Роль индикации отдельных специфических маркеров вируса
реклама
На правах рукописи МОИСЕЕВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА РОЛЬ ИНДИКАЦИИ ОТДЕЛЬНЫХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В В ОБЕСПЕЧЕНИИ ВИРУСНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 14.00.36 - Аллергология и иммунология 03.00.06 - Вирусология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2006 2 Работа выполнена в ФГУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора и филиале ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.В. Анастасиев кандидат биологических наук Н.В. Зубкова Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор М.И. Михайлов доктор биологических наук А.Г. Лютов Ведущая организация: ФГУН «Государственный научно- исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Роспотребнадзора. Защита диссертации состоится «___» _____________2006 г. в «___» часов на заседании Диссертационного Совета К 208.046.01 при ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Автореферат разослан «___»_________2006 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук Л.И. Новикова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Вирусная безопасность препаратов из плазмы крови обеспечивается многоступенчатым комплексом мер, включающих: отбор доноров; проверку индивидуальных порций плазмы на отсутствие вирусных маркеров; введение в технологический процесс стадий инактивации вирусов и контроль готовых продуктов. Для обнаружения маркеров вирусных инфекций в плазме и препаратах крови в настоящее время используется иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы основаны на разных принципах обнаружения возбудителя и взаимно дополняют друг друга. Однако несмотря на такой контроль сохраняется риск инфицирования пулов плазмы вирусом гепатита В (Kleinman S.H. et al., 2005; Alvarez do Barrio M. et al., 2005; Soldan K. et al. 2005). Это связано с широким распространением заболевания, малой инфицирующей дозой и высокой устойчивостью вируса гепатита В (ВГВ). Для снижения этого риска рекомендовано расширить перечень обязательных тестов при обследовании доноров и контроле готовых продуктов, в частности Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) рекомендовано проводить контроль уровня антител к НВsAg (анти-HBs), концентрация которых в препаратах иммуноглобулинов нормируется. Введение этого дополнительного контроля в нашей стране сдерживается отсутствием отечественных тест-систем для количественного определения анти-HBs. Как показал многолетний опыт, анти-HBs являются фактором защиты. Однако связывание анти-HBs с HBsAg может влиять на результаты анализа, экранируя HBsAg в составе иммунных комплексов. Учитывая погрешности лабораторной диагностики (Джумагулова А.Б. и др., 2001; Нетёсова И.Г. и др., 2005) нерешённой остаётся также проблема по созданию алгоритма тестирования пулов плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов. В монографии «Плазма человека для фракционирования» в Европейской фармакопее 4-го издания предусмотрено тестирование первого гомогенного пула плазмы на HВsAg. Пул плазмы считается пригодным для дальнейшей работы, если в нём не выявлен HВsAg. Национальная фармакопейная статья этого требования не предусматривает. Поэтому усовершенствование алгоритма обследования на присутствие маркеров вируса гепатита В пулов плазмы для фракциони- 4 рования, используемых для получения препаратов иммуноглобулинов, является актуальным. Цель исследования Определить оптимальный алгоритм тестирования пулов плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов на HBsAg, анти-HBs и ДНК ВГВ для обеспечения вирусной безопасности готовых препаратов в отношении гепатита В. Задачи 1. Оценить влияние иммунной нейтрализации на обнаружение HBsAg методом ИФА и количественно охарактеризовать способность специфических антител экранировать НВsAg в пулах плазмы для фракционирования и в препаратах иммуноглобулинов. 2. Изучить влияние процесса формирования иммунных комплексов HBsAg/антиHBs на возможность выявления ДНК ВГВ. 3. Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения анти-НВs. 4. Определить уровень анти-НВs в индивидуальных образцах плазмы крови, пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов. Научная новизна Изучена эффективность выявления НВsAg в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов. Установлено, что одним из основных факторов снижения эффективности выявления HBsAg методом ИФА в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов является иммунная нейтрализация HВsAg антителами. В опытах in vitro показано, что в оптимальных температурных условиях при равновесной концентрации антигена и антител в системе достигается наиболее полная иммунная нейтрализация. В этом случае анти-НВs в количестве 1 МЕ способны связывать не менее 50 нг НВsAg. Исследовано HBsAg/анти-HBs влияние на процесса возможность формирования выявления иммунных HBsAg и комплексов ДНК ВГВ. Продемонстрировано, что процесс формирования иммунных комплексов не влиял на эффективность выявления генома вируса гепатита В методом ПЦР. Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения 5 анти-НВs и рабочий стандарт для калибровки с концентрациями 10, 50 и 100 МЕ/л, для стабилизации которого использована мальтоза. Разработан оригинальный способ очистки HВsAg из сформированного иммунного комплекса HBsAg/анти-HBs. Практическая значимость В результате проведённых исследований разработана технология производства иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Для упрощения расчета количественного содержания антител наряду с традиционным использованием калибровочного графика предложена формула, позволяющая определять содержание анти-НВs только по одному контрольному образцу с концентрацией антител (50 МЕ/л). Тест-система успешно прошла апробацию на базе цеха гаммаглобулинов Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» и государственные испытания в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Проект нормативной документации находится на утверждении в Фармакопейном Государственном комитете. На изобретение «Тест-система для определения анти-HBs в биологическом образце» получена приоритетная справка № 2005107749 от 21.03.05. Сравнение разработанного диагностического набора с зарубежными аналогами показало высокую специфическую активность разработанной тест-системы и целесообразность её использования для количественного определения анти-НВs в плазме (сыворотке) крови при обследовании доноров, для определения напряжённости иммунитета, а также для определения соответствия препаратов иммуноглобулинов стандартам ВОЗ. В фармакопейную статью предприятия на «Имбиоглобулин» (ФСП 42-05044266-04) внесены дополнительные показатели, улучшающие безопасность препарата: контроль уровня антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Основываясь на изученных закономерностях «экранирования» НВsAg специфическими антителами, показано, что определение НВsAg не может считаться достаточным критерием оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов. Рекомендовано внести дополнение в алгоритм мониторинга препаратов иммуноглобулинов – определение анти-HBs. В случае выявления концентрации антител, не соответствующей международным требованиям, необходимо проводить тестирование препаратов иммуноглобулинов на ДНК ВГВ методом ПЦР. 6 Положения, выносимые на защиту 1. Экспериментальные данные, свидетельствующие об эффективности связывания HBsAg специфическими антителами, содержащимися в пулах плазмы для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов. 2. Алгоритм контроля плазмы для фракционирования и препаратов иммуноглобулинов с целью снижения риска передачи вируса гепатита В. 3. Технология изготовления иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Апробация работы Результаты работы представлены на 10-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2002); на II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (С.-Петербург, 2003); на Всероссийской научной конференции молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004); на научной конференции, посвящённой 75-летию Нижегородского НИИЭМ (Н.Новгород, 2004); на VI Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты – проблема эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005). Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного микробиологии им. семинара академика Нижегородского И.Н. Блохиной НИИ с эпидемиологии участием и сотрудников Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» 24 ноября 2005 г. Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Структура и объём диссертации Диссертационная работа в объёме 124 листа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. иллюстрирована 12 Диссертация рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 175 источников литературы (59 отечественных и 116 иностранных). 7 Работа выполнена в отделении НВ-диагностикумов цеха диагностических препаратов Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген» (рук. Зубов С.В.) СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе были использованы следующие материалы: плазма донорская (n=8570), полученная со станций переливания крови Приволжского федерального округа; пулы плазмы для фракционирования объёмом 5,0+0,5 л (n=443), производственные пулы (n=84), модельные пулы плазмы для фракционирования, контаминированные HBsAg (n=60); образцы плазмы донорской (n=100), отбракованной по наличию HВsAg на 5 станциях переливания крови Приволжского федерального округа (гг.. Нижний Новгород, Дзержинск, Чебоксары, Канаш, Киров); образцы сыворотки крови детей, иммунизированных против гепатита В (n=141), полученные в Областном вирусологическом центре г. Нижнего Новгорода; коммерческие препараты иммуноглобулина нормального человеческого для внутримышечного и внутривенного введения (195 серий) отечественных и зарубежных производителей; раствор альбумина 10 %; рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В субтипов ay и ad (НПК «Комбиотех», г.