Подробнее… - Ростовский государственный медицинский

На правах рукописи
Бликян
Марина Владимировна
РОЛЬ ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ
РЕЗИСТЕНТНОСТИ В МЕХАНИЗМАХ ФОРМИРОВАНИЯ
ОСТРОЙ СОМАТИЧЕСКОЙ БОЛИ
14.03.03 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Ростов-на-Дону
2013г.
2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Ростовский
государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы
РФ, кандидат медицинских наук,
доцентБойченко Александр
Евгеньевич
Официальные оппоненты:
Тризно Николай Николаевич, доктор медицинских наук,
профессор, Государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования
«Астраханская государственнаямедицинскаяакадемия»
Министерства здравоохранения Российской Федерации,
заведующий кафедрой патологической физиологии.
ДжиоевИнал Германович, доктор медицинских наук, профессор,
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
профессионального образования «Северо-Осетинская
государственная медицинской академия»Министерства
здравоохранения Российской Федерации, заведующий ЦНИЛ.
Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное
учреждение «Научно-исследовательский институт общей
патологии и патофизиологии» РАМН.
Защита состоится «28» ноября 2013г. в 1000 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.082.03 на базе Государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Ростовский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (344022, Ростов-на-Дону, пер.
Нахичеванский, 29).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО
РостГМУ Минздрава России.
Автореферат разослан «25» октября 2013г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат медицинских наук
Л.А.Хаишева
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
исследования.Актуальность
работы
определяется тем, что на сегодняшний день достаточно подробно
изучен морфологический субстрат боли и противоболевой системы,
триггерные механизмы, молекулярные механизмы боли,изменения
функций нервной, эндокринной, иммунной систем, расстройства
метаболизма,
разработаны
принципы
этиотропной
и
патогенетической терапии (Крыжановский Г.Н.,2000; Овсянников
В.Г.,2007, 2012; Кукушкин М.Л., 2007, 2010, 2012;JonesA.R.
etal.,2003) и вместе с тем остается не изучена роль
неспецифических гуморальных механизмов защиты организма
(врожденного иммунитета) и регуляторов межклеточных
взаимоотношений в механизме формирования боли вообще и
острой соматической в частности.
Практически отсутствуют исследования роли ряда
гуморальных неспецифических факторов защиты (врожденного
иммунитета), лизоцима, С-реактивного белка, ИНФ-γ и регуляторов
иммунных реакций - цитокинов в механизмах формирования боли.
Таким образом, изучение боли в целом и доиммунных
механизмов реагирования на боль, в частности, делает проблему
актуальной.
Цель работы – изучить влияние острой соматической боли
на гуморальные факторы врожденного иммунитета и регуляторы
межклеточных взаимоотношений – цитокины.
В соответствии с целью определены задачи исследования.
I.Изучить изменение уровня регуляторов иммунных реакций –
провоспалительных цитокинов: ИЛ-1РA, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-α,
противовоспалительного цитокина ИЛ-4, а также ИНФ-γ у людей с
патологией, сопровождающейся острой болью;
II. В эксперименте:
- изучить влияние ОСБ на активность гуморальных факторов
врожденного иммунитета: лизоцима, СРБ, ИНФ-γ;
- изучить влияние ОСБ на регуляторы иммунных реакцийпровоспалительные цитокины: ИЛ-1α,ИЛ-1β,ИЛ-2,ИЛ-6,ФНО-α;
- изучить влияние ОСБ на регуляторы иммунных реакцийпротивовоспалительные цитокины: ИЛ-4, ИЛ-10;
III.На основе экспериментального материала сформулировать
рабочую гипотезу о механизме вовлечения гуморальных факторов
врожденного
иммунитета
и
регуляторов
межклеточных
взаимоотношений в алгогенный процесс.
4
Научная
новизна
исследования.
Впервые
дается
комплексная оценка реакции со стороны гуморальных факторов
врожденного
иммунитета:
лизоцима,
СРБ,
ИНФγ,провоспалительных цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6,ФНОα,противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 в динамике
экспериментально воспроизведенной ОСБ.
Впервые установлено, что наиболее ранняя реакция
наОСБотмечается со стороны лизоцима, далее прослеживается
увеличение содержания в плазме крови подопытных животных
ИНФ-γ и СРБ.
Выявлено, что ОСБ на начальных этапах своего
формирования активирует регуляторы иммунных реакцийпровоспалительные цитокины: ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, позже
вовлекается в процесс ИЛ-6.
Отмечено,
что
приОСБснижается
содержание
противовоспалительного цитокина ИЛ-10 и не наступают
статистически значимые изменения содержания ИЛ-4.
Установлено, что ФНО-α не реагирует на ОСБ в течение
трехчасового эксперимента.
Установлено, что реакция вовлечения в алгогенный процесс
гуморальных факторов врожденного иммунитета и регуляторов
межклеточных взаимоотношений транзиторна.
Впервые проведено сопоставление результатов изменения
активности цитокинов у людей, поступивших в стационар с
заболеваниями, сопровождающимися ОБ, и данных, полученных в
эксперименте при моделировании ОСБ. Показано, что в первом
случае
повышается
содержание
как
про-,
так
и
противовоспалительных цитокинов, а во втором – только
провоспалительных цитокинов. Установлено, что наиболее
существенно увеличивается содержание провоспалительных
цитокинов при абдоминальной боли, наименее – при соматической.
