FR E-3000 PAPP-A (Ассоциированный с беременностью протеин

FR E-3000 PAPP-A (Ассоциированный с беременностью протеин А)
Набор реагентов для ИФА для количественного определения PAPP-A в сыворотке и плазме.
Только для in vitro диагностики.
PAPP-A - белок продуцируемый развивающейся плацентой. Его концентрация в крови матери
резко возрастает после 7-й недели беременности. Измерение уровня PAPP-A в первом триместре
беременности, согласно литературным данным, полезный маркер в дородовом скрининге на
синдром Дауна и другие анеуплоидии плода. Уменьшение значения PAPP в сочетании с возрастом
матери, определение свободного бета-ХГЧ и ультразвукового определения толщины
воротникового пространства (NT) во время с 11 по 14 неделю беременности помогает обнаружить
до 90% беременностей с синдромом Дауна.
Это PAPP-ИФА может быть использован для оценки риска развития синдрома Дауна (трисомии 21
хромосомы) в первом триместре беременности. Для оценки риска трисомии 21 хромосомы и
других анеуплоидий плода уровень PAPP-A всегда должен определяться в сочетании с другими
показателями (например: свободный бета-ХГЧ и NT, см. выше) и для оценки риска трисомии
должно использоваться специальное программное обеспечение.
Согласно директиве IVD (98/79/EC), программное обеспечение и наборы для определения
дополнительных показателей должны быть пригодны для скрининга трисомии 21 и быть СЕ
сертифицированы, должен быть указан идентификационный номер уполномоченного органа на
СЕ-маркировку на программное обеспечение и наборы.
PAPP-A ELISA основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанный
на принципе сэндвича.
Лунки покрыты поликлональными анти-PAPP-A-антителами. Аликвоту образца пациента,
содержащую эндогенный PAPP-A ,инкубируют в лунке с буфером для анализа. После инкубации
не связавшийся материал вымывается. На второй стадии инкубации образуется сэндвичкомплекс с конъюгатом поликлональных анти-PAPP-A-антител с пероксидазой. После добавления
субстрата интенсивность цвета становится пропорциональна концентрации PAPP-A в образцах
пациента.
Забор и хранение образцов:
Сыворотка:
Возьмите кровь из вены, дайте ей свернуться и отделите сыворотку центрифугированием при
комнатной температуре. Не центрифугируйте, если не произошло полное свертывание. у
пациентов, получающих анти-коагулянтную терапию времени свертывания крови может быть
увеличено.
Плазма:
Цельная кровь должна быть собрана в пробирки для центрифугирования, содержащие
антикоагулянт и сразу после сбора центрифугирована.
(Например: ЭДТА-, гепарин-, цитрат-плазма)
Хранение и подготовка образцов:
Хранение: до 5 дней при 2-8˚С.
ЭДТА-плазма при 2-8˚С должна храниться до 48 часов.
Хранение: до 2 месяцев при -20
˚С.
Размораживайте образцы или аликвоты непосредственно перед анализом.
Разведение образцов:
Если полученная концентрация в образце выше, чем 30 мкг/мл, то образец должен быть разведен
Стандартом 0, после чего необходимо выполнить исследование разведенного образца. При
расчете результата необходимо учитывать коэффициент разведения.
Пример:
a) разведение 1:10 10 мкл Образца + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать)
b) разведение 1:100 10 мл разведения а) + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать)
Дополнительные материалы и оборудование, необходимые, но не поставляемые в комплекте
- Микропланшетный анализатор (450±10 нм)
- Откалиброванные прецизионные микропипетки переменного объёма
- Абсорбирующая бумага
- Дистиллированная или деионизированная бумага
- Таймер на 60 мин.
- полулогарифмическая бумага или соответствующее программное обеспечение для построения
калибровочной кривой
Хранение реагентов:
При хранении при температуре 2-8 ° С закрытые реагенты сохраняют активность до истечения
срока годности. Не используйте реагенты после этой даты.
Открытые реагенты необходимо хранить при 2-8 ° С. Микропланшет должен храниться при 2-8 ° С.
Микропланшет должен храниться в закрытом фольгированном мешке.
При соблюдении условий хранения открытые реагенты сохраняют свою активность в течении двух
месяцев.
1. Микропланшет, 12х8 стрипов, разборный, 96 лунок;
Лунки покрыты поликлональными анти-PAPP-A-антителами
2. Стандарты (0-5), 6 флаконов, лиофилизированные, 0,15 мл
Концентрации: 0, 1, 2,5, 5,0, 15,0, 30,0 мкг/мл
Перевод единиц: 1 мЕд /мл = 4.5 мг/л
Стандарты подготовлены согласно справочным рекомендациям NEQAS для скрининга
синдрома Дауна (U/L, IRP 76/610)
содержат 0,015% BND и 0,010% MIT в качестве консерванта
3. Контроли (высокий и низкий), 2 флакона, 0,15 мл.
Концентрация указана на этикетке флакона.