Москва). Антигенные и антительные маркеры вируса гепатита В определяли методом ИФА с помощью диагностических иммуноферментных тест-систем отечественного производства: «ИФА-HBsAg», «ИФА-НВе» (Нижегородский филиал ФГУП «НПО «Микроген», г. Нижний Новгород), «ИФА-HВsAg/м», «ИФА-анти-HBs» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород), «ВектогепВ-HBs-антиген», «ВектоHBsAg-антитела-стрип», «ВектоHBсAg-антитела-стрип» (ЗАО «ВекторБест», г. Новосибирск), а также тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В зарубежного производства: «MONOLISA anti-HBs 3.0» (фирма «BIO-RAD», Франция) в соответствии с инструкциями по применению. Регистрацию результатов проводили с помощью анализатора иммуноферментного «SUNRISE» фирмы ТECAN (Австрия). Количественное определение НВsAg в исследуемых образцах проводили методом 8 ИФА с использованием отраслевого стандартного образца HВsAg вируса гепатита В «ОСО-HВsAg» (ОСО 42-28-311-03П) в программе Microsoft Excel. Определение ДНК ВГВ в плазме, содержащей HВsAg, и в модельных образцах проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Раздел работы был выполнен на базе Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. Выражаем глубокую благодарность заведующему лабораторией молекулярногенетических методов надзора за инфекционными заболеваниями к.б.н. Мазепе В.Н. за оказанную помощь и консультации. Раздел работы по определению ДНК ВГВ методом ПЦР в режиме реального времени был выполнен на базе Центрального НИИ эпидемиологии Минсоцздрава РФ (г. Москва). Выражаем глубокую благодарность заведующему НПЛ ФНМЦ СПИД Минсоцздрава РФ Шипулину Г.А. за оказанную помощь и консультации. При разработке иммуноферментной тест-системы для количественного определения анти-HBs в качестве химических компонентов использовали фосфатно-солевой раствор (ФСР-Т), содержащий 0,9 % NaCl, 0,1 % Na2HPO4, 0,1 % твин-80; раствор 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ); цитратный буферный раствор (рН 3,9-4,1), содержащий 0,015 % перекиси водорода; 1 М раствор кислоты серной (стоп-реагент). При получении очищенного HВsAg в качестве исходного материала использовали плазму крови доноров-антигеноносителей с титром HBsAg 1:2000 и выше. Титр HBsAg определяли при помощи реакции обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА) с использованием эритроцитарного диагностикума «РОПГА-HВsAg» (Нижегородский филиал ФГУП «НПО «Микроген»). HВsAg получали двумя способами: физико-химическим способом [Михайлов М.И., 1980] и разработанным с нашим участием методом осаждения иммунных комплексов. Концентрацию HBsAg в очищенном препарате определяли спектрофотометрическим методом по формуле: Е1 мг/мл, 280 нм = 3,76 [Bourbonnais R. et al., 1975]. При изготовлении иммуносорбента применялся метод «пассивной» адсорбции [Стендифер Д.К., 1988]. В качестве твёрдого носителя использовали планшеты полистироловые для биохимических исследований отечественного производства «ГосНИИ «Медполимер», ООО «Биомедикал» (г. Москва) и планшеты фирмы «Nunc» (Дания); выделенный из плазмы крови доноров- 9 вирусоносителей НВsAg и рекомбинантный НВsAg (субтипы ay и ad) (НПК «Комбиотех», г. Москва). Конъюгат HВsAg с пероксидазой хрена RZ 3.0 (фирмы «Сигма», США) получали перйодатный методом [Егоров А.М., 1991]. Полученный конъюгат хранили в виде 10-кратного концентрата в 50%-ном растворе глицерина с добавлением сыворотки крови доноров. Для получения контрольного отрицательного образца (К-) нормальную донорскую плазму (не содержащую маркеров вируса гепатита В, антител к ВИЧ1,2 и к вирусу гепатита С) инактивировали прогреванием, добавляли трихлорметан и центрифугировали в течение 1 ч при 18000 об/мин. В качестве консерванта использовали фенол. Для получения контрольных положительных образцов использовали нормальную донорскую плазму, в которую добавляли иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения (производства Нижегородского филиала ФГУП «НПО «Микроген», ФСП 42-0100178901). В качестве стабилизатора вносили 2-10 % мальтозы. В качестве стандарта для определения концентрации анти-HBs в контрольных положительных образцах использовали разведения отраслевого стандартного образца иммуноглобулина человека против вируса гепатита В (ОСО 42-28-320-00). Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью персонального компьютера с применением программы Microsoft Excell (раздел описательная статистика). Анализ данных проводили при уровне надёжности 95 %. Результаты и их обсуждение Особенности выявления НВsAg в пулах плазмы для фракционирования Контроль пулов плазмы для фракционирования на присутствие HBsAg позволяет оценить качество скрининга индивидуальных донаций, поступающих на предприятия фракционирования, минимизировать присутствие вируса гепатита В в производственных пулах плазмы и снизить вероятность попадания его в конечные препараты иммуноглобулинов. Предварительный анализ состояния рынка показал, что, несмотря на имеющийся широкий выбор тест-систем, отсутствуют наборы с декларированной 10 возможностью определения НВsAg в пулах плазмы для фракционирования. Поэтому перед нами стояла задача оценить тест-системы, производимые Нижегородским филиалом «НПО «Микроген», и установить факторы, влияющие на эффективность выявления НВsAg в пулах плазмы. Первоначально индивидуальных необходимо донаций в было пулах установить, плазмы для влияет ли смешивание фракционирования на специфическую активность тест-систем «ИФА-HВsAg». Для этого из негативных по НВsAg индивидуальных образцов плазмы формировали 20 производственных пулов объемом 5,0±0,5 л (путём смешивания 24±4 индивидуальных донаций) и 20 аналогичных модельных пулов (путём смешивания по 1 мл плазмы), затем тестировали их методом ИФА с использованием вышеуказанных тест-систем с чувствительностью 0,06-0,1 нг/мл. Результаты анализа модельных и производственных пулов совпали, ложноположительных результатов не выявлено. Для оценки эффективности выявления НВsAg в пулах плазмы формировали модельные пулы, смешивая по 1 мл 19-27 нормальных (негативных) образцов с 1мл заведомо положительного по HВsAg индивидуального образца донорской плазмы. Положительные образцы, используемые для формирования модельных пулов (n=10), разделили на две группы: с исходной концентрацией HВsAg менее 100 нг/мл (24, 54, 60, 80 нг/мл) и более 100 нг/мл (140, 190, 700, 1540, 5800, 24960 нг/мл). Показано, что эффективность выявления НВsAg для всех пулов, контаминированных НВsAg-содержащими образцами с концентрацией НВsAg более 100 нг/мл, и для пулов из 19 донаций, контаминированных положительными образцами плазмы с концентрацией НВsAg менее 100 нг/мл, составляла 100 %. При внесении плазмы с концентрацией НВsAg менее 100 нг/мл в пул из 27 донаций, НВsAg обнаруживался только в 80 % случаев (табл.1). Как свидетельствовали полученные данные, одной из причин снижения эффективности выявления НВsAg в пулах плазмы было разведение антигена плазмой, не содержащей этого маркера. В то же время это обстоятельство не объясняло, почему в случае добавления положительного образца с концентрацией НВsAg 24 нг/мл антиген был выявлен в пулах плазмы, а при добавлении образца с концентрацией НВsAg 54 нг/мл антиген выявить не удалось. 11 Таблица 1 Эффективность выявления НВsAg методом ИФА в пулах плазмы (n=60) Кол-во модельных пулов Кол-во индивидуальных донаций доноров в 1 пуле Результаты тестирования пулов Эффективность выявления, (%) Негативных Позитивных (концентрация HBsAg) Отр. Пол. 20 19 1 (>100 нг/мл) 0 10 100 20 27 1 (>100 нг/мл) 0 10 100 10 19 1 (<100 нг/мл) 0 10 100 10 27 1 (<100 нг/мл) 2 8 80 Установлено, что это не было связано с аналитической чувствительностью используемых тест-систем. Аналогичные результаты были получены на тестсистемах трёх производителей. В связи с этим было сделано предположение, что одной из причин этого явления было присутствие в пулах плазмы анти-НВs, которые нейтрализовали НВsAg, тем самым исключая его из реакционной смеси. Эта проблема подробно будет рассмотрена ниже. В то же время возникал вопрос, насколько часто встречаются донации, контаминированные НВsAg в концентрации 100 нг/мл и выше, которые можно обнаружить в мини-пулах и исключить их из фракционирования. Как показали наши исследования (рис. 1), среди отбракованных по НВsAg донаций более чем в 85 % случаев концентрация НВsAg была выше 100 нг/мл и только 9,3 % доноров-вирусоносителей имели концентрацию НВsAg в плазме менее 100 нг/мл. Таким образом, по результатам распределения концентрации НВsAg у доноров-вирусоносителей, а также, учитывая, что на предприятия фракционирования обычно поступает плазма, прошедшая первичный скрининг, нами рассчитан риск получения плазмы с концентрацией НВsAg менее 100 нг/мл. Он является достаточно низким и составляет 1 случай на 92150 индивидуальных донаций. 12 Распределение концентрации HBsAg Частота встречаемости (%) 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 1 10 2 100 3 1000 4 10000 5 100000 1000000 6 Концентрация HBsAg (нг/мл) Рис. 1. Распределение концентраций НВsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей Приволжского федерального округа Учитывая, что эффективность выявления таких образцов в пулах плазмы от 24+4 доноров находится на уровне 80 %, риск контаминации плазменного пула поверхностным антигеном вируса гепатита В ниже уровня детекции составлял по нашим данным приблизительно 1 случай на 19197 мини-пулов. Для снижения риска контаминации пулов плазмы НВsAg маркерами гепатита В мы попытались использовать метод ПЦР. Однако результаты предварительного исследования модельных пулов, контаминированных НВsAg- и ДНК ВГВ-позитивными образцами с невысокой концентрацией антигена (менее 100 нг/мл), показали, что эффективность выявления маркеров ВГВ не улучшилась. При тестировании модельных пулов методом ИФА выявление НВsAg в пробах составило 85 %, а выявление ДНК ВГВ методом ПЦР составило менее 30 %. Это можно объяснить ингибированием полимеразы, а также тем, что концентрация НВsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей обычно многократно превышает концентрацию полных вирусных частиц [Майер К.