На основании анализа собственных результатов клинических
и экспериментальных исследований, сопоставления их с данными
литературы предложен алгоритм (принципиальная схема) (см.
схему1)
поэтапного
включения
гуморальных
факторов
врожденного иммунитета в алгогенный процесс и дано объяснение
его механизма.
Сформулировано концептуальное положение о том, что
острая соматическая боль вызывает мобилизацию гуморальных
5
факторов врожденного иммунитета и их готовность к отражению
возможного повреждения.
Теоретическая и практическая значимость. Данное
клинико-экспериментальное исследование относится к категории
фундаментальных, поскольку получены новые данные о
механизмах ОСБ.
Установлена
последовательность
и
интенсивность
вовлечения в алгогенный процесс гуморальных факторов
врожденного иммунитета и регуляторов иммунного ответа.
Выделены четыре этапа изменений: увеличение ИЛ-1α, ИЛ-1β и
лизоцима; увеличение ИЛ-2 и ИНФ-γ; увеличение ИЛ-6;
увеличение СРБ.
Постулирована мобилизационная готовность гуморальных
факторов врожденного иммунитета к возможному отражению
повреждения тканей и их инфицирования.
Личный вклад автора в получение результатов.Автором лично
проведено
экспериментальное
воспроизведение
острой
соматической боли, ее исследование по установленному плану.
Самостоятельно выполнен сбор и анализ материала, на основании
собственных результатов и изучения 362 источников научной
литературы
сформулированы
основные
положения
диссертационной работы.
Научные положения, выносимые на защиту:
1.
ОСБ вовлекает в алгогенный процесс ряд гуморальных
факторов врожденного иммунитета (неспецифических факторов
резистентности).
2.
Под влиянием ОСБ возрастает активность лизоцима,
количество ИНФ-γ и СРБ в плазме крови подопытных
животных.
3.
Под влиянием ОСБ в плазме периферической крови
возрастает количество провоспалительных цитокинов: ИЛ-1α,
ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6.
4.
Под
влиянием
ОСБ
снижается
содержание
противовоспалительного цитокина ИЛ-10, а содержание ИЛ-4 не
претерпевает статистически значимых изменений.
5.
Общая направленность реакций изученных гуморальных
факторов врожденного иммунитета, возникающих под влиянием
кратковременной ОСБ, свидетельствует о формировании их
«мобилизационной готовности» к отражению возможного
повреждения или инфицирования организма.
6
Апробация работы.Основные результаты исследования
доложены на III и IV Научно-практической конференции «Боль:
теория и практика» (Ростов-на-Дону, 2012, 2013), на 67-й Итоговой
научной
конференции
молодых
ученых
РостГМУ
с
международным участием (Ростов-на-Дону, 2013),на 86-й
Конференции студенческого научного общества (СПб.,2013), на
XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых
исследователей с международным участием (СПб., 2013).
Внедрение результатов. Результаты исследования включены
в содержание обучения на кафедрах патологической физиологии
ианастезиологии-реаниматологии.
Публикации результатов исследования. По материалам
диссертации опубликована 21работа.Из них 5– в периодических
научных изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации основных
положений диссертации на соискание ученой степени кандидата
медицинских наук; 16 – в сборниках научных работ, материалах и
тезисах научных конференций, в том числе и с международным
участием.
Принята заявка на изобретение. Российская Федерация, МПК
G01N 33/53. Способ оценки острой соматической боли [Текст] /
Бликян М.В., Овсянников В.Г., Бойченко А.Е., Алексеев В.В.,
Алексеева Н.С., Алексеева Н.А.; патентообладатель ГБОУ ВПО
Ростовский государственный медицинский университет Минздрава
России (RU). - № 2012134766/15; заявл. 14.08.2012.-12с.
Структура и объем.Диссертация изложена на 192 страницах
машинописного текста, состоит из введения, глав «Обзор
литературы», «Материалы и методы исследования», четырех глав
собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и
списка использованной литературы, содержащего 362 источника,
из них 195 отечественных и 167 зарубежных. Работа
иллюстрирована 3 таблицами, 3 схемами, 34
рисункамии4
фотографиями.
Содержание диссертационной работы
Материалы
и методы исследований. Работа основана на
клинических наблюдениях и на использовании экспериментального
материала. Исследована кровь, взятая от больных, доставленных в
приёмное отделение больницы скорой медицинской помощи с
7
заболеваниями, сопровождающимисяОБ. Клинические наблюдения
обобщены в 3 сериях исследований.
I серия посвящена изучению ИЛ-1РА, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-α,
ИНФ-γ у людей с эпизодами острой висцеральной боли (62
человека).
II серия посвящена изучению ИЛ-1РА, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-α и
ИНФ-γ у людей с соматической болью (19 человек).
III серия посвящена изучению ИЛ-1РА, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-α
и ИНФ-γ у здоровых людей (15 человек).
Экспериментальные исследования выполнены на 266 половозрелых
нелинейных белых крысах-самцах.