содержат 0,015% BND и 0,010% MIT в качестве консерванта
4. Буфер для анализа
1 флакон, 25 мл, готов к использованию
содержат 0,015% BND и 0,010% MIT в качестве консерванта
5. Концентрированный ферментный конъюгат х10
1 флакон, 1,5 мл
Комплекс содержит пероксидазу хрена
Содержит 0,03% проклин, 0,015% BND и 0,010% MIT в качестве консерванта
6. Раствор для разведения конъюгата, 1 флакон, 14 мл, готов к использованию
Содержит 0,03% проклин, 0,015% BND и 0,010% MIT в качестве консерванта
7. Раствор субстрата.
1 флакон, 14 мл, готов к использованию
Содержит тетраметилбензидин (ТМБ)
8. Стоп-раствор
1 флакон, 14 мл, готов к использованию
Содержит 0,5 М серной кислоты
Избегайте контакта со стоп-раствором. Может вызвать раздражение кожи и ожоги.
9. Концентрированный промывочный раствор х40
1 флакон, 30 мл.
BND = 5-бром0-5-нитро-1 ,3-диоксан
MIT = 2-метил-2Н-изотиазол-3-он
Процедура анализа:
Приготовление реагентов:
Прогрейте все реагенты и необходимое количество стрипов до комнатной температуры.
Стандарты:
Восстановите содержимое флакона, добавив 150 мкл дистиллированной воды.
Восстановленные стандарты могут храниться в течении 2 месяцев при температуре 2-8 ˚С
Контроли:
Восстановите содержимое флакона, добавив 150 мкл дистиллированной воды. Дайте постоять
минимум 10 минут. Перемешайте несколько раз перед использованием.
Восстановленные контроли могут храниться в течении 2 месяцев при температуре 2-8 ˚С
Промывочный раствор:
Разведите 30 мл концентрированного промывочного раствора, добавив 1 170 мл
деионизированной воды (до конечного объёма 1 200 мл)
Разведенный промывочный раствор стабилен в течение 2 недель при комнатной температуре.
Ферментный конъюгат:
За 30 минут перед применением смешайте 1 мл ферментного конъюгата с 10 мл раствора для
разведения конъюгата.
Важно: Ферментный конъюгат должен готовится за 30 минут перед применением и может
храниться не более суток. Перед анализом разведите количество конъюгата необходимое для
теста.
Все реагенты должны быть комнатной температуры. Исследование стандартов, контролей и
образцов должны осуществляться в дублях. Как только процедура анализа начата, то все этапы
должны быть завершены без перерыва.
1. Закрепите необходимое количество лунок на штативе.
2. Добавьте по 10 мкл стандартов, контролей и образцов одноразовыми наконечниками в
соответствующие лунки.
3. Добавьте по 100 мкл в каждую лунку.
Тщательно перемешайте в течение 10 секунд. Важно добиться полного смешивания на
этом этапе.
4. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре
5. Резко вытряхните содержимое лунок.
Промойте каждую лунку 3 раза рабочим раствором промывочного буфера (400 мкл). Для
удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к абсорбирующей
бумаге.
Важно: чувствительность и точность данного анализа зависит от правильного выполнения
этапа промывки!
6. Добавьте по 100 мкл рабочего раствора ферментного конъюгата в каждую лунку.
7. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре
8. Резко вытряхните содержимое лунок.
Промойте каждую лунку 3 раза рабочим раствором промывочного буфера (400 мкл). Для
9.
10.
11.
12.
удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к абсорбирующей
бумаге.
Добавьте по 100 мкл раствора Субстрата в каждую лунку.
Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре.
Для остановки ферментной реакции добавьте по 50 мкл Стоп-раствора в каждую лунку.
Определите абсорбцию (ОП) каждой лунки при 450 ± 10 нм на микропланшетном
анализаторе. Мы рекомендуем определять ОП в течение 10 минут после добавления стопраствора.
Расчет результатов
1. Определите среднее значение ОП для каждого набора стандартов, контролей и образцов
пациентов.
2. Постройте стандартную кривую со значением абсорбции на вертикальной (Y) оси и
концентрацией стандарта на горизонтальной (Х) оси, указав на ней средние величины
абсорбции, полученные от каждого стандарта.
3. Используя стандартную кривую и средние значения абсорбции образца, определите
соответствующую концентрацию образца (если позволяет оборудование: используйте
автоматический метод расчета результата(например: 4 парам. логистика)
4. Концентрации образцов можно считывать непосредственно со стандартной кривой. Если
концентрация образца выше, чем верхний предел обнаружения, то он должен быть
разбавлен. При этом для расчета концентрации должен быть принят во внимание
коэффициент разведения.
Ниже приведен типичный пример стандартной кривой (не используйте для расчета)
Стандарт
Оптическая плотность при 450 нм
0.18
Нулевой стандарт (0 мкг/мл)
0.38
Стандарт 1 (1 мкг / мл)
0.56
Стандарт 2 (2,5 мкг/ мл)
0.83
Стандарт 3 (5 мкг / мл)
1.44
Стандарт 4 (15 мкг/ мл)
1.80
Стандарт 5 (30 мкг/ мл)
Ожидаемые нормальные значения:
Настоятельно рекомендуется, чтобы каждая лаборатория определила свои границы нормальных
и аномальных значений.