-П., 1999]. Поэтому эффективность выявления НВsAg в пулах плазмы от 20-28 доноров признана удовлетворительной, а тест на НВsAg обязательным для оценки вирусной безопасности пулов плазмы. 13 Нейтрализация поверхностного антигена вируса гепатита В специфическими антителами Одной из основных причин снижения эффективности выявления НВsAg явилось присутствие вируснейтрализующих анти-НВs. Поэтому перед нами стояла задача в опытах in vitro изучить динамику образования иммунных комплексов НВsAg/анти-НВs и количественно охарактеризовать способность специфических антител экранировать НВsAg в пулах плазмы и препаратах иммуноглобулинов. Для этой цели в качестве источника антител были иммуноглобулинов с содержанием анти-НВs использованы препараты (770+20 МЕ/л), предварительно разбавленные нормальной донорской плазмой до содержания анти-НВs 10 МЕ/л, а в качестве источника НВsAg использован отраслевой стандарт «ОСО-HВsAg» (ОСО 42-28-311-03П). соотношении 1/10. Растворы иммуноглобулина Контрольный опыт, и ОСО смешивали подтверждающий в отсутствие неспецифического связывания антигена, выполнили на 10 % растворе альбумина. Как свидетельствовали полученные результаты, нейтрализация антигена зависела от концентрации НВsAg в системе и времени инкубации исследуемых проб. Наиболее полно нейтрализация НВsAg происходила через 24 часа при температуре 37 ºC при условии равновесной концентрации антигена и антител в системе, в этом случае 1 МЕ анти-НВs был способен связывать неопределяемого методом ИФА уровня не менее 50 нг НВsAg. до При избытке антигена в системе, несмотря на иммунную нейтрализацию, НВsAg выявлялся в растворах (рис.2). 2 Исходная концентрация НВsAg НВsAg, нг/мл 1,5 Количество связанного НВsAg 1 0,5 0 0,23 нг/мл 0,45 нг/мл 0,9 нг/мл 1,8 нг/мл Условия проведения модельных опытов Рис.2. Уровень связывания НВsAg антителами при различной концентрации его в исходных пробах 14 Аналогичные результаты были получены с препаратами иммуноглобулинов, в которые добавляли вируссодержащую плазму (табл.2). Таблица 2 Нейтрализация HВsAg специфическими антителами, содержащимися в препаратах иммуноглобулина Количество связанного HВsAg, нг/мл Исходная концентрация (С) HВsAg в модельных образцах, нг/мл M+m % от исходного M+m % от исходного 6 полная ** 100,0 полная ** 100,0 24 полная ** 100,0 полная ** 100,0 49 48,8±0,9 99,5 полная ** 100,0 195 159±20 81,5 194±1,3 99,5 781 431±63 55,2 675±106 86,4 1562 812±129 52,0 921±129 59,0 3125 734±146 23,5 1515±343 48,5 6250 750±283 12,0 950±234 15,2 12500 25000 50000 через 2 ч при 37 ºС не выявлено* не выявлено* не выявлено* через 24 ч при 37 ºС не выявлено* не выявлено* не выявлено* 0 0 0 0 0 0 * не выявлено статистически достоверных изменений концентрации НВsAg р>0,05) ** нейтрализация HВsAg до неопределяемого методом ИФА уровня В соответствии с классическими закономерностями процесса формирования иммунных комплексов при низкой концентрации НВsAg (менее 49 нг) и существенном избытке специфических антител происходила полная нейтрализация до неопределяемого методом ИФА уровня. Дальнейший его рост концентрации антигена до 1562-3125 нг способствовал увеличению количества 15 сформированных иммунных комплексов до тех пор, пока не достигал зоны эквивалентности: количество антигена примерно равнялось количеству доступных мест связывания на антителах. При существенном избытке антигена (более 25 мкг/мл) процесс нейтрализации был неэффективным и не приводил к статистически значимому изменению концентрации НВsAg в реакционной смеси. Учитывая, что в процессе выделения иммуноглобулинов происходит концентрирование анти-НВs-антител и, одновременно, очистка от вирусов и НВsAg [Анастасиев В.В., 2000] ставится под сомнение корректность применения теста на НВsAg в ИФА для контроля вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов согласно отечественных Фармакопейных статей. Сравнение методов ИФА и ПЦР при оценке маркеров вируса гепатита В в модельных опытах Нами были проведены сравнительные исследования определения НВsAg и ДНК ВГВ в препаратах иммуноглобулинов, контаминированных вируссодержащей плазмой с высоким содержанием НВsAg (около 1 мг/мл) и ДНК ВГВ (9,3*108 копий/мл). В препараты иммуноглобулинов вносили вируссодержащую плазму донора-вирусоносителя, разведенную в 50000 – 400000 раз. Тестирование опытных проб проводили через 15 минут и после инкубации при 37°С в течение 24 часов (табл. 3). Таблица 3 Сравнение методов ИФА и ПЦР для оценки вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов Результат тестирования проб Титр вируссодержащей плазмы на НВsAg методом ИФА через на ДНК ВГВ методом ПЦР 15 мин через 24 часа при 