В соответствии с задачами, поставленными в работе, выполнено 4
серии исследований.
I серия –изучение СРБ у интактных крыс (n=15) и у крыс с ОСБ
(n=71).
II серия – изучение активности лизоцима у интактных крыс (n=15)
и у крыс с причиненной ОСБ (n=75).
III серия – изучение содержания ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6,
ИЛ-10, ИНФ-γ, ФНО-α у интактных крыс (n=10) и у крыс с
причиненной острой соматической болью (n=50).
IV серия – контрольная (n=30).
ОСБ 3-4 степени моделировали путем электрокожного
раздражения рецепторной зоны корня хвоста крыс с помощью
электростимулятора ЭСУ-2 со следующими параметрами: частота
тока – 1000 Гц; амплитуда тока – 30 В; длительность импульса –
500 мс; задержка импульса – 1 мс и время стимуляции – 2 минуты.
На основании анализа поведенческих и вегетативных реакций
оценивали интенсивность болевого раздражения в соответствии с
критериями Вальдмана А.В. и Васильева Ю.Н. в модификации
Овсянникова В.Г. (2003).
Забор материала для исследования производили через 2, 30,
60, 120 и 180 минут после электростимуляции. Для получения
биологического материала (кровь) крыс декапитировали. Все
манипуляции с экспериментальными животными проводили в
8
соответствии с приказом МЗ РФ №267 «Об утверждении правил
лабораторной практики» от 19 июня 2003г.
Сыворотку крови использовали для исследования активности
лизоцима по нефелометрическому методу Дорофейчука В.Г.(1968)в
нашей модификации.
Концентрацию СРБ в сыворотке крови крыс определяли
методом иммуноферментного анализа с помощью наборов фирмы
BDBiosciences (USA).
Измерение оптической плотности опытных проб при 450 нм и
обсчет
результатов
проводили
на
фотометре
MULTISKANMSLABSYSTEMS (Finland).
Концентрацию цитокинов в сыворотке крови людей и
экспериментальных крыс определяли методом иммуноферментного
анализа с помощью наборов фирм «Вектор-Бест» (Новосибирск)
иBenderMedSystems (Europe).
Статистическая
обработка
данных
проводилась
с
применением прикладных программ SATISTICA 6.0 (Stat-SoftInc) и
MicrosoftOfficeExcel 2007. Статистический анализ включал расчет
средней арифметической величины (М), ошибки среднего (m),
среднего квадратичного отклонения (σ). Числовые данные
приведены в виде средних значений со стандартной ошибкой
среднего (M±m). Для сравнения средних величин независимых
малых выборок использовался непараметрический U-критерий
Манна-Уитни. При сравнении качественных показателей
применялся непараметрический критерий хи-квадрат. Критический
уровень значимости при проверке статистических гипотез
принимался равным 0,05, а как тенденцию к значимости принимали
при 0,05<p≤0,1.
Результаты клинических наблюдений. Исследование
крови больных с заболеваниями,
сопровождающимися ОБ,
позволило констатировать увеличение концентрации как про-, так и
противовоспалительных цитокинов. Причём при висцеральной
боли сдвиг был значительнее, чем при соматической.
Следует полагать, что увеличение цитокиновой активности
неминуемо скажется на механизмах врождённого иммунитета.
Однако какова роль самой боли в этом процессе - можно выяснить
только в эксперименте. Следует учитывать, что при висцеральной
патологии, особенно при абдоминальной, боль является следствием
развившегося воспаления и, нередко, присоединившейся инфекции.
9
При травмах опорно-двигательного аппарата боль – сигнал о
возникновении повреждения. Она возникает раньше, чем вторичная
альтерация.
Поэтому оснований расценивать боль как инициатор сдвигов
со стороны факторов врождённого иммунитета и их гуморальных
регуляторов при ОСБгораздо больше, чем при ОВБ.
Это дало основание избрать в качестве экспериментальной
модели ОСБ, при которой выяснять механизм влияния боли как
таковой на иммунный статус более корректно, чем при
висцеральной боли.
Результаты экспериментальных наблюдений
Изменение содержания лизоцима при ОСБ.У взрослых
животных контрольной группы (n=15) активность лизоцима в
периферической крови составляет 0,26±0,013 ед.
Через 2 минуты после алгогенного воздействия (n=15)
отмечается увеличение активности лизоцима до 0,45±0,014 ед.
(р<0,001). Этот всплеск достаточно солидарен и непродолжителен.
Через 30 минут активность лизоцима менее выражена 0,39±0,008 ед., но показатель продолжает оставаться высоким по
отношению к контрольной группе (n=15) (р<0,001).
Через час после болевого воздействия (n=15) активность
лизоцима - 0,201±0,019 ед. Через 2 часа после электростимуляции
(n=15) активность лизоцима уменьшается до 0,135±0,023 ед.
(р<0,001). Через 3 часа (n=15) активность лизоцима минимальна –
0,119±0,01 ед. (р<0,001).
Обнаружена двухфазная реакция лизоцима на острую
соматическую боль - ранний всплеск его активности с
последующим падением.
Изменение содержания СРБ в плазме крови при ОСБ. В
контрольной серии экспериментов (n=15) содержание СРБ в
периферической крови крыс 500,53±20,091 нг/мл.