1-й триместр беременности:
Исследована концентрация PAPP-A 238 беременных в 1-ом триместре.
Учитывались масса тела и день беременности. Получено следующее уравнение регрессии:
Медиана (f) PAPP-A = EXP (-2,12268 + 0,06324 * день беременности - 0,00979 * массу тела).
При учете только дня беременности получено следующее уравнение:
Медиана (SST) PAPP-A = EXP (-2,705444 + 0,0618725 * день беременности).
На следующих диаграмме и таблице приведены зависимость медианы от полной недели
беременности (с 8 по 13 неделю). Были проведены расчеты на 3 массы тела: 50 кг, 65 кг (средняя
масса тела) и 100 кг. Для сравнения была определена Медиана ручным методом (Медиана от
недели) и медиана (sst) – без учета массы тела.
см. диаграмму в оригинале инструкции
Полная
День
Медиана
неделя
беременности (sst)
беременности
(мкг/мл)
без учета
веса
59
2.57
8
66
3.97
9
73
6.12
10
80
9.43
11
87
14.55
12
94
22.43
13
Медиана
(f)
(мкг/мл)
Вес 50 кг
Медиана
(f)
(мкг/мл)
Вес 65 кг
Медиана
(f)
(мкг/мл)
Вес 100 кг
Медиана
Неделя
(мкг/мл)
3.06
2.6
1.88
1.5
4.77
4.1
2.92
3.0
7.42
6.4
4.55
6.7
11.55
10.0
7.08
10.5
17.99
15.5
11.03
11.6
28.00
24.2
17.17
14.9
Различные популяции и лабораторные различия могут привести к несколько иным медианам.
Поэтому, каждая лаборатория должна определить и постоянно обновлять свои медианы.
Уравнения регрессии и значений в таблице должны быть использованы в качестве инструкции.
Расчет медианы и / или функций регрессии: для расчета медианы из собственных баз данных
пациентов следует проводить при помощи программного обеспечения для расчетов риска
трисомии 21 хромосомы. Полученные медианы для PAPP-A ELISA не могут быть использованы для
анализов других производителей. Медианы, полученные для PAPP-тестов других производителей,
не могут быть использованы с этим PAPP-A ELISA.
Использование для скрининга синдрома Дауна:
Для расчета риска при пренатальном скрининге концентрации PAPP-А указаны как MOM (multiple
of medians). MOM = измеренная концентрация (PAPP-A) / Медиана PAPP-A.
При синдроме Дауна средний МОМ увеличивается во время первого триместра беременности и
не отличается от нормальной беременности во втором триместре (см. таблицу). Поэтому уровень
PAPP-A должен определяться в первом триместре беременности (с 8 по 13 неделю).
10
11
12
13
14-20
Полная неделя
беременности
0,42
0,50
0,58
1,11
Медиана МОМ 0,34
с
беременностью
синдромом
Дауна
Для расчета риска трисомии 21 хромосомы необходимо определять не только уровень PAPP-A, но
также и другие параметры, такие как свод. ß ХГЧ и NT в первом триместре и / или АФП,
свободный Эстриол и ХГЧ во втором триместре беременности.
Для использования этих параметров для оценки риска трисомии 21 хромосомы необходимо
специальное программное обеспечение. Согласно директиве IVD (98/79/EC), программное
обеспечение и наборы для определения дополнительных показателей должны быть пригодны
для скрининга трисомии 21 и быть СЕ сертифицированы, должен быть указан
идентификационный номер уполномоченного органа на СЕ-маркировку на программное
обеспечение и наборы. Программное обеспечение должно позволять производить расчеты
медиан из значений собственных пациентов.
Необходимо принимать во внимание дополнительные факторы, например: возраст женщины,
вес, этническая группа и курильщик / некурящий. При неправильной оценке срока беременности
может получиться ложный высокий риск (ложноположительный результат). Поэтому важно как
можно более точно определить сроки беременности. Срок беременности, рассчитанный от даты
последнего менструального цикла, не всегда точен. Для точного определения срока
беременности рекомендованы данные УЗИ (копчико-теменной размер (CRL) и бипариетальный
размер (BIP)).
Уровень PAPP-A, полученный в результате пренатального скрининга, свидетельствует только о
риске трисомии 21.
Доказательством трисомии 21 является генетическое исследование.
Диапазон:
Определяемый диапазон анализа: 0,133 мкг/мл - 30 мкг/мл.
Специфичность антител (Кросс-реактивность)
Антитела, используемые для данного анализа, специфичны для PAPP-A человека. Кроссреактивности с другими видами нет.
Отсутствует реакция с видимо нормальной плазмой человека.
Чувствительность: 0,133 мкг/мл.
Интерференция:
Гемоглобин (до 4 мг /мл), Билирубин (до 0,5 мг /мл) и триглицериды (до 30 мг /мл) не влияют на
результат анализа.
Интерференция наркотики:
В настоящее время не известны вещества (наркотики), которые могли бы повлиять на результат
анализа.
Хук-эффект:
Не наблюдается Хук-эффект при концентрации PAPP-A до 300 мкг/мл.