37°С через 15 мин через 24 часа при 37°С 50 000 + - + + 100 000 +/- - + + 200 000 - - + + 400 000 +/+/(-) отрицательный; (+) положительный; (+/-) слабоположительный 16 ДНК ВГВ была обнаружена во всех пробах. В то же время НВsAg через 24 часа не выявлялся ни в одной из проб, а при немедленном тестировании был выявлен в пробах с меньшими разведениями вируссодержащей плазмы. Моделируя искусственно контаминацию иммуноглобулинов маркерами вируса гепатита В, выявлено, что, даже в этом случае специфические антитела в них содержались в избытке и активно связывали НВsAg. В то же время присутствие иммунных комплексов не мешало выявлению вирусного генома. Поэтому введение мониторинга анти-НВs и ДНК ВГВ при оценке качества препаратов иммуноглобулинов даст большую информацию об их вирусной безопасности. Разработка тест-системы для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В Для определения уровня анти-HBs в сыворотке (плазме) крови человека и в препаратах иммуноглобулинов была разработана иммуноферментная тест-система, в основу которой положен принцип одностадийного прямого «сэндвич»-анализа. Особенностью тест-системы являлось то, что для изготовления иммуносорбента и конъюгата использован высокоочищенный плазменный антиген свободный от ДНК вируса гепатита В, позволяющий (НВsAg), с максимальной чувствительностью и специфичностью выявлять анти-НВs. Для этого разработан способ приготовления очищенного HВsAg из иммунного комплекса. Он включал инактивацию вирусов в плазме пастеризацией, очистку НBsAg физико- химическими методами, выделение комплекса НВsAg/анти-HBs, очистку HBsAg из комплекса с помощью гидролиза пепсином и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Для получения иммуносорбента использовали 96-луночный разборный планшет для ИФА, в лунках которого сорбировали НВsAg. Была проведена сравнительная оценка чувствительности тест-систем при нанесении на планшеты антигенов в трех вариантах: только НВsAg, выделенного из плазмы крови доноров-вирусоносителей; «плазменного» НВsAg в сочетании с рекомбинантным НВsAg субтипа ad в соотношении 3 : 1; и рекомбинантного НВsAg субтипов ay и ad в соотношении 1:1. Чувствительность тест-системы оценивали по калибровочным кривым, построенным по отраслевому стандартному образцу иммуноглобулина человека против вируса гепатита В (ОСО 42-28-320-00) с 17 концентрацией 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200 МЕ/л.. Чувствительность тест-системы, изготовленной с использованием только «плазменного» HBsAg составляла 5,8+2,6 МЕ/л, что было достоверно выше, чем при использовании «плазменного» антигена в комбинации с рекомбинантным или только рекомбинантного. Чувствительность в этом случае была 11,0+2,1 МЕ/л и 14,5+4,3 МЕ/л соответственно. Чтобы выбрать оптимальные условия сорбции, оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при различных концентрациях антигена в растворе: 1, 2, 4 и 8 мкг/мл. В качестве тестируемых образцов использовали контрольные образцы: К+ и К-. Максимальные различия между значениями оптической плотности (ОП) в контрольном положительном образце (К+) и величиной фоновых значений в лунках, куда вносили контрольный отрицательный образец (К-), не содержащий анти-HBs, наблюдались при двух концентрациях раствора антигена, используемого для сорбции - 2 и 4 мкг/мл. Поскольку при концентрации 2 мкг/мл значение ОП К- было ниже, а ОП в К+ практически не отличалось от такового при концентрации 4 мкг/мл, концентрация 2 мкг/мл была сочтена оптимальной и использована в дальнейшей работе. На следующем этапе работы подбирали оптимальные разведения конъюгата - HBsAg - пероксидаза хрена. Контрольные образцы должны были иметь следующие показатели оптической плотности: ОП К+ не ниже 0,500 о.е., ОП К- – не выше 0,150 о.е. Первоначально для приготовления конъюгата использовали тот же антиген, что и для приготовления иммуносорбента. Однако при оптимальном рабочем разведении конъюгата 1:20 значение ОП К+ составило менее 0,300 о.е., что не соответствовало заданным условиям. Вероятно, это было связано с тем, что при физико-химическом способе очистки НВsAg могли повреждаться участки связывания с пероксидазой хрена. В связи с этим нами был использован НВsAg, очищенный оригинальным способом осаждения иммунного комплекса. При исследовании конъюгата, приготовленного с использованием очищенного данным способом антигена, результаты, соответствующие заданным условиям были получены при рабочем разведении 1:500. Для изготовления контрольных положительных образцов (К+10, К+50, К+100) нами предложен состав стабилизирующего матричного раствора, содержащий 18 нормальную донорскую плазму и мальтозу в концентрации 2-10%, позволивший сохранять их активность на протяжении срока наблюдения (9 месяцев). При определении концентрации анти-HBs с целью упрощения интерпретации результатов предложено использование формулы. При сравнении двух способов определения концентрации анти-HBs: с помощью построения