Через 2 минуты после болевого воздействия (n=13)
содержание СРБ составляет 482,46±45,875 нг/мл (p>0,05).
Через 30 минут (n=15)уровень СРБ составляет 470,13±31,138
нг/мл при p>0,05.
Через 1 час (n=13) содержание СРБ снижается до
337,23±32,942 нг/мл (p<0,001).
Через два часа содержание СРБ возрастает (n=15) до
593,60±38,574 нг/мл.
10
Через три часа содержание СРБ (n=15) составляет
688,80±33,309 нг/мл. Это очевидный прирост (p<0,001).
Таким образом, в течение 3 часов отмечается двухфазная
реакция СРБ - снижение содержания СРБ с последующим его
увеличением.
Изменение содержания ИНФ-γ при ОСБ. У животных
контрольной группы (n=10) содержание ИНФ-γ в периферической
крови составило 2,9±1,3 пг/мл.
Через 2 минуты (n=10) ИНФ-γ в периферической крови не
определялся.
Через 30 минут (n=10) выявлено увеличение ИНФ-γ до
6,85±1,5 пг/мл(p<0,05).
Через два часа (n=10) содержание ИНФ-γ составило 7,0±3,3
пг/мл (р>0,05).
Содержание ИНФ-γ у животных (n=10) через 3 часа
составляет 1,0±0,7 пг/мл (р>0,05).
Отсутствие или низкое содержание ИНФ-γ в крови животных
в динамике эксперимента объяснимо.
По полученным независимо друг от друга данным
(Григорьян С.С., Майоров И.А. и др., 1988; Виноградова Е.Н.,
Яковлев А.А., Демиденко Т.П. и др., 1996; Диканская Н.В.,
1998;Ф.И. Ершов и О.И. Киселев, 2005), концентрация ИНФ-γ в
крови очень низкая, в ряде случаев неопределяемая.
Зарегистрированное и статистически подтвержденное
увеличение ИНФ-γ в периферической крови через 30 минут после
болевого воздействия скорее всего связано с неспецифическим
свойством клеток-продуцентов сбрасывать цитокины под влиянием
каскада стимулов, вызванных стрессом, и в частности болью.
Изменения со стороны гуморальных факторов регуляции
иммунитета при ОСБ в эксперименте
Провоспалительные цитокины. У животных контрольной
группы содержание ИЛ-1α (n=10) в периферической крови
составляет 417,0±65,3 пг/мл, а ИЛ-1β (n=10) – 24,6±4,1 пг/мл.
Определение ИЛ-1α (n=10) через 2 минуты после болевого
воздействия выявило его повышенное содержание – 633,3±102,2
пг/мл (p<0,001).
Через 30 минут содержание ИЛ-1α (n=10) составило
512,6±58,6 пг/мл, через 60 минут (n=10) - 539,1± 102,4 пг/мл.
11
Полученные значения в обоих случаях не имели статистически
значимого различия по сравнению с контрольной серией (p>0,05).
Через 2 часа содержание ИЛ-1α (n=10) составляет
660,6±108,3 пг/мл, а часом позже - 859,3± 126,3 пг/мл (р<0,05).
Через 2 минуты после алгогенного воздействия содержание
ИЛ-1β (n=10) было втрое выше, чем в контрольной группе, и
составило 74,0±24,5 пг/мл (р<0,01). Через 30
минут также
сохраняется повышенное содержание ИЛ-lβ (n=10) - 77,2± 27,2
пг/мл (р<0,01).
Через 60 минут отмечаетсядальнейшее повышение
содержания ИЛ-1β (n=10) - 85,0±32,5 пг/мл (p<0,01).
Через 2 часа содержание ИЛ-1β (n=10) снизилось до 40,2±5,9
пг/мл, а через 3 часа (n=10) составило 53,0±12,3 пг/мл (р<0,05).
Таким образом, болевая стимуляция сразу же инициировала
существенный прирост ИЛ-1α и ИЛ-1β. В дальнейшем ИЛ-1α к
концу трехчасового эксперимента повышается, тогда, как ИЛ-1β
снижается, но остается выше, чем у контрольной группы.
Интенсивность начального прироста ИЛ-1β выше, чем ИЛ-1α.
Изменение содержания ИЛ-2 при ОСБ. У животных
контрольной группы (n=10) содержание ИЛ-2 в периферической
крови 18,1±4,1 пг/мл. Через 2 минуты после нанесения болевого
раздражения изменения в содержании ИЛ-2 (n=10) не произошло –
15,9±3,6 пг/мл (p>0,05).
Через 30 минут (n=10) регистрируется резкое увеличение ИЛ2– 499,5±44,0 пг/мл (p<0,001).
В последующие полтора часа содержание ИЛ-2 падает ичерез
2 часа (n=10) составляет 109,5±39,4 пг/мл (р<0,05).
Через 3 часа с начала эксперимента содержание ИЛ-2 (n=10)
равно нулю.
Таким образом, острое болевое воздействие вызывает
бурный прирост ИЛ-2 в крови через полчаса после начала
эксперимента.
Изменение содержания ФНО-α при ОСБ. У интактных
крыс (n=10) уровень ФНО-α - 186,0±21,6 пг/мл.
