микроорганизмами (бактериями, грибами и др.) при хронических АЗ может
определяться склонностью к колонизации и сенсбилизацией к этим микроорганизмам
(эффекты мимикрии), в результате чего формируются и другие иммунопатологические
механизмы хронического воспаления (иммунокомплексного, аутоиммунного) [1,2,3,5].
Другим важным фактором, влияющим на течение воспалительных процессов в
целом и хронических аллергических болезней, являются ферменты биотрансформации
ксенобиотиков (ФБК), в частности глутатион-S-трансферазы (GSTТ1 и GSTM1) [12],
осуществляющих метаболизм множества экзогенных (в том числе лекарственных
средств), и медиаторов воспаления. В настоящее время известны функциональнозначимые полиморфные варианты генов GSTT1, GSTM1, представленные обширной
делецией, наличие которой ведет к отсутствию синтеза соответствующих ферментов и
повышает чувствительность организма к неблагоприятным факторам зкзогенной и
эндогенной природы.
Существенное
место
в
патогенезе
аллергических
болезней
отводится
эндокринопатиям и различным видам нарушения обмена веществ [7,8]. О роли
эндокринной системы в патогенезе хронических аллергических заболеваний не
существует однозначного мнения [2, 7, 8]. Есть данные, свидетельствующие о
значительном снижении функциональных возможностей
щитовидной железы у
пациентов с хроническими аллергическими заболеваниями [6].
Цель исследования: определить роль различных факторов, влияющие на
клинические особенности течения сочетанных форм хронических атопических болезней
(БА, АтД, АР) у детей Республики Беларусь.
Материалы и методы исследования: Клинические исследования проводились на
базе Республиканского детского аллергологического центра (УЗ «4-я детская городская
клиническая больница г.Минска»). Обследовано 137 детей в возрасте от 6 до 17 лет
(средний возраст детей - 10,8  0,21 лет), страдающих сочетанными формами атопических
заболеваний (дерматит, ринит, астма). Среди пациентов – 41 девочка (средний возраст –
10,6 + 0,32 года) и 96 мальчиков (средний возраст – 11,1  0,24 года).
Обследованные дети были разделены на две группы: 1-ю группу составили
пациенты с изолированной бронхиальной астмой – 44 пациента (37 – мальчиков, 7 –
девочек, средний возраст – 10,3 + 0,22 года); во 2-ю группу вошли – 93 пациента (59 –
мальчиков, 34 – девочки, средний возраст – 11,06 + 0,43 года) с различными сочетаниями
АЗ: с «атопической триадой» (астма+дерматит+ринит) – 23 пациента (14 - мальчиков, 9 –
девочек); сочетание дерматита и/или ринита и/или дерматита – 70 пациентов (45 мальчиков, 25 - девочек).
Всем детям проведено общеклиническое и аллергологическое обследование,
включающее кожные скарификационные пробы с бытовыми, пищевыми, пыльцевыми и
эпидермальными аллергенами. Изучен генеалогический анамнез, анамнез жизни, анамнез
болезни. В рамках лабораторно-диагностического раздела иммунологическими методами
проведено количественное определение общего и аллергенспецифических IgE в
сыворотке крови.
Молекулярно-генетические исследования проводились на базе ГНУ «Института
генетики и цитологии НАН Беларуси». Выделение тотальной ДНК из лейкоцитов
периферической крови выполняли методом Mathew [10]. Типирование образцов по генам
GSTM1 и GSTT1 проводили путем мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР)
с использованием трех пар праймеров. Продукты амплификации фракционировали в 1,8%
агарозном геле и визуализировали в УФ-свете (рис. 1).
GSTT1
Albumin
GSTМ1
GSTM1
M
1
2
3
4
5
6
Рисунок 1 –Фрагмент результатов мультиплексной ПЦР-амплификации генов
GSTT1 и GSTM1: 1 – GSTТ1(+),GSTМ1(+), 2,3,4,5 – GSTТ1(+),GSTМ1(-),
6 – GSTТ1(-),GSTМ1(+)
Гомозиготы по делеции генов GSTM1 и GSTT1 выявляли на электрофореграммах
по отсутствию фрагментов амплификации размером 215 п.н. и 480 п.н. соответственно. В
качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена альбумина.
Изучение гормонального спектра cыворотки
крови проводили на базе
Центральной научно-исследовательской лаборатории Белорусской медицинской академии
последипломного образования.