графика и с использованием предложенной формулы показано, что относительная разность между значениями концентраций анти-HBs, полученных по графику и по формуле, была статистически не значима и не превышала для плазмы крови 5,3 % (t=0,698; p=0,05), а для препаратов иммуноглобулинов 1,84 % (t=1,394; p=0,05). При апробации тест-системы мы исследовали уровень поствакцинального иммунитета в 141 образце сыворотки крови здоровых вакцинированных против гепатита В детей. Было выявлено 11 негативных образцов (7,8%), не содержащих анти-НВs или содержащих ниже предела детекции (менее 5 МЕ/л). Аналогичные результаты были получены с использованием зарубежной тест-системы для количественного определения антител к HBsAg «MONOLISA ANTI-HBs 3.0» (рис.3). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% анти-HBs-позитивные образцы анти-HBs-негативные образцы "ИФА анти-HBs" ("ИмБио") «MONOLISA ANTIHBs» Рис. 3. Соотношение серонегативных и серопозитивных образцов при тестировании на двух тест-системах. В серопозитивных образцах изучено распределение концентраций анти-HBs с использованием двух тест-систем (табл. 4). 19 Таблица 4 Результаты определения концентрации антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в образцах сыворотки крови вакцинированных детей (n=130) Концентрация анти-HBs, МЕ/л Разработанная тест-система «MONOLISA ANTI-HBs» n % n % Менее 10 2 1,5 2 1,5 10-100 45 34,7 53 40,7 101-1000 48 36,9 47 36,2 Более 1000 35 26,9 28 21,6 Из таблицы видно, что при тестировании на двух тест-системах были получены совпадающие результаты для образцов сывороток с концентрацией антиНВs менее 10 МЕ/л, и сходные данные для диапазона концентраций от 10 до 1000 МЕ/л и более. Таким образом, по результатам оценки специфической активности с использованием ОСО иммуноглобулина человека, а также по результатам сравнительных испытаний с тест-системой «MONOLISA ANTI-HBs 3.0» показано, что разработанная тест-система может быть использована для количественного определения анти-НВs в сыворотке, плазме крови и препаратах иммуноглобулинов. В настоящее время тест-система успешно прошла государственные испытания в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Определение уровня анти-HBs в плазме для фракционирования и препаратах иммуноглобулинов В соответствии с требованиями Европейской фармакопеи препараты иммуноглобулинов должны содержать анти-НВs не менее 0,5 МЕ/г белка, то есть гарантировать определённое количество антител. С помощью разработанной тест-системы была определена концентрация анти-HBs в индивидуальных образцах донорской плазмы крови, мини-пулах плазмы для фракционирования объёмом 5,0±0,5 л, в производственных пулах плазмы и в препаратах иммуноглобулинов отечественного и зарубежного производства. 20 Показано, что анти-НВs-позитивными были 32,4 % индивидуальных образцов плазмы крови, концентрация анти-HBs в которых распределялась следующим образом: 23 % имели низкую концентрацию анти-HBs - от 2-5 до 10 МЕ/л, 32 % - среднюю концентрацию (от 10 до 100 МЕ/л), 42 % - высокую концентрацию (от 101 до 1000 МЕ/л) и 3 % - концентрацию анти-HBs более 1000 МЕ/л (рис.4). Частота встречаемости, % 35 30 25 20 15 10 5 0 менее 10 10-100 101-500 501-1000 более 1000 Концентрация анти-HBs, МЕ/л Рис. 4. Распределение концентраций анти-НВs в индивидуальных образцах плазмы крови Анти-НВs были выявлены в 96,16 % мини-пулах плазмы для фракционирования. Все производственные пулы, как и следовало ожидать, также содержали антиHBs, но в разной концентрации - от 99 до 1655 МЕ/л (средняя концентрация 431±311 МЕ/л). Учитывая, что концентрация специфических антител к вирусу гепатита В при производстве иммуноглобулинов увеличивается в 2,6 – 6,2 раза, в зависимости от вида препарата, было закономерным, что все исследованные серии иммуноглобулинов содержали анти-НВs в концентрации более 0,5 МЕ/г белка. Кроме того, показано, что уровни анти-НВs в отечественных препаратах практически не отличались от аналогичных показателей качества зарубежных препаратов и соответствовали требованиям Европейской фармакопеи (табл. 5). 21 Таблица 5 Содержание антител к НВs-антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов Наименование препарата n серий Содержание анти-НВs (М±σ) МЕ/л МЕ/г белка 18 2654±1342 26,54±13,42 144 1132±464 22,64±9,28 4 1382±654 27,64±13,08 «Пентаглобин» (Германия) 7 2607±802 52,14±16,06 «Интраглобин» (Германия) 6 2219±630 44,38±12,62 «Октагам» (Австрия) 4 2366±919 47,32±18,38 «Хумаглобин» (Венгрия) 3 1142±688 22,84±13,76 3 2781±387 55,62±7,75 концентрации анти-НВs Иммуноглобулин человека нормальный («ИмБио») Иммуноглобулин для внутривенного введения («ИмБио») «Иммуновенин» (г.Уфа) «Ig VENA» (Италия) р=0,05 Однако, существенные колебания в производственных пулах, а также риск, связанный с возможностью контаминации исходной плазмы и формирования иммунных комплексов анти-НВs/НВsAg, свидетельствовали о том, что для того, чтобы гарантировать это соответствие, необходимо в контроль качества иммуноглобулинов ввести обязательный тест на анти-HBs. Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что результатом выполненной работы стала разработка алгоритма контроля пулов плазмы и препаратов иммуноглобулинов на предприятиях фракционирования. Предложен оптимальный размер плазменного пула (5,0+0,5 л от 20-28 донаций) с учетом особенностей производства и эффективности выявления НВsAg. Экспериментально подтверждена нецелесообразность тестирования препаратов иммуноглобулинов на НВsAg. Для подтверждения соответствия отечественных препаратов иммуноглобулинов международным требованиям необходимо определение уровня анти-НВs. С этой целью разработана иммуноферментная тест-система для 22 количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. ВЫВОДЫ. 1. Установлено, что одним из основных факторов снижения эффективности выявления НВsAg в пулах плазмы для фракционирования является присутствие анти-НВs. 2. В модельных опытах показано, что специфическими антителами процесс нейтрализации НВsAg зависит от концентрации антигена в смеси. В оптимальных условиях анти-НВs в количестве 1 МЕ способны связывать не менее 50 нг НВsAg. 3. На основе изученных закономерностей «экранирования» НВsAg антителами следует считать недостаточным критерием препаратах иммуноглобулинов. анти-НВs- отсутствие НВsAg в В связи с этим в алгоритм мониторинга препаратов необходимо ввести определение анти-HBs. В случае несоответствия уровня анти-HBs международным требованиям проводить тестирование иммуноглобулинов на ДНК ВГВ методом ПЦР. 4. Экспериментально продемонстрировано, что формирование иммунных комплексов HBsAg/анти-HBs не оказывает влияния на способность метода ПЦР выявлять ДНК ВГВ в препаратах иммуноглобулинов. 5. Разработан оригинальный способ получения HВsAg осаждением из иммунных комплексов. 6. Разработана определения иммуноферментная анти-HBs в плазме тест-система (сыворотке) для крови количественного и препаратах иммуноглобулинов. Стабилизация жидкого рабочего стандарта для калибровки с концентрацией анти-HBs 10, 50 и 100 МЕ/л мальтозой позволила сохранять его активность на протяжении срока наблюдения. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Зубкова Н.В., Анастасиев В.В., Моисеева М.А., Зубов С.В. Нейтрализация поверхностного антигена вируса гепатита В препаратами иммуноглобулинов // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунол.-2006.-№ 2.-С.60-65. 23 2. Зубкова Н.В., Зубов С.В., Моисеева М.А. Разработка ИФА-тест-системы для количественного определения анти-HBs в сыворотке крови и препаратах иммуноглобулинов // Международный конгресс «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы»: Тезисы докладов.- С.-Пб. 2003.С.12-13. 3. Зубкова Н.В., иммуноферментной Зубов С.В., тест-системы Моисеева «ИмБио М.А. анти-HBs» для Использование количественного определения антител к вирусу гепатита В // Мир вирусных гепатитов.-2003.-№ 9.С. 9-13. 4. Зубкова Н.В., Моисеева М.А., Зубов С.В., Анастасиев В.В. Определение уровня нейтрализации поверхностного антигена вируса гепатита В специфическими антителами // VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005.С.116-118. 5. Зубкова Н.В., Спиридонова Н.А., Моисеева М.А. Проблема вирусной безопасности препаратов из плазмы крови: входной и выходной производственный контроль на маркёры вирусных гепатитов // Всероссийская научная конференция молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии»: Тезисы докладов.- Уфа, 2004.-С.238240. 6. Зубов С.В., Егорова Н.И., Моисеева М.А., Зубкова Н.В., Кузнецов К.В. Распределение концентрации HBsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей // VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005.-С.118-120. 7. Моисеева М.А., Зубкова Н.В. Определение антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов // Всероссийская научная конференция молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии»: Тезисы докладов.Уфа, 2004.- С.235-236. 24 8. Моисеева М.А., Зубкова Н.В., Зубов С.В. Выявление маркеров парентеральных вирусных гепатитов среди различных групп детей Нижегородской области // Материалы научной конференции, посвящённой 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний».- Н.Новгород, 2004.- С.38-43. 9. Моисеева М.А., Зубкова Н.В., Зубов С.В. Оценка специфического иммунитета против гепатита В у персонала, работающего с кровью // II научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера»: Тезисы докладов.Новосибирск, 2002.- С.43. 10. Моисеева М.А., Зубкова Н.В., Спиридонова Н.А., Зубов С.В. Определение маркеров гемотрансмиссивных инфекций в препаратах крови // VI Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов.- М., 24-26 мая 2005.-С.212-214. 11. Zubkova N.V., Moiseyeva M.A. Anti-HBs content in the intravenous Immunoglobulin preparation at different viruses inactivation methods // Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. 2002. – т.6.- №1.- С.189.