Мазуров Дмитрий Олегович РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ, ПРЕДРАСПОЛАГАЮЩИХ К ТРОМБОФИЛИИ, В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ
advertisement
На правах рукописи Мазуров Дмитрий Олегович РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ, ПРЕДРАСПОЛАГАЮЩИХ К ТРОМБОФИЛИИ, В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ 14.01.01 - акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск-2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Екатеринбург, в отделении вспомогательных репродуктивных технологий Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Ковалев Владислав Викторович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Долгушина Валентина Федоровна доктор медицинских наук, профессор Коновалов Вячеслав Иосифович Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится « » марта 2012 года в____часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Автореферат разослан «__» _____________________2012 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Казачкова Элла Алексеевна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы На сегодняшний день в России остро стоит проблема демографического кризиса. Население страны ежегодно неуклонно снижается. Это ведет к уменьшению трудовых ресурсов и способствует развитию социальноэкономических проблем. Если еще в 2003 году численность населения составляла 145,2 млн. человек, то к 2009 году это значение составило уже 141,9 млн. человек (По данным РОССТАТ (www.gks.ru)). Одним из путей решения демографических проблем являются вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), которые применяются для лечения различных форм бесплодия. Основой для этих методов является процедура экстракорпорального оплодотворения преовуляторных фолликулов и перенос дробящихся эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ) (Кулаков В.И., 2005; Кэй Э., 2008). Этот метод применяется при следующих формах бесплодия: трубно-перитонеальное; гормональное; бесплодие, связанное с эндометриозом, синдромом поликистозных яичников; бесплодие неясного генеза, а также при некоторых формах мужского бесплодия (Назаренко Т.А., 2008; Пересада О.А., 2009). Причины бесплодия многообразны и, несомненно, их определение и преодоление является важнейшей задачей для реализации репродуктивного потенциала женщины. По данным РАРЧ (Российской Ассоциации Репродукции Человека) за 2009 год, частота наступления беременности в «свежих» циклах (ЭКО+ИКСИ) в расчете на перенос эмбрионов составила 36,8%, на пункцию фолликулов – 34,0%. Родами (28 недель и более) завершилось 19,3% от общего количества начатых циклов. По отчету ESHRE (European Society of Human Reproduction and Embryology) за 2008 год, во Франции частота наступления беременности составила 23.5% (на пункцию), а частота родов 18,7% (на пункцию), в Германии 24.9% и 18.8% соответственно, в Великобритании 30.7% и 25.5% соответственно. А суммарно в странах Европы, включая Россию, выполнено 283 493 циклов с эффективностью 29% беременностей и 21.5% родов соответственно. Таким образом, реальная эффективность процедуры ЭКО и ПЭ близка к 20% и не имеет тенденции к улучшению. Учитывая сложную экономическую ситуацию в России, сформировавшуюся на фоне демографического кризиса и высокую стоимость методов ВРТ, эффективность лечения бесплодия, достигнутая на сегодняшний день в ведущих клиниках страны, не может в полной мере удовлетворить 4 потребности населения. Именно поэтому вопросы повышения эффективности методов ВРТ сейчас особенно актуальны. Достижения молекулярной генетики, сделанные за последние десятилетия, позволяют по-новому взглянуть на проблему бесплодия и на перспективу его лечения. Особенностью многих полиморфных генов является то, что патологические симптомы возникают при наличии дополнительных «провоцирующих» факторов (гормональная стимуляция в протоколе ЭКО и ПЭ, особенности питания, беременность и т.д.). Выяснение этих дополнительных условий позволяет на ранних этапах применять превентивные терапевтические меры для благополучного наступления и течения беременности и эффективно предотвращать развитие осложнений у носителей вариантных генов. Цель исследования - повышение эффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов путём создания алгоритма обследования, подготовки и отбора пациенток к программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, разработанного на основе изучения роли полиморфизма генов, предрасполагающих к тромбофилии. Задачи исследования 1. Провести клинико-статистический анализ результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов у пациенток исследуемых групп. 2. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов генов системы фолатного цикла (метилентетрагидрофолат-редуктаза (MTHFR C677T), метионинсинтаза-редуктаза (MTRR A66G), метионинсинтетаза (MTR A2756G)) и генов системы гемостаза (V фактора свертывания (FV G1691A) и протромбина (FII G20210A)) у пациенток с бесплодием. 3. Установить ключевые факторы, включая генетические предрасположенности, влияющие на эффективность программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. 4. Разработать решающее правило прогноза исходов программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, на основе которого создать алгоритм обследования и подготовки супружеских пар. Научная новизна Установлены генетические маркёры, наиболее часто встречающиеся у пациенток с бесплодием по отношению к женщинам с сохраненной фертильностью. 