Использовали
радиоиммунологический
метод
количественного определения гормонов в сыворотке крови: кортизола (нормальный уровень
для данного метода: 213,0-664,0 нмоль/л), тироксина (Т4) (60,0 – 136,0 нмоль/л),
трийодтиронина (Т3) (0,9 – 2,17 нмоль/л), тироксинсвязывающего глобулина (ТСГ) (0,33 –
0,42 мкмоль/л), тиреотропного гормона (ТТГ) (0,3 – 5,5 мМЕ/л), инсулина (19,2 – 160,0
нмоль/л). Применяли стандартные наборы реактивов Унитарного предприятия «Хозрасчетное
опытное производство Института биоорганической химии Национальной академии наук
Беларуси» (Республика Беларусь). Анализ проводился согласно инструкциям, прилагаемым к
каждому набору реактивов для радиоиммунологического определения гормонов в сыворотке
крови. Проводили также расчет свободного тироксинового индекса (Т4/ТСГ).
Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета
прикладных программ Statsoft Statistica 6.0, «Primer of Biostatistics» (Version 4.03 by
Stanton A. Glantz). При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий
2 Пирсона.
Результаты. В результате проведенного исследования установлено, что 68%
пациентов имели сочетанные формы хронических АЗ (астма+дерматит+ринит – 25%,
астма+ринит – 62%, астма+дерматит – 13%), изолированная бронхиальная астма
диагностирована у 31%.
Получены доказательства
участия генов иммунного ответа в продукции
специфических IgE-антител, генетической детерминированности противовоспалительных
цитокинов, гиперреактивности бронхов и кожи [2, 5, 9]. В результате проведенного нами
исследования установлено, что 56% пациентов имели наследственную отягощенность по
атопическим заболеваниям, среди них у 57% - наследственность отягощена по линии
матери, у 43 % - по линии отца. В группе пациентов с изолированной бронхиальной
астмой у 34 % отмечалась наследственная отягощенность по атопическим болезням (по
линии матери -53%, по линии отца - 47%). При наличии сочетанных форм атопических
болезней (БА, АтД, АР) отягощенная наследственность у 42% выявлена, по линии матери
– у 62%, по линии отца – 38%.
Установлено, что интеркуррентные заболевания оказывают значительное влияние
на течение хронических аллергических заболеваний [1, 5]. В результате проведенного
исследования установлено, что присоединение острых вирусных инфекций у пациентов с
сочетанными формами аллергии сопровождалось одновременным (в 48% случаев) или
изолированным обострением бронхиальной астмы (в 26% случаев) или АтД (у 18%).
Среди бактериальных агентов в развитии и поддержании аллергических заболеваний
важную роль играл Staphyloccocus aureus.
При исследовании флоры зева, носа и кожи у значительной части обследованных
детей (73%) была выявлена персистирующая инфекция: Staphyloccocus aureus (42%),
Staphyloccocus epidermidis (10%), грибы рода Candida (7%), при этом у 12% пациентов с
изолированным АтД и у 23% - с сочетанными формами АЗ выявлялось одновременно по
два возбудителя и более. У 27% пациентов с тяжелыми формами БА и АтД, особенно
длительно получавшим местную терапию глюкокортикостероидами, выявлялись грибы
рода Candida.
Среди обследованных пациентов у 34,5% диагностирована сопутствующая
хроническая патология верхних дыхательных путей (ВДП) (тонзиллит, аденоиды,
синусит), а у 8% хронические неспецифические заболевания легких. Следует отметить,
что значительно чаще хронические заболевания ВДП выявлялись у пациентов из группы с
«атопической триадой»: астма, дерматит и ринит (2 =7,25; Р0,05).
В развитии аллергических заболеваний определяющее значение имеют изменения в
функционировании иммунной системы [2, 3, 9]. Возникновение атопических болезней
связано с IgE-опосредуемыми аллергическими реакциями. При аллергологическом
обследовании детей, страдающих АтД, АР, БА характерно увеличение уровня общего IgE
и специфических IgE-антител к различным группам экзогенных аллергенов [2, 4, 9]. По
результатам исследований иммунологических показателей установлено, что для детей,
страдающих сочетанными формами атопических заболеваний, характерны наиболее
высокие уровни общего IgE в сыворотке крови. В группе пациентов с БА наиболее
высокие концентрации IgE (519,6+23,8) отмечались при наличии у этих пациентов
сопутствующей хронической патологии ВДП (тонзиллит, аденоидит, синусит) (рисунок
2).
800
639,4
519,6
600
сочетанные формы АЗ
380,1 381,2
сочетанные формы АЗ и
сопутствующая патология
400
изолированная БА
200
изолированная БА и сопутствующая
патология
0
IgE общий (IU/ml)
Рисунок 2. – Средние концентрации общего IgE в сыворотке крови у пациентов с хроническими
аллергическими заболеваниями
Анализ зависимости уровня общего IgE от комбинации генотипов GSTT1 и GSTM1 у
пациентов
выявил
следующую
закономерность:
носители
комбинации
GSTT1(+)/GSTM1(+) имели наиболее высокое значение этого показателя, у обладателей
хотя бы одного мутантного гена (комбинации генотипов GSTT1(-)/GSTM1(+) или
GSTT1(+)/GSTM1(-)) уровень общего IgE был снижен, а у пациентов с наличием мутации
в обоих генах (комбинация генотипов GSTT1(-)/GSTM1(-)) наблюдался самый низкий
уровень общего IgE (рисунок 3). Причем это снижение было статистически достоверным
по сравнению с показателями у пациентов других групп (t=2,1; р<0,05).