Через 2 минуты после нанесения болевого раздражения(n=10)
уровень ФНО-α не отличался от контрольных значений 191,0±34,2
пг/мл (p>0,05).
Через 30 минут (n=10) –165,0±28,9 пг/мл (p>0,05).
Через 1 час (n=10) – 180,4±38,6 пг/мл (p>0,05).
12
То же самое наблюдается и через 2 часа:в периферической
крови крыс (n=10) содержание ФНО-α составляет 164,4±38,9 пг/мл
при p>0,05.
И только через 3 часа после алгогенного воздействия у
животных (n=10) зарегистрирован уровень ФНО-α более низкий,
чем у животных контрольной группы – 104,6±24,7пг/мл (p<0,01).
Таким образом, в течение трех часов после болевого
воздействия ФНО-α у крыс оставался на неизменном уровне и
только через 3 часа зарегистрировано уменьшение его содержания
в периферической крови.
Противовоспалительные цитокины
Изменение
содержания
ИЛ-4
при
ОСБ.
У
животныхконтрольной группы (n=10) содержание ИЛ-4 в
периферической крови составляет 3,2±1,5 пг/мл.
Через 2 минуты после болевого воздействия ИЛ-4 не
определяется(n=10).
Через 30минут уровень ИЛ-4 у отдельных животных
повышен (n=10). В среднем ИЛ составляет 5,07±1,5 пг/мл (p>0,05)
Через 2 часаотмечается снижение ИЛ-4 (n=10) – 0,7±0,4
пг/мл, но оно статистически не значимо (p>0,05).
Таким образом, статистически подтверждаемого подъема или
падения показателей не обнаружено в динамике всего
эксперимента.
Изменение содержания ИЛ-10 при ОСБ. У интактных крыс
(n=10) содержание ИЛ-10 в периферической крови составляет
340,8±98,5 пг/мл.
Через 2 минуты после острого алгогенного воздействия у
животных (n=10) отмечается снижение содержания ИЛ-10 до
109,8±17,6 пг/мл (p<0,01).
Через 30 минут уровень исследуемого интерлейкина
(n=10)оставался ниже контрольных цифр – 145,0±35,1 пг/мл
(р<0,05).
Через 60 минут снижение содержания ИЛ-10 (n=10)
статистически высоко значимо (p<0,001), оно достигает 82,4±13,7
пг/мл.
Через 2 часа сохраняются низкие цифры, характеризующие
уровень ИЛ-10 (n=10) – 120,2±21,8 пг/мл (p<0,05).
Показатели остаются на низких значениях и через 3 часа
(n=10) – 113,0±40,4 пг/мл (p<0,01).
13
Таким образом, снизившееся содержание ИЛ-10 через 2
минуты после нанесения острого болевого воздействия продолжает
сохраняться на протяжении всего эксперимента.
Изменение содержания ИЛ-6 при ОСБ. У животных
контрольной группы (n=10) содержание ИЛ-6 в периферической
крови составило 88,2±27,6 пг/мл.
Через 2 минуты после нанесения болевого раздражения
(n=10) содержание ИЛ-6 составляет 32,8±12,8 пг/мл (p<0,05).
Через 30 минут (n=10) содержание ИЛ-6 составляет 98,2±54,9
пг/мл (p>0,05).
И через 1 час (n=10) картина не меняется - 102,0±53,0
пг/мл(p>0,05).
Уже через 2 часа отмечается увеличение исследуемого
цитокина (n=10) – 199,0±34,4 пг/мл (p<0,05).
Через 3 часа после болевого воздействия (n=10) содержание
ИЛ-6 в крови составило 106,0±38,1 пг/мл (p>0,05).
Таким образом, отмечается повышение содержания ИЛ-6
через 2 часа после алгогенного воздействия.
Обсуждение результатов
Если все меньше сомнений остается относительно самой
возможности активации механизмов врожденного иммунитета под
влиянием боли, то патогенетическая цепочка, обеспечивающая эту
активацию, далека от расшифровки.
В экспериментальной части работы отмечается всплеск и
быстрое падение ряда провоспалительных цитокинов при снижении
уровня
противовоспалительных. Зарегистрирована активация
лизоцима, СРБ и ИНФ-γ.
Мы имеем дело с реакцией. Очевидна боль, а альтерация едва
выражена и обратима. Как показывают результаты контрольных
экспериментов, такая альтерация не приводит в движение систему
цитокинов и факторов врожденного иммунитета.
Анализ хронологии вступления обозначенных факторов в
процесс, степень интенсивности их ответа позволяют выстроить
некоторую патогенетическую цепь.
Практически сразу после нанесения болевого раздражения в
периферической крови крыс нарастает уровень ИЛ-1α и ИЛ-1β.
Интенсивность прироста ИЛ-1β значительно выше, чем ИЛ-1α, и
повышается активность лизоцима.
14
ИЛ-2 через 30 минут определяется в количестве почти в 30
раз выше, чем у контрольной группы.
Содержание ИНФ-γ составляет вдвое больше, чем в
контрольной группе.
Значительно позже – через 2 часа - наступает увеличение
содержания ИЛ-6.