5 Определены генетические маркёры системы фолатного цикла и системы гемостаза, наиболее часто встречающиеся у пациенток с неудачами экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, проживающих на территории Свердловской области. Установлена роль этих маркёров в структуре причин неблагоприятных исходов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Разработан способ прогнозирования исходов программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, учитывающий особенности генотипа пациентки. Практическая значимость исследования Выявлены наиболее информативные показатели, влияющие на прогноз лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и на течение беременности, определение которых позволяет снизить процент неудачных попыток экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и повысить эффективность программы в целом. Определены группы риска по неэффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и по неблагоприятному течению беременности, с позиции определения изменений структуры генов. Разработано решающее правило прогноза исхода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, на основе которого создан алгоритм обследования и подготовки женщин к процедуре экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Положения диссертации, выносимые на защиту 1. Наличие мутаций генов, предрасполагающих к тромбофилии, существенно снижает эффективность процедуры экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, и является основой для формирования групп риска по неблагоприятным репродуктивным исходам экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. 2. Учет значимых для репродуктивного исхода мутаций, а так же данных анамнеза и результатов клинико-лабораторных методов исследования существенно повышает точность прогноза исходов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. 3. Использование алгоритма обследования и подготовки пациенток к процедуре экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в сочетании с решающим правилом прогноза исходов экстракорпорального 6 оплодотворения и переноса эмбрионов повышает эффективность преодоления бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в практическую работу отделения вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ «НИИ ОММ» МЗСР РФ (г. Екатеринбург). Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены на I конгрессе акушеровгинекологов Урала с международным участием «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2009), на IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010), на итоговой юбилейной научной сессии кафедры акушерства и гинекологии ФПК ГОУ ВПО УрГМА Росздрава и ФГУ «НИИ ОММ» Минздравсоцразвития России «Успешная репродукция: путь от врача к пациенту» (Екатеринбург, 2010), на Международной научно-практической конференции «От эмбриона к человеку» (Екатеринбург, 2011), на научных чтениях посвященных памяти В.И. Кулакова (Москва, 2011), и на VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012). Публикации По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включая 31 таблицу и 1 рисунок. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 184 литературных источников, в том числе 43 отечественных и 141 иностранных. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа выполнена на базе ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздравсоцразвития России в период с 2008-2011 гг., при участии Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук. Для оценки роли генетической тромбофилии, в эффективности вспомогательных репродуктивных технологий, а именно экстракорпорального 7 оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки, из всех супружеских пар, проходящих лечение бесплодия в отделении вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ «НИИ ОММ» МЗСР РФ, нами были отобраны пары с трубно-перитонеальным генезом бесплодия. Всем пациенткам выполнено клинико-лабораторное обследование, по результатам которого исключены инфекции, передающиеся половым путём, гормональные нарушения и мужской фактор бесплодия. Проведено сравнительное открытое когортное проспективное исследование оценки роли полиморфизма генов, предрасполагающих к тромбофилии, в неэффективных попытках ЭКО и ПЭ. Основную группу составили 145 пациенток. Критериями включения в группу являлись трубно-перитонеальный генез бесплодия, репродуктивный возраст (от 25 до 42 лет) и сохраненный овариальный резерв (уровень ФСГ не более 11,0 мЕд/л). В качестве контрольной группы было отобрано 145 женщин со спонтанно наступившей беременностью, завершившейся рождением живого здорового ребенка. В группу включались только те женщины, которые не имели бесплодия и невынашивания беременности в анамнезе. Общими критериями исключения из групп являлись мужской фактор бесплодия, миома матки (деформирующая полость матки, или размеры узла в диаметре более 3см), тяжелые формы эндометриоза (аденомиоза), поздний репродуктивный возраст (старше 42 лет). Основная и контрольная группы не имели существенных различий по месту жительства, возрасту, частоте и структуре экстрагенитальной патологии. Всем пациенткам основной группы была выполнена программа экстракорпорального оплодотворения, завершившаяся переносом эмбрионов в полость матки. Для выполнения контролируемой овариальной гиперстимуляция (КОГ) применялись короткие протоколы с агонистами гонадотропин релизинг гормона (Бусерелин-спрей назальный, ООО ФармСинтез, Россия) и протоколы с антагнонистами гонадотропин релизинг гормона (Цетротид – 0,25мг, SERONO Europe Ltd, Великобритания). Для стимуляции роста фолликулов применялись мочевые и рекомбинантные гонадотропины: Пурегон (фоллитропин-бета)(производитель Organon, Нидерланды), Гонал-Ф (фоллитропин альфа) (производитель SERONO Europe Ltd, Великобритания) и Менопур (менотропин) (производитель Ferring Gmbh, Германия). В качестве триггера овуляции применялись: Прегнил (гонадотропин