800
600
679,5
474,5
GSTT1(+)/GSTM1(+)
448,6
400
GSTT1(+)/GSTM1(-)
196,8
GSTT1(-)/GSTM1(+)
GSTT1(-)/GSTM1(-)
200
0
IgE общий(IU/ml)
Рисунок 3. – Средние концентрации общего IgE в сыворотке крови у пациентов с хроническими
аллергическими заболеваниями с различными комбинациями генотипов GSTM1/GSTТ1
Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения
полиморфизма генов, вовлеченных в патогенез АЗ, с целью повышения эффективности
терапии и для выявления генетических маркеров прогноза течения заболевания.
Учитывая, что на функциональное состояние иммунной системы ребенка
значительное влияние оказывает
гормональный статус, особенно щитовидная железа
(ЩЖ), нами изучены уровни тиреоидных гормонов, которые оказывают сложное и
многостороннее влияние на метаболические процессы в организме человека. Функция
гипофизарно-тиреоидной системы определяется уровнем и составом циркулирующих в
сыворотке крови тиреоидных гормонов, которые отражают интенсивность процессов
гормонообразования в ЩЖ и скорость их метаболизма в тканях [6, 7, 8]. Развивающийся
дисбаланс
гормонов
ЩЖ
в
патофизиологических нарушений
сыворотке
при
многих
крови
как
является
составной
острых, так
частью
и хронических
заболеваниях.
По
результатам
проведенного
исследования
функционального
состояния
щитовидной железы выявлено достоверное снижение в сыворотке крови показателей
уровня трийодтиронина (Т3) (сравнение с данными контрольной группы)
у детей с
сочетанными формами хронических аллергических заболеваний (t=4,2;Р<0,01), а также
снижение уровня тироксинсвязывающего глобулина (ТСГ) (Р<0,01) по
сравнению с
данными контроля (таблица 1).
Сравнительный анализ показателей коэффициентов, отражающих состояние
тиреоидзависимых метаболических процессов в организме, выявил у детей с сочетанными
формами аллергических болезней достоверное повышение показателя свободного
тироксинового индекса (СТИ - Т4/ТСГ), используя
который, можно проводить
дифференциальную диагностику эу-, гипо- и гипертироидного состояния.
Таблица 1
Показатели уровней гормонов щитовидной железы в крови у детей с сочетанными
формами хронических аллергических заболеваний (M±m)
Параметры
Пациенты с хроническими
Контроль,
аллергическими болезнями
n=36
(БА+АтД+АР),
n=102
Средний возраст (лет)
11,7  0,3
11,9  0,6
Т3 (нмоль/л)
1,40,03
1,90,1
Т4 (нмоль/л)
66,71,88
66,92,26
ТТГ (мМЕ/л)
2,080,12
1,890,13
ТСГ (мкмоль/л)
0,290,01
0,370,01
Т4/ТСГ
239,511,7
180,822,5
Примечание - * Достоверность различий в сравнении с контролем (P<0,05)
**Достоверность различий в сравнении с контролем (P<0,01)
Полученные данные свидетельствуют о снижении функциональных возможностей
ЩЖ у детей с сочетанными формами хронических аллергических заболеваний.
Установлено также, что дисбаланс содержания в сыворотке крови некоторых гормонов
ЩЖ у этих пациентов не был связан с увеличением объема самой ЩЖ (по данным УЗИ).
Гормональный дисбаланс можно рассматривать в качестве ответной реакции организма
на наличие хронического воспалительного процесса, что подтверждается также данными
литературы [8].
Хроническое течение аллергических болезней,
адаптационных возможностях организма ребенка, а
хроническим характером
их обострения отражаются на
затянувшийся стресс, вызванный
заболевания, в итоге приводит к развитию нарушений
функционального состояния эндокринной системы [2,7]. По результатам проведенного
исследования гормонального спектра у детей с сочетанными формами хронических
аллергических заболеваний установлено, что содержание кортизола и инсулина оказалось
достоверно выше по сравнению с контрольными показателями (t=2,8; Р<0,05) (таблица 2).