И только через 3 часа нарастает уровень СРБ.
Таким образом, в хронологической последовательности
можно выделить четыре этапа (см. рис.1):увеличение количества
ИЛ-1α,ИЛ-1β и активности лизоцима; увеличение количества ИЛ-2
и ИНФ-γ;увеличение количества ИЛ-6;увеличение количества СРБ.
В динамике всего эксперимента отмечалась активация
факторов врожденного иммунитета, а среди цитокинов – только
провоспалительных.
Содержание
противовоспалительных
цитокиновпадало и не восстанавливалось в течение 3-х часов.
Вектор описываемых реакций направлен в сторону
активации врожденного иммунитета.
Рис.1 Динамика активации неспецифических гуморальных факторов
защиты и цитокинов при ОСБ
Максимальные значения параметров после воздействия и
контрольные значения приведены на рис.2.
15
Рис. 2 Контрольные и максимальные значения после ОСБ
Анализ же в процентах наглядно иллюстрирует (см. рис.3)
следующее: самый значительный прирост содержания дает ИЛ-2,
за ним идут ИЛ-1β, а следующие в описанной череде ИЛ-1α, ИНФ-γ
и ИЛ-6.
Рис. 3 Сравнительный анализ значений. (Величины представлены в
логарифмическом масштабе по основанию 10)
16
В первые полчаса с момента начала эксперимента выявлена
высокая активность лизоцима, а также увеличение уровня ИЛ-1α,
ИЛ-1β и ИЛ-2. Содержание противовоспалительных цитокинов в
динамике эксперимента снижалось, особенно ИЛ-10.
В несколько иной конструкции эксперимента на крысах
показано, что в динамике развития эмоционально-болевого стресса
первым
повышается
уровень
ИЛ-1β,
а
содержание
противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 не отличается от
исходного (Павлова В.И., Мамылина Н.В., 2012).
Проведенные
исследования
позволяют
заключить,
что
провоспалительные цитокины в ответ на болевое раздражение
реагируют
увеличением
присутствия
в
крови,
а
противовоспалительные – нет.
Известно что, электрокожное болевое раздражение дает
толчок для трансинтестинальногомикробного транспорта (Дугин
С.Ф., Анищенко Н.В., Агаджанян З.С. и др., 2006). Описанный
факт позволяет понять активную реакцию лизоцима на болевое
раздражение, если подойти к этому в эволюционном аспекте.
Стресс как таковой, и боль в частности, в эволюции закрепили
механизм мобилизации факторов врожденного иммунитета.
На лимфоцитах и макрофагах присутствуют рецепторы к
дофамину и норадреналину, через которые регулируется биосинтез
и продукция цитокинов (Абрамов В.В., Абрамова Т.Я., Козлов
В.А., 2006).
Сообщается, что через β-адренорецепторы катехоламины
стимулируют выработку ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-α, ИЛ-6 (ElenkovI.J.
etal., 2000; SoszynskiD. etal., 1996; vanGoolJ., 1990; LeTulzoY. еtal.,
1997).
Цитокины вступают в каскадную реакцию: они, воздействуя
на рецепторы клеток-продуцентов, инициируют биосинтез других
цитокинов и самих себя, а также могут репрессировать биосинтез
цитокинов - антагонистов.
В проведенных исследованиях наблюдается некоторая
временная последовательность. ИЛ-1α иИЛ-1β обнаруживаются при
болевой стимуляции раньше, чем ИЛ-2.
ИЛ-1 активирует выработку ИЛ-2 (Симбирцев А.С., 2002).
Параллельно с нарастанием уровня ИЛ-2 наблюдаем рост
содержания в периферической крови ИНФ-γ.
17
В литературе существует достаточно солидарное мнение,что
ИЛ-2 активирует биосинтез ИНФ-γ. Увеличение содержания ИНФγ обнаружено нами через 30 минут от начала эксперимента.
Таким образом, в алгогенный процесс первыми вступают ИЛ1, ИЛ-2 и ИНФ-γ.
Через 2 часа после момента нанесения болевого раздражения
нарастает уровень ИЛ-6. Считается, что увеличение выработки ИЛ6 происходит под влиянием ИНФ-γ(VinK., HockC.E., LaiP.S.
etal.,1999; PaludanS.R., 2000; SchotleliusA.J. etal., 2004).
Ярилин А.А. указывает, что ИЛ-6 вырабатывается под
влиянием ИЛ-1 (Ярилин А.А., 1999). Эту же точку зрения разделяют
Фрейдлин И.С. (1998); MeershaertK., FurieM.B. (1995).
Данные источников литературы дают основание предполагать,
что ИЛ-6 в динамике долорогенного процесса появляется вторично
под влиянием провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-2 и ИНФ-γ.
Признанным считается, что активатором биосинтеза СРБ
является ИЛ-6, в меньшей степени ИЛ-1 и другие
провоспалительные цитокины (DolhainR. etal.,1996; KolbBachofenV.,1991). Причем ИЛ-1β - более эффективный стимулятор
синтеза СРБ (DinarelloC.A.,1986; BataileR., KleinB., 1992; PapaA.,
BinoS., VeloE. еtal.,2006; Логинова Т.К., 2008). Полагаем, что в
алгогенном процессе СРБ едва ли не завершающий фактор из
исследованных нами, биосинтез которого индуцируют ИЛ-1 и ИЛ-6.