хорионический) (производитель Organon, Нидерланды) и 8 Овитрель (хориогонадотропин альфа) (производитель SERONO Europe Ltd, Великобритания). Гонадотропины вводились с 3-го дня менструального цикла в протоколах с агонистами гонадотропин релизинг гормона и со 2-го дня менструального цикла в протоколах с антагонистами гонадотропин релизинг гормона в суточной дозировке: Пурегон – 75-375 МЕ подкожно, Гонал-Ф – 75375МЕ подкожно, Менопур – 75-300МЕ подкожно. Триггер овуляции вводился на 10-13 день цикла, при наличии лидирующего фолликула более 17мм в диаметре и хотя бы 2 фолликулов более 15 мм в диаметре. Используемые дозировки: Прегнил – 10 000 МЕ внутримышечно, Овитрель – 6500МЕ подкожно. Введение препарата ХГ осуществлялось за 36 часов до предполагаемой пункции. Аспирацию ооцитов и фолликулярной жидкости выполняли через 36 часов после введения овуляторной дозы ХГ раздельно из правого и левого яичника. С целью получения ооцитов и фолликулярной жидкости из фолликулов яичников производили трансвагинальную пункцию с помощью влагалищного пункционного датчика ультразвукового аппарата B-K Medical Sandtoften 9. Для переноса эмбрионов использовали одноразовые катетеры фирмы COOK MEDICAL INC. (США). Для работы с эмбриологическим материалом использовались среды MediCult (Дания). Перенос эмбрионов производился на 3-5 сутки после трансвагинальной пункции фолликулов. Через 14 дней после переноса эмбрионов у пациенток определялся уровень ХГ в крови, а через 21 день после переноса выполнялось УЗИ. Обследование супружеских пар проводилось по единой схеме, включавшей: соматический, акушерско-гинекологический анамнез, клиниколабораторное обследование, УЗИ на базе лабораторий ФГБУ «НИИ ОММ» МЗСР РФ, консультирование терапевтом, по показаниям – эндокринологом, маммологом, андрологом. Предварительное обследование супружеских пар соответствовало приказу №67 МЗРФ «О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия» и было дополнено исследованием генетических полиморфизмов (MTHFR, MTR, MTRR, FV, FII) и определением уровня гомоцистеина в плазме. Для определения различных вариантов генов использовали набор реагентов и протокол для выделения ДНК из различного биологического материала фирмы НПО "ДНК-Технология" (Россия) – «Проба-Рапид». Полученный материал подвергали ПЦР-амплификации в режиме "реального 9 времени" с использованием комплектов реагентов и протоколов фирмы НПО "ДНК-Технология" (Россия). Детекция результатов осуществляли на приборе ДТ-96, производства НПО "ДНК-Технология". Анализ результатов ПЦР обеспечивается программным обеспечением прибора ДТ-96. Определение уровня гомоцистеина в плазме выполнялось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартных тест-систем Axis EIA AXH00001, согласно инструкции производителя. Определение уровня гомоцистина было выполнено на 80 образцах плазмы (36 из группы контроля и 44 из основной группы, отобранных в случайном порядке). Статистическую обработку материала проводили на IBM PC с использованием программ Microsoft Exel 2007 для Windows 7 и Statistica 6,0. Полученные результаты обработаны методом вариационной статистики. Для построения модели прогноза использовали метод дискриминантного анализа с пакетом прикладных программ Statgraphics. Достоверность различий средних величин вычисляли по методу Стьюдента и точному критерию Фишера, а достоверным считали различие при уровне значимости p < 0,05. Для оценки относительного риска неудачи программы ЭКО и ПЭ рассчитывали отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI - 95%). Результаты исследования и их обсуждение В основной группе пациенток 38,2% (56) не имели беременностей в анамнезе, 61,8% (89) страдали вторичным бесплодием, 27,6% (40) уже имели попытки ЭКО и ПЭ в анамнезе, причем 9,7% (14) шли на 2-ой и более протокол ЭКО и ПЭ. По всем характеристикам акушерского анамнеза имеются значительные различия между группами. Лишь у 12,4% (14 пациенток) из основной группы были беременности, завершившиеся родами. Обращает на себя внимание крайне высокая, по сравнению с контрольной группой, доля медицинских прерываний беременности (30,3% против 14,5%, р<0,001), невынашивания беременности (14,5% против 0%, р<0,001), эктопических беременностей в анамнезе (33,1% против 1,4%, р<0,001). Так же было установлено, что в группе пациенток с бесплодием, по сравнению с контрольной группой, достоверно чаще встречается миома матки (21,4% и 5,5% соотсветственно, р=<0,001), эндометриоз (15,2% и 6,9% соответственно, р=0,012), заболевания передающиеся половым путем в анамнезе (50,3 и 26,9% соответственно, р=<0,001). Полученные данные 10 подтверждают, что этим заболеваниям отведена значительная роль в структуре причин бесплодия. Так же обращало на себя внимание то, что доля оперативных вмешательств была значительно выше в группе пациенток с бесплодием. Это является вполне закономерным следствием того, что в данной группе пациенток высока распространенность гинекологических заболеваний, которые в том числе приводят к неблагоприятным репродуктивным исходам (ОАА) и бесплодию, и требуют в последующем оперативных методов лечения для восстановления фертильности у женщин. Таким образом, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез является характерной чертой пациенток, которым для преодоления бесплодия необходимы методы ВРТ. Результаты тестирования на генетические мутации показали, что в группе женщин, проходящих лечение методом ЭКО и ПЭ (основная группа), частота встречаемости полиморфного аллеля 677Т в гене MTHFR значительно выше, чем в группе контроля и составляет 30,3% против 18,6% (р=0,0004, OR-1,90 (1,29-2,80)). Полиморфный аллель 2756G гена MTR, напротив, чаще встречался в группе контроля (23,4% и 16,6% соответственно, р=0,018, OR0,65 (0,43-0,98)). При анализе частоты встречаемости полиморфного аллеля 66G гена MTRR, достоверных различий между группами не выявлено. Отмечается некоторое увеличение частоты встречаемости полиморфного аллеля 1691А гена FV и полиморфного аллеля 20210А гена FII в основной группе пациенток, по сравнению с группой контроля. Отсутствие достоверного уровня значимости отличий может быть обусловлено низкой распространенностью этих аллелей в популяции, а так же размерами выборки. Поскольку ферменты фолатного цикла задействованы в одном каскаде, высока вероятность наличия межгенных взаимодействий генов этих ферментов. Для проверки этого предположения мы проанализировали различные сочетания полиморфных аллелей. В результате было установлено, что сочетание аллеля 677Т (гена MTHFR) с аллелем 66G (гена MTRR) значительно чаще встречается в группе женщин с бесплодием (42,9%), по сравнению с группой контроля (29,2%). Разница является достоверной (р=0,08, OR-1,54 (1,0-2,38)). Анализ частот распределения вариантов генотипов показал, что генотипы, содержащие аллель 677Т (С/Т, Т/Т) достоверно чаще встречались в основной группе женщин. Генотип С/Т был выявлен у 44,1% пациенток основной группы и 33,3% группы контроля (р=0,039, ОR – 1,60 (0,99-2,57)), а генотип 11 Т/Т у 8,3% и 2,1% соответственно (р=0,012, OR - 4,27 (1,18-15,47)). Суммарно генотипы С/Т+Т/Т были выявлены у 52,4% пациенток с бесплодием и 35,7% группы контроля (р=0,03, OR -2,03 (1,27-3,25)). При сравнении частоты встречаемости различных вариантов генотипов MTRR A66G, FV G1691A и FII G20210A достоверных различий между группами не выявлено. Так же в группе пациенток с бесплодием мы наблюдали увеличение доли следующих комбинаций генотипов: MTHFR 677С/T + MTR 2756А/A + MTR66А/G (15,8% / 8,3%, р=0,025, OR - 2,08 (0,99-4,39)) и MTHFR 677T/T + MTR 2756А/A + MTRR 66А/G (2.9% / 0, p=0,020). Общей особенностью этих сочетаний является то, что они содержат полиморфный вариант гена MTHFR и MTRR. Таким образом, было показано, что значимой в плане формирования бесплодия мутацией является полиморфизм гена MTHFR С677Т, а так же сочетание данного полиморфизма с полиморфным вариантом гена MTRR A66G. Поскольку оба гена задействованы в фолатном цикле, а основным механизмом реализации данных мутаций является нарушение работы ферментов, ведущее к повышению уровня гомоцистеина, мы так же проанализировали этот показатель в исследуемых группах. В результате было установлено, что в группе пациенток с бесплодием средний уровень гомоцистеина достоверно выше, чем в группе контроля (15,530,75мкмоль/л и 11,290,49мкмоль/л соответственно, р<0,001). Кроме этого, доля пациенток с повышенным уровнем гомоцистеина (повышенным считали уровень гомоцистеина более 15 мкмоль/л) так же была достоверно выше в основной группе женщин (40,9% и 13,9% соответственно, р=0,004, OR – 4,29 (1,4013,15)). Это является подтверждением того, что мутации генов фолатного цикла могут приводить к повышению уровня гомоцистеина, который, в свою очередь, является фактором, снижающим фертильность. Всем пациенткам из основной группы (n=145) была выполнена процедура экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки. В результате беременность наступила у 59 пациенток, что составляет 40.7%. Из 59 забеременевших пациенток только у 47 (32,4% от основной группы) наступившая беременность завершилась родами (28 недель и более). У оставшихся 12 пациенток (8,3% от основной группы) произошло прерывание беременности. В результате выполненной процедуры ЭКО и ПЭ было сформировано дополнительно 3 группы женщин: 12 1 группу составили 47 женщин, у которых в результате ЭКО и ПЭ наступила беременность, завершившаяся родами. 2 группу составили 86 женщин, у которых в результате ЭКО и ПЭ беременность не наступила. 3 группу составили 12 женщин, у которых беременность, наступившая в результате ЭКО и ПЭ, осложнилась выкидышем или регрессом. Клинико-статистический анализ сравниваемых групп показал, что в 1-ой группе пациенток, частота встречаемости более высоких значений уровня ФСГ была достоверно ниже (6,8%), чем в 3-ей (25,0%) (р=0,037) и, соответственно, достоверно ниже, чем во 2-ой группе (17,6%)(р=0,047). Так же, вполне закономерно, умеренное снижение овариального резерва (как и в случае с уровнем ФСГ) достоверно чаще встречалось в 3-ей (41,7%, р=0,022) и во 2-ой (39,5%, р=0,02) группах женщин по сравнению с 1-ой группой (15,2%). Оценка параметров проводимых протоколов стимуляции показала, что средняя толщина эндометрия (М-ЭХО) на момент переноса эмбрионов достоверно отличалась в 1-ой и 2-ой группах и составляла 10,230,15 мм и 9,730,18 мм соответственно (р=0,03). Количество полученных эмбрионов достоверно было выше в 1-ой группе пациенток по сравнению со 2-ой группой и составляло 6,580,63 и 5,260,36 соответственно (р=0,025). При анализе акушерского и гинекологического анамнеза мы выявили, что вторичное бесплодие встречалось достоверно чаще во 2-ой группе (67,1%) пациенток по сравнению с 1-ой группой (51,1%)(р=0,036). Частота маточной беременности в анамнезе достоверно выше была в 3-ей группе пациенток и составляла 66,7% против 34,0%(р=0,02). В 3-ей группе аборты были у 41.7% пациенток против 17% из 1-ой группы (р=0,034). Во 2-ой группе эта цифра составила соответственно 30,2% против 17% из 1-ой группы (р=0,048). Частота встречаемости в анамнезе заболеваний, передающихся половым путем (хламидиоз, уреоплазмоз, микоплазмоз), достоверно выше была во 2-ой группе женщин (55,8%), по сравнению с 1-ой группой (38,3%)(р=0,027). Синдром поликистозных яичников достоверно чаще встречался в 3-ей группе пациенток (33,3%) по сравнению с 1-ой группой (4,3%)(р=0.001). Консервативная миомэктомия достоверно чаще выполнялась в группе женщин с невынашиванием беременности (25,0%) чем в 1-ой группе (6,5%)(р=0,031). А операции по удалению маточных труб (по поводу гидросальпингса, сактосальпингса или трубной беременности) достоверно чаще выполнялись в группе «незабеременевших» пациенток (60,5%), по сравнению с группой родивших (44.7%)(р=0.041). 