Таблица 2
Содержание кортизола и инсулина в сыворотке крови у обследованных детей с
сочетанными формами хронических аллергических заболеваний (M±m)
Параметры
Пациенты с хроническими
Контроль,
аллергическими болезнями, n=102
n=36
Средний возраст (лет)
11,7  0,3
11,9  0,6
Кортизол (нмоль/л)
322,210,6
268,318,3
Инсулин (нмоль/л)
110,47,8
67,919,2
Примечание - * Достоверность различий в сравнении с контролем (P<0,05)
**Достоверность различий в сравнении с контролем (P<0,01).
Таким образом, в качестве объективного доказательства наличия гормональных
нарушений у детей с сочетанными формами хронических аллергических заболеваний
служит увеличение содержания кортизола и инсулина в сыворотке крови.
Выводы:
1. Более чем у половины пациентов с хроническими аллергическими заболеваниями
выявлена наследственная отягощенность по аллергическим заболеваниям. У детей с
сочетанными формами АЗ достоверно чаще отмечалась наследственная отягощенность
по линии матери.
2. Получены данные, свидетельствующие о том, что у детей с сочетанными формами
хронических
аллергических
заболеваний
(особенно
с
«атопической
триадой»:
БА+АР+АтД) наличие хронических очагов инфекции и частое присоединение острых
вирусных инфекций выполняет роль факторов, способствующих затяжному и более
тяжелому течению этих заболеваний. Этот факт следует учитывать при проведении
профилактики и терапии этой категории пациентов.
3. Уровень общего IgE в группах детей с комбинацией генотипов GSTT1(-)GSTM1(-)
достоверно ниже по сравнению с другими группами, что свидетельствует об
опосредованном влиянии генетического полиморфизма глутатион-S-трансферазы на
уровень общего IgE в сыворотке крови у пациентов с атопией.
4. Для детей, страдающих сочетанными формами хронических аллергических
заболеваний характерно увеличение содержания кортизола и инсулина в сыворотке
крови, что в сочетании с изменениями со стороны ЩЖ и иммунной системы
свидетельствует
о
наличии
значительных
нейрогуморальных
и
эндокринных
нарушений.
5. Полученные
данные
углубляют
представления
о
многофакторности
этиологических факторов и полиморфизме патогенетической структуры «атопической
болезни» у детей, что определяет дальнейший поиск методов терапии и профилактики.
Литература:
1. Балаболкин, И.И. Аллергия у детей и экология / И.И.Балаболкин // Рос. педиатр. журн.
– 2002. – № 5. – С. 4 – 8.
2. Беляева Л.М. Атопический дерматит и аллергический ринит у детей и подростков –
Минск: ООО «В.И.З.А.ГРУПП», 2006. – 194с.
3. Беляева
Л.М.
Дифференциально-диагностический
комплекс
клинических,
иммунологических и гормональных признаков у детей школьного возраста,
страдающих атопическим дерматитом / Л.М. Беляева, Н.В. Микульчик // Мед.
панорама. – 2006. – №1. – С. 16–20.
4. Караулов А.В. , Сидоренко И.В., Захаржевская Т.В.
Является ли атопический
дерматит фактором риска развития респираторных проявлений аллергии? //
Иммунология, аллергология, инфектология. – 2003. – №3. – С.37 –40.
5. Сафронова О. Г., Вавилин В. А., Ляпунова А. А. Взаимосвязь между полиморфизмом
гена GSTP1 и бронхиальной астмой и атопическим дерматитом // Бюл. Эксп. Биол.
Мед. – 2003. – Т. 136. - № 1. – С. 73-75.
6. Функциональное состояние щитовидной железы и коры надпочечников у детей с
атопическим дерматитом / Е.А. Цветкова [и др.] // Мед. науч. и уч.-методич. ж-л. –
2001. - №4. – С.95 –99.
7. Adcock, I.M. Molecular mechanisms of glucocorticoid actions / I.M. Adcock // Pulm.
Pharmacol. Ther. – 2000. – Vol.13, № 3. – P.115 – 126.
8. Bames, P.J. Molecular mechanisms of corticosteroids in allergic diseases / P.J. Bames //
Allergy. – 2001. – Vol. 56, № 10. – P. 928 – 936.
9. Edwards A. Mechanism of allergic disease / The Year in Allergy 2003 / eds. S.Holgate,
S.Arshad. – Oxford, 2003. – P. 83 – 100.
10. Mathew, C.C. The isolation of high molecular weight eucaryotic DNA / C.C. Mathew // in
Walker JMNJ (ed): Methods in Molecular Biology, Clifton: Human Press, 1984. – Vol. 2. –
P.31 – 34.
11. Spergel J., Paller A. Atopic dermatitis and the atopic march//J. Allergy. Clin. Immunol.
2003; 112: 128–139.
12. Tamer L., Calikoglu M., Ates N. A. et al. Glutathione S-transferase gene polymorphisms
(GSTT1, GSTM1, GSTP1) as increased risk factors for asthma // Respirology. – 2004. – V.
9. - № 4. – P. 493-498.