Таким образом, под влиянием боли происходит активация
факторов врожденного иммунитета и биологически активных
веществ-цитокинов, регулирующих этот процесс. Следует добавить,
что активация провоспалительных цитокинов носит нестойкий
характер, прослеживается тенденция к снижению их активности.
Уровень лизоцима снижается через час после его всплеска.
Через 3 часа количественное содержание ИЛ-2, ФНО-α,
ИНФ-γ приобретает значение ниже контрольного или равное ему.
На протяжении всего эксперимента остается повышенным
содержание лишь ИЛ-1α и ИЛ-1β.
Содержание противовоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ10 падает и не восстанавливается до конца эксперимента.
В нашем случае инфекции нет, альтерированных тканей нет.
Есть лишь угроза их появления. При отсутствии воспаления
потребность в противовоспалительных цитокинах отпадает.
При увеличении гуморальных факторов врожденного
иммунитета и провоспалительных цитокинов формируется лишь
18
функциональная готовность к отражению возможного повреждения
и развития воспаления как типового патологического процесса,
направленного на устранение повреждения.
Полагаем, что выявленную реакцию можно обозначить как
«синдром мобилизационной готовности» ряда гуморальных
факторов врожденного иммунитета и их регуляторов к отражению
возможного повреждения и инфицирования тканей. К синдрому
следует отнести повышение активности лизоцима,увеличение
содержания СРБ,увеличение содержания ИНФ-γ,увеличение
содержания провоспалительных цитокинов: ИЛ-1α,ИЛ-1β, ИЛ-2,
ИЛ-6.
Как явствует из приведенной выше схемы, результатом
раздражения клеток является срочное выделение лизоцима, позже –
СРБ через посредство влияния ИЛ-1 и ИЛ-6. Как известно, эти
гуморальные факторы врожденного иммунитета обладают как
прямым бактериолитическим, так и бактерицидным эффектом за
счет активации хемотаксиса, усиления хемоатракции и фагоцитоза,
запуска каскадной системы активации комплемента.
Обнаружено нарастание уровня ИЛ-1α и ИЛ-1β. Они
активируют нейтрофилы, усиливают хемотаксис, обеспечивают
условия для эмиграции фагоцитов (Кетлинский С.А. с соавт., 1992).
ИЛ-1 вместе
с ИЛ-6, уровень которого тоже возрастает,
активируют гепатоциты, а те в свою очередь продуцируют и
секретируют С-реактивный белок.
Повышается содержание ИЛ-2, который
стимулирует
выработку ИНФ-γ.
Эффекты эти непродолжительны, часть из них нивелируется
уже через 3 часа после нанесения болевого раздражения. Это
позволяет нам трактовать боль как толчок, который способен
преодолеть инерционные механизмы функционального покоя
клеток и привести систему факторов врожденного иммунитета в
рабочее состояние.
19
Схема 1. Вовлечение в алгогенный процесс гуморальных факторов врожденного иммунитета и цитокинов
вэксперименте у лабораторных животных
20
Выводы
Острая соматическая боль вовлекает в алгогенный процесс
гуморальные факторы врожденного иммунитета: повышается
активность в периферической крови лизоцима, увеличивается
содержание ИНФ-γ и С-реактивного белка.
2.
При острой соматической боли в алгогенный процесс наиболее
рано и интенсивно вовлекается лизоцим.
3.
При острой соматической боли изменяется содержание и
соотношение
цитокинов:
увеличивается
содержание
провоспалительных цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6;
наиболее значительно повышается содержание ИЛ-2.
4.
На начальных этапах формирования острой соматической боли
содержание противовоспалительного цитокина ИЛ-10 падает и
остается сниженным в динамике всего эксперимента.Содержание
ИЛ-4 и ФНО-α не изменяется.
1.
21
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Овсянников В.Г., Бойченко А.Е., Алексеев В.В., Бликян
М.В. Боль и зуд. Сходство и различия. Перспективы
исследований
зуда
//
Владикавказский
медикобиологический вестник. 2011. Т. XII.Выпуск № 19. С.105108.
Овсянников В.Г., Бойченко А.Е., Алексеев В.В.,Бликян
М.В., Николаев В.Е., Алексеева Н.С., Бойченко Т.А.,
Алексеева
Н.А.,
Лабушкина
А.В.,
Абрамова
М.В.Цитокиновая
активность
при
заболеваниях,
сопровождающихся острой болью // Владикавказский
медико-биологический вестник. 2011. Т. XIII.Выпуск № 2021. С.35-41.
Овсянников В.Г., Бойченко А.Е., Алексеев В.В., Бликян М.В.,
Николаев В.Е., Алексеева Н.С., Бойченко Т.А., Алексеева Н.А.,
Лабушкина А.В., Абрамова М.В. Динамика цитокиновой
активности при острой боли различной локализации // Журнал
фундаментальной медицины и биологии. 2012. №1. С.82-86.