13 При оценке частот распределения полиморфных вариантов исследуемых генов, на первом этапе представлялось целесообразным провести сравнительный анализ между группой пациенток, родивших в результате ЭКО и ПЭ и контрольной группой. Основной задачей данного сравнения являлось определить, есть ли существенные различия в распределении генов между женщинами со спонтанно наступившей беременностью и женщинами, забеременевшими в результате ЭКО и ПЭ. Значимых различий, как по частоте полиморфных аллелей, так и по частоте различных вариантов генотипов мы не выявили. Это позволяет предположить, что женщины, забеременевшие спонтанно и в результате ЭКО и ПЭ не имеют существенных отличий в геноме, т.е. причины бесплодия в группе пациенток, родивших в результате ЭКО и ПЭ, не связаны с генетическими мутациями. Основываясь на данном предположении, с целью большей информативности, в дальнейшем мы сравнивали особенности распределения генетических мутаций у пациенток с неблагоприятным исходом ЭКО и ПЭ как с 1-ой группой пациенток (родившие после ЭКО и ПЭ), так и с контрольной группой. Распределение полиморфных аллелей генов фолатного обмена у пациенток исследуемых групп представлено на рисунке 1. Частота встречаемости аллеля (в %) 60 1 Группа (роды) 54.6 52.1 2 группа (неудача ЭКО) 3 группа (выкидыши) Контроль 50 50.0 50.0 *34.3 ** 40 29.3 30 * 23.4 20 ** 18.6 **23.5 * 19.2 ** 16.3 * 8.3 10 0 MTHFR 677Т p=0,030 (<0,001) р=0.287(0.097) MTR 2756G p=0,289 (0,030) р=0.124(0.036) MTRR 66G p=0,347 (0.183) р=0.426(0.197) Рис.1. Распределение полиморфных аллелей генов фолатного обмена у пациенток исследуемых групп 14 Обращает на себя внимание, что полиморфный аллель 677T гена MTHFR значительно больше был распространен в группе пациенток, у которых в результате ЭКО и ПЭ беременность не наступила. Частота встречаемости аллеля 677Т составила 23,4% в группе пациенток, родивших после ЭКО и ПЭ, 34,3% в группе незабеременевших пациенток (р=0,30; OR - 1,71 (0,96-3,03)) и 18,6% в группе контроля (р=<0,001). В группе пациенток с невынашиванием беременности (3-я группа) так же отмечается тенденция к увеличению частоты встречаемости полиморфного аллеля 677Т, но различия не достоверны. Аллель MTR 2756G, напротив, чаще встречался в группе «родивших» пациенток и в группе контроля, чем в группах пациенток с неблагоприятными исходами ЭКО и ПЭ (неудачи, выкидыши). При этом разница с 1-ой группой не достигла критериев достоверности. А вот разница с группой контроля была достоверной (р2/К=0,030, OR - 0,82 (0,43-1,58); р3/К=0,036, OR – 0,38 (0,08-1,78)). Распространенность аллеля MTR 2756G составила соответственно 23,5% в группе контроля против 16,3% в группе пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ и 8,3% в группе с невынашиванием беременности. По распространенности аллеля 66G гена MTRR, значимых различий между группами не выявлено. Распределение полиморфных аллелей генов системы гемостаза представлено на рисунке 2. 1 Группа (роды) 2 группа (неудачи ЭКО) 3 группа (выкидыши) Контроль Частота встречаемости аллеля (в %) 6 5 * 4.2 4 4.2 3.5 2.9 3 2 1.1 * 1.0 1.4 1.1 1 0 FV 1691A p=0.149 (0.047) р=0.149(0.094) FII 20210А p=0.202(0.149) р=0.149(0.147) Рис.2. Распределение полиморфных аллелей генов системы гемостаза у пациенток исследуемых групп 15 Из представленных данных видно, что частота встречаемости полиморфного аллеля FV 1691A так же была достоверно выше в группе пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ. Разница с группой «родивших» пациенток не достигла критериев достоверности. Разница с группой контроля была достоверной и составила 3,49% против 1,0% соответственно (р=0,047; OR 3,36 (0,40-28,35)). При анализе частоты встречаемости полиморфного аллеля MTRR 66G достоверных различий между группами выявлено не было. Отмечалась некоторая тенденция к увеличению частоты встречаемости полиморфного аллеля FII 20210A в группе пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ, но различия между группами не достигли критериев достоверности. Так же определялась тенденция к увеличению частоты встречаемости полиморфных аллелей FV 1691A и FII 20210A у пациенток с невынашиванием беременности, но статистически разница была не значима. При сравнении частот различных вариантов носительства исследуемых полиморфизмов мы видим, что отмечается увеличение доли генотипов, содержащих полиморфный аллель 677Т гена MTHFR в группе пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ. Гетерозиготная мутация гена MTHFR (генотип 677С/Т) была выявлена у 50% пациенток в группе с неудачными попытками ЭКО и ПЭ и 34% пациенток, родивших после ЭКО и ПЭ (р=0,039, OR - 1,94(0,93-4,05)). Частота встречаемости этой мутации в группе контроля составила 33,1% (р<0,001). Частота встречаемости гомозиготной мутации (генотип 677 Т/Т) так же была значительно выше в группе пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ. При этом различия по сравнению с группой пациенток, родивших после ЭКО и ПЭ, не достигли критериев достоверности. А различия с группой контроля были достоверны (р=0,006, OR - 1,50(0,385,96)). Доля такой мутации в группе контроля составила 2,1% против 9,3% в группе с неудачами ЭКО и ПЭ. Так же суммарная доля генотипов, содержащих полиморфный аллель 677Т (677С/Т+677Т/Т) во 2-ой группе пациенток (неудачи ЭКО и ПЭ) была выше и составляла 59,3% против 40,4% в 1-ой группе (р=0,019, OR - 2,15(1,04-4,43)) и 35,7% в группе контроля (р<0,001). Кроме этого отмечается увеличение доли генотипов содержащих полиморфный аллель 1691A гена FV G1691A в группе пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ. Но по частоте встречаемости гетерозиготной формы мутации (генотип 1692G/A), достоверных различий между группами не получено. Гомозиготная форма мутации (генотип 1691A/A) так же чаще встречалась в группе пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ и доля такого генотипа составила 2,3% . В группе пациенток, родивших после ЭКО и ПЭ, и в группе контроля 16 такая форма мутации вообще не встречалась. При этом различия с группой контроля были достоверны (р=0,033). При анализе частот распределения генотипов, содержащих полиморфные аллели 2756G гена MTR и 66G гена MTRR, мы не выявили значимых различий между пациентками исследуемых групп. Данные по достоверно значимым различиям сочетаний аллелей и генотипов в группе пациенток с неудачной попыткой ЭКО и ПЭ представлены на рисунке 3. 29.2 * 677T+66G p=0.049 (0.002) 48.2 33.3 8,3 677C/T+2756A/A+66A/G p=0.326(0.037) ** * ** * 16.0 ** 13 Контроль 0.0 * 677T/T+2756A/A+66A/G p=0.319 (0.010) 2 группа (неудача ЭКО) 3.7 * 2.2 0 1 Группа (роды) 10 20 30 40 50 Частота встречаемости сочетания (%) Рис. 3. Распределение комбинаций аллелей и генотипов у пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ Частота встречаемости комбинации аллеля 677Т гена MTHFR c аллелем 66G гена MTRR значительно выше в группе пациенток, с неудачами ЭКО и ПЭ. Доля этого сочетания в сравнении с группой пациенток, родивших после ЭКО и ПЭ составила соответственно 48,2% и 33,3% (р=0,049; OR -1,86(0,873,96)). По сравнению с группой контроля разница составила 48,2% против 29,2% (р=0,002). Это подтверждает предположение о возможном межгенном взаимодействии этих двух аллелй (677Т+66G), а так же о важной роли аллеля 677Т как изолированно, так и в комбинации с аллелем 66G в генезе неудач ЭКО и ПЭ. При анализе комбинаций генотипов мы наблюдали ту же тенденцию. Сочетание генотипов 677С/T + 2756А/A + 66А/G, в группе контроля и в 1-ой группе встречалось реже, чем во 2-ой группе. Доля такой комбинации во 2-ой группе составила 16,0% против 13,0% в 1-ой группе и 8,3% в контрольной группе. Достоверной была разница только с группой контроля (р=0,037, OR -1,27(0,45-3,62)). Так же сочетание генотипов 677T/T + 2756А/A + 66А/G в группе пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ (2-я группа) 17 встречалось чаще, чем в группах сравнения. Распространенность такой комбинации во 2-ой группе составила 3,7%, в 1-ой группе 2,2%, а в группе контроля такое сочетание не встречалось. По сравнению с группой контроля разница достоверна (р=0,010, OR - 1,73 (0,17-17,1)). Данные по достоверно значимым различиям сочетаний аллелей и генотипов в группе пациенток с потерей беременности после ЭКО и ПЭ представлены на рисунке 4. 8,3 * 677C/T+2756A/A+66A/G p=0.158 (0.029) 25.0 * 13.0 0 677T/T+2756A/A+66A/A p=0.307 (<0.001) * 8.3 Контроль 3 группа (выкидыш) 1 Группа (роды) * 2.2 0 5 10 15 20 25 30 35 Частота встречаемости аллеля (%) Рис.4. Распределение комбинаций аллелей и генотипов у пациенток с невынашиванием беременности после ЭКО и ПЭ Обращает на себя внимание достоверное по отношению к группе контроля увеличение доли сочетания генотипов 677С/T + 2756А/A + 66А/G (р=0,029, OR - 2,22(0,47-10,61)) и 677Т/T + 2756А/A + 66А/А (р<0,001, OR – 4,09(0,2470,66)). При оценке количественного состава полиморфных аллелей значимых различий между группами мы не получили. Таким образом, в результате выполненного анализа были определены генетические полиморфизмы и их сочетания, ассоциированные со снижением эффективности программы ЭКО и ПЭ. Генетические маркеры, предрасполагающие к неудаче ЭКО и ПЭ, представлены в таблице 1. Таблица 1 Генетические маркеры, предрасполагающие к неудаче ЭКО и ПЭ Генетический маркер Аллель MTHFR 677T Аллель FV 1691A Генотип MTHFR 677C/T Генотип MTHFR 677T/T Сочетание аллелей 677T+66G Комб. генотипов 677C/T+2756A/A+66A/G Комб. генотипов 677T/T+2756А/A+66А/G OR CI-95% (ORmin-ORmax) 1,71 (0,96-3,03) 3,36 (0,40-28,35) 1,94(0,93-4,05) 1,50(0,38-5,96) 1,86(0,87-3,96) 1,27(0,45-3,62) 1,73(0,17-17,1) 18 В результате статистической обработки данных с применением метода дискриминантного анализа были определены наиболее информативные показатели, прогнозирующие исход планируемой программы ЭКО и ПЭ (таблица 2). Таблица 2 Решающие параметры прогноза ЭКО и ПЭ. Показатели Возраст (М m) Сниженный ов.резерв, Абс (%). ИППП в ан-зе, Абс (%) Удаление труб (трубы) в ан-зе, Абс(%) Маточная бер-ть в ан-зе, Абс (%) Аллель 677Т гена MTHFR 1 группа (роды) N=47 31,458 0,55 7 (15,2%) 2 группа (неудачи ЭКО) N=86 33,409 0,41 34 (39,5%) р 18 (38,3%) 48 (55,8%) 0,002 0,027 21 (44,7%) 21 (47,1%) 22 (23,4%) 52 (60,5%) 57 (67,1%) 59 (34,3%) 0,041 0,036 0,030 0,003 На основе выявленных закономерностей разработан способ прогнозирования исхода программы ЭКО и ПЭ. Сущность способа заключается в определении прогностического индекса Р по формуле: P=0,06×X1+0.58×X2+0.66×X3-1.12×X4+1.1×X5-1.0×X6 -2.31, где X1- возраст (полных лет). X2- репродуктивно значимые инфекции в анамнезе (если было – 1, если не было - 0). X3 – удаление одной или обеих маточных труб в анамнезе (если было – 1, если не было - 0). X4- мед. аборт в анамнезе (если был – 1, если не было - 0). X5- снижение овариального резерва (по данным УЗИ) (если есть – 1, если нет - 0). X6- наличие полиморфного аллеля MTFHR 677T (если есть – 1, если нет 0). Const = - 2.31 Необходимо отметить, что показатели X1, X2, X3, X4 – определяются при сборе данных анамнеза. Показатель