Алексеева Н.С., Алексеев В.В.,Бликян М.В., Богатырева Р.Р.,
Медведева Л.А., Эльканова С.Д. Особенности изменения ИЛ-2,
ИЛ-4, γ-ИФН при острой соматической боли у крыс //
Материалы IIIнаучно-практической конференции «Боль: теория
и практика». Ростов-на-Дону, 2012. С.44-47.
Бликян М.В., Алексеева Н.С., Асламазова Н.А., Варламова
Н.А. Особенности иммунной защиты организма при острой
соматической и абдоминальной боли // Материалы II
Всероссийской научно-практической конференции молодых
ученых «Сибирские медико-биологические чтения». Барнаул,
2012. С.7-9.
Овсянников В.Г., Бойченко А.Е., Алексеев В.В.,Бликян
М.В., Алексеева Н.С., Алексеева Н.А., Бойченко Т.А.
Цитокиновый ансамбль при острой соматической боли //
Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 3. С.125-127.
Алексеев В.В.,Бликян М.В., Алексеева Н.С.,Тигиев А.В.,
Бадалова Ф.Т.К., Бадалова Г.Т.К. С-реактивный белок у
взрослых и старых крыс при острой соматической боли //
Материалы IV научно-практической конференции «Боль:
теория и практика». Ростов-на-Дону, 2013. С.59-61.
22
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Алексеев В.В.,Бликян М.В., Алексеева Н.С., Катышева Ю.И.,
Мельников Ю.Н. Влияние интерлейкинов на С- реактивный
белок при ОСБ // Материалы IVнаучно-практической
конференции «Боль: теория и практика». Ростов-на-Дону, 2013.
С.71-72.
Алексеев В.В.,Бликян М.В., Алексеева Н.С., Федотова Т.В.,
Алексеенко М.В. Изменения лизоцима у «половозрелых» и
«старых» животных при острой соматической боли //
Материалы IVнаучно-практической конференции «Боль:
теория и практика». Ростов-на-Дону, 2013. С.73-74.
Бликян М.В., Алексеева Н.С., Харагургиева Л.С., Кролевец
Д.И.,Салпагаров М.Ш., Орлов В.М. Особенности изменения
содержания лизоцима при острой боли в возрастном аспекте //
Тезисы
XVI
Всероссийской
медико-биологической
конференции молодых исследователей (с международным
участием). СПб., 2013. С.13-14.
Тертышная Н.М., Алексеева Н.С., Бликян М.В., Алексеенко
М.В., Федотова Т.В., Богатырева Р.Р. Изменения лизоцима у
взрослых животных при острой соматической боли // Тезисы
XVI Всероссийской медико-биологической конференции
молодых исследователей (с международным участием). СПб.,
2013. С.402.
Шатковская И.И., Алексеева Н.С., Бликян М.В., Тертышная
Н.М., Сенин С.И., Федотова Т.В. Изменения содержания Cреактивного белка у новорожденных и взрослых крыс при
острой соматической боли // Тезисы XVIВсероссийской
медико-биологической конференции молодых исследователей
(с международным участием). СПб., 2013. С.462.
Павленко Л.В., Бликян М.В., Алексеева Н.С., Катышева Ю.И.,
Мельников Ю.Н. Взаимосвязь СРБ с ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6,
ИЛ-10 у взрослых крыс при ОСБ // Мечниковские чтения –
2013:Материалы 86-й конференции студенческого научного
общества.СПб., 2013.С. 203-204.
Овсянников В.Г., Бойченко А.Е., Алексеев В.В., Бликян,
М.В., Алексеева Н.С., Алексеева Н.А., Лебедев М.А.,
Котиева И.М. С-реактивный белок при острой
соматической боли // Цитокины и воспаление. 2013. Т. 12.
№ 1-2. С.22-25.
23
15. Овсянников В.Г., Шлык С.В., Алексеев В.В., Бойченко
А.Е., Бликян, М.В., Алексеева Н.С., Абрамова Н.В.
Изменение уровня лизоцима при острой соматической боли
у взрослых крыс //Медицинский вестник Юга России. 2013.
№ 3. С.66-68.
Подана заявка на изобретение. Российская Федерация, МПК G01N
33/53. Способ оценки острой соматической боли [Текст] / Бликян
М.В., Овсянников В.Г., Бойченко А.Е., Алексеев В.В., Алексеева
Н.С., Алексеева Н.А.; патентообладатель ГБОУ ВПО РостГМУ
Минздрава России (RU). - № 2012134766/15; заявл. 14.08.2012.-12с.
24
Список сокращений
ИЛ – интерлейкин
ИЛ-1 – интерлейкин-1
ИЛ-1 (РА) - рецепторный антагонист интерлейкина-1
ИЛ-1α – интерлейкин-1α
ИЛ-1β – интерлейкин-1β
ИЛ-2 – интерлейкин-2
ИЛ-4 – интерлейкин-4
ИЛ-6 – интерлейкин-6
ИЛ-8 – интерлейкин-8
ИЛ-10 – интерлейкин-10
ИНФ-γ – интерферон-γ
СРБ – С-реактивный белок
ОБ – острая боль
ОСБ – острая соматическая боль
ОВБ – острая висцеральная боль
САС – симпато-адреналовая система
ФНО-α – фактор некроза опухоли-α