Х5 (снижение овариального резерва) определяют на основании гинекологического УЗИ, выполненного на 2-ой день менструального цикла. Если объем самого крупного яичника менее 5см³ и (или) кол-во антральных фолликулов менее 5 (в 2-ух яичниках) или 3 (в 19 единственном яичнике), то такую ситуацию расценивают, как снижение овариального резерва. Показатель Х6 (мутация гена MTHFR) определяется методом ПЦР на образцах ДНК, полученных из буккального эпителии. Все полученные данные подставляются в формулу, и рассчитывается значение прогностического индекса Р. Если P<-0.21, то прогноз благоприятный, Если P>0.11, то прогноз неблагоприятный, Если -0,21<P<0.11, то прогноз неопределённый. Чувствительность решающего правила 81%. Специфичность 70%. Эффективность 75%. Для практического применения решающего правила прогноза нами разработан алгоритм ведения пациенток, проходящих терапию бесплодия методами ВРТ. Необходимо отметить, что данный алгоритм применим для пациенток с сохраненным или умеренно сниженным овариальным резервом. Тактика ведения пациенток при различных вариантах прогноза: 1. Прогноз «благоприятный». При условии, что у пациентки не более 2-ух попыток ЭКО и ПЭ в анамнезе, ей показано стандартное обследование в соответствии с приказом №67 МЗРФ и начало протокола ЭКО и ПЭ. При наличии более 2-ух попыток ЭКО и ПЭ в анамнезе, пациентке показано обследование и подготовка к программе ЭКО и ПЭ в соответствии с алгоритмом для «неблагоприятного» прогноза. 2. Прогноз «неблагоприятный». В данном случае мы рекомендуем расширить минимальный объем обследований перед началом протокола ЭКО и ПЭ. В этой группе пациенток необходимо выполнить тестирование на наличие генетических полиморфизмов, ассоциированных со снижением эффективности программы ЭКО и ПЭ (MTHFR, MTR, FII, FV). В случае выявления генетических мутаций в гене MTHFR С677Т как изолированно, так и в сочетании с мутацией гена MTR A66G, необходимым является определение уровня гомоцистеина. При высоких значениях уровня гомоцистеина (более 15,0 мкмоль/л) необходима соответствующая коррекция в соответствии с принятыми стандартами. При нормализации уровня гомоцистеина возможно проведение программы ЭКО и ПЭ. 20 В случае выявления генетических дефектов в генах FII и FV необходимым является 4-ех кратный контроль системы гемостаза (коагулограмма, тромбоэластограмма): до начала стимуляции; на 7-10 сутки гормональной стимуляции; перед переносом эмбрионов; на 5-6 сутки после переноса эмбрионов. При выявлении признаков гиперкоагуляции, необходимым является консультирование пациентки у гемостазиолога и подбор адекватной антикоагулянтной терапии. При положительном тесте ХГЧ, необходим дополнительный контроль системы гемостаза для решения вопроса о пролонгировании антикоагулянтной терапии. У пациенток с «неблагоприятным прогнозом» так же важным этапом является выполнение гистероскопии (версоскопии) с гистологическим исследованием эндометрия (иммуногистохимическим). При выявлении синехий в полости матки, гиперпластических или воспалительных процессов, необходимым является соответствующая коррекция в соответствии с имеющимися на сегодняшний день стандартами. Так же на этапе подготовки к ЭКО и ПЭ целесообразна оценка гормонального статуса (ФСГ, ЛГ, ТТГ, E2, пролактин, тестостерон) и консультирование пациентки у эндокринолога с целью коррекции гормональных нарушений. Кроме этого, важным является определение уровня Антимюллерова гормона и В-ингибина с целью уточнения состояния овариального резерва и выбора метода ВРТ и протокола стимуляции. В данной группе пациенток выполнение более 3-ех попыток ЭКО и ПЭ, как правило, не целесообразно. Важным является своевременно рекомендовать пациентке альтернативные методы: донорство ооцитов, суррогатное материнство, усыновление ребенка. 3. Прогноз «неопределенный». При условии сохраненного овариального резерва и отсутствии попыток ЭКО и ПЭ в анамнезе, а так же возрасте до 36 лет, возможно ведение пациентки в соответствии с алгоритмом «благоприятного» прогноза, т.е. стандартное обследование (приказ №67 МЗРФ) и начало программы ЭКО и ПЭ. При несоблюдении любого из вышеуказанных условий, необходимо вести пациентку в соответствии с алгоритмом «неблагоприятного» прогноза. Схематически алгоритм ведения пациенток представлен на рисунке 5. Рисунок 5 21 Прогноз благоприятный 3 и более попытки ЭКО Прогноз неопределенный 1 или 2 попытки ЭКО. Ведение пациентки в соответствии с алгоритмом для неблагоприятного прогноза, но не более 3-ех попыток ЭКО. Возраст до 36 лет. Сохраненный овариальный резерв. 1-я попытка ЭКО Стандартное обследование в соответствии с приказом №67 МЗРФ. Этиотропная подготовка к ЭКО и ПЭ. НЕУДАЧА ЭКО 2-я и более попытка ЭКО. Сниженный овариальный резерв. Возраст старше 36 лет. Прогноз неблагоприятный 1,2,3 попытки ЭКО и ПЭ. 1. Стандартное обследование в соответствии с приказом №67 МЗРФ. 2. Генетическое тестирование на мутации предраспологающие к тромбофилии. 3. Определение гомоцистеина. 3. Развернутая коагулограмма (ТЭГ) до начала протокола ЭКО и ПЭ, на 710 сутки гормональной стимуляции и перед переносом эмбрионов. 4. Гистероскопия (биопсия эндометрия). 5. Гормоны крови (АМГ, В-ингибин.) ВЫПОЛНЕНИЕ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ 4-я и более попытка ЭКО 1. Донорство ооцитов. 2. Суррогатное материнство. 3. Усыновление ребенка. РОЖДЕНИЕ РЕБЕНКА 22 ВЫВОДЫ 1. Снижение овариального резерва, искусственное хирургическое прерывание беременности, репродуктивно значимые инфекции, удаление трубы (труб) в анамнезе ассоциировано со снижением эффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Синдром поликистозных яичников и (или) консервативная миомэктомия, а так же невынашивание беременности в анамнезе ассоциировано с повышением риска прерывания беременности, наступившей в результате экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. 2. Наличие мутации гена метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR С677Т), как изолированно, так и в сочетании с мутацией гена метионинсинтазы-редуктазы (MTRR A66G) ассоциировано со снижением фертильности пациенток как при естественном зачатии, так и в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Наличие мутации гена V фактора свертывания (FV G1691A) ассоциировано со снижением эффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Определена тенденция к снижению эффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов у пациенток с мутацией гена протромбина (FII G20210А). 3. Наличие гомозиготной формы мутации гена метилентетрагидрофолатредуктазы (генотип MTHFR 677Т/Т), а также наличие гетерозиготной формы данной мутации (генотип MTHFR 677С/Т) в сочетании с гетерозиготной формой мутации гена метионинсинтазы-редуктазы (генотип MTRR 66А/G) ассоциировано с увеличением риска невынашивания беременности, наступившей в результате программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Определена тенденция к увеличению риска потери беременности у пациенток - носителей гетерозиготных форм мутаций гена V фактора свертывания (генотип FV 1691G/A) и гена протромбина (генотип FII 20210G/A). 4. Оригинальное решающее правило прогноза позволяет формировать группы риска по неблагоприятному исходу программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и производить отбор пациентов, потенциально перспективных для преодоления бесплодия методами вспомогательной репродукции. Разработанный на его основе алгоритм дает возможность выполнять необходимую и обоснованную диагностику патологических состояний, с целью проведения адекватной подготовки к 23 программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов для повышения вероятности наступления беременности. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Рекомендуется использовать решающее правило прогноза для формирования групп риска по неблагоприятному исходу программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и отбора пациентов, перспективных для преодоления бесплодия методами вспомогательной репродукции. 2. С целью определения тактики обследования и подготовки пациенток группы высокого риска к программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, рекомендуется использовать предложенный алгоритм ведения, основанный на решающем правиле прогноза. 3. Рекомендуется проводить тестирование пациенток из группы риска по неблагоприятному исходу экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов на наличие значимых для репродуктивного исхода мутаций (гена метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR С677Т), метионинсинтазыредуктазы (MTRR А66G), V фактора свертывания (FV G1691A), протромбина (FII G20210А), с последующей подготовкой пациенток к процедуре экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, включающей комплекс превентивных мер, направленных на профилактику реализации нежелательных эффектов полиморфных генов в соответствии с предложенным алгоритмом. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Мазуров, Д.О. Роль полиморфизма генов системы фолатного цикла в реализации программы ЭКО и ПЭ. /Д.О. Мазуров, В.В. Ковалев// Вестник уральской академической медицинской науки.-2009.-№4(27).С.38-41. 2. Мазуров, Д.О. Роль полиморфизма С677Т гена фолатного цикла MTHFR в реализации программы ЭКО. /Д.О. Мазуров, В.В. Ковалев// «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребёнка»: Материалы I конгресса акушеров-гинекологов Урала с международным участием.- Екатеринбург, 2009 - С.52. 24 3. Сударикова, Е.Г. Исследование микробиоциноза влагалища у пациенток в программе экстракорпорального оплодотворения /Е.Г. Сударикова, Д.О. Мазуров, Т.Е. Бызова// «Высокотехнологичные виды медицинской помощи на службе охраны здоровья матери и ребёнка»: Материалы I конгресса акушеров-гинекологов Урала с международным участием.- Екатеринбург, 2009 - С.74. 4. Мазуров, Д.О. Роль мужского фактора в программах экстракорпорального оплодотворения /Д.О. Мазуров, Е.Г. Сударикова, Т.Е. Бызова, Л.Д. Шейко// «Мать и дитя»: Материалы X юбилейного Всероссийского научного форума.- Москва, 2009. - С. 448-449. 5. Мазуров, Д.О. Роль полиморфизма генов фолатного цикла в реализации программы ЭКО и ПЭ /Д.О. Мазуров, В.В. Ковалев// «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». Материалы XX ежегодной международной конференции РАРЧ.- Нижний Новгород, 2010. - С.24. 6. Мазуров, Д.О. Оценка роли полиморфизма некоторых генов фолатного цикла в эффективности ВРТ /Д.О. Мазуров, В.В. Ковалев// «Успешная репродукция: путь от врача к пациенту»: Материалы итоговой юбилейной научной сессии кафедры акушерства и гинекологии ФПК ГОУ ВПО УрГМА Росздрава и ФГУ «НИИ ОММ» Минздравсоцразвития России.Екатеринбург, 2010 – С.102-103. 7. Мазуров, Д.О. Ассоциация полиморфных аллелей генов фолатного обмена с неудачами ЭКО и ПЭ /Д.О. Мазуров, В.В. Ковалев// Уральский медицинский журнал.-2011.-№12(90).-С.14-19. Мазуров Дмитрий Олегович РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ, ПРЕДРАСПОЛАГАЮЩИХ К ТРОМБОФИЛИИ, В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ 14.01.01 - акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск-2012 _______________________________________________________________________________ Подписано в печать 19.01.2012 г. Формат 60х84 / 16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 115. Отпечатано в ГБОУ ВПО УГМА Минздравсоцразвития России. г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.