(Автосохраненный) - Видеоархив МГУ имени М.В.Ломоносова
advertisement
Лекция 7. Биофизика сократительных систем и рецепции МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ Н. Б. ГУСЕВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Введение. Различные формы подвижности характерны практически для всех живых организмов. В ходе эволюции у животных возникли специальные клетки и ткани, главной функцией движения. которых является Мышцы осуществление являются высоко специализированными органами, способными за счет гидролиза АТФ формирваьб механические усилия и обеспечивать перемещение тела в пространстве. Важно, что в основе механизма сокращения система мышц лежит перемещения координированная белковых нитей (филаментов), построенных в основном из актина и миозина. Структура мышц. Для эффективного преобразования энергии АТФ в механическую работу мышцы должны упорядоченной обладать структурой. строго Посмотрите, упаковка сократительных белков в мышце в чемто сравнима с упаковкой атомов и молекул в составе кристалла. Рассмотрим подробнее строение скелетной мышцы (рис. 1). Веретенообразная мышца состоит из пучков мышечных волокон. Зрелое мышечное волокно практически полностью миофибриллами – заполнено цилиндрическими образованиями, сформированными из системы перекрывающихся толстых и тонких нитей, образованных Обратите скелетных сократительными внимание, мышц что в белками. миофибриллах наблюдается правильное чередование более светлых и более темных участков. Поэтому часто скелетные мышцы называют поперечнополосатыми. Миофибрилла состоит из одинаковых повторяющихся элементов, так называемых саркомеров (см. рис. 1). Саркомер ограничен с двух сторон Z-дисками. К этим дискам с обеих сторон прикрепляются тонкие актиновые нити. Обратите внимание, что нити актина обладают низкой плотностью и поэтому под микроскопом кажутся более прозрачными или более светлыми. Эти прозрачные, светлые области, располагающиеся с обеих сторон от Zдиска, получили название изотропных зон (или I-зон) (см. рис.1). В середине саркомера располагается система толстых нитей, построенных преимущественно из другого сократительного белка, миозина. Рис. 1. Ультраструктура сократительного аппарата и иллюстрация модели скользящих нитей (по [5] с изменениями) Эта часть плотностью саркомера и обладает образует большей более темную анизотропную зону (или А-зону). В ходе способным сокращения миозин взаимодействовать с становится актином и перемещает нити актина к центру саркомера (см. рис. 1). Вследствие такого движения уменьшается длина каждого саркомера и, соответственно, всей мышцы в целом. Важно отметить, что при такой системе инициации движения, название системы скользящих получившей нитей, не изменяется длина нитей (ни нитей актина, ни нитей миозина). укорочение Обратите является внимание, следствием что лишь перемещения нитей друг относительно друга. Сигналом для начала мышечного сокращения является повышение концентрации Са2+ внутри клетки. Концентрация регулируется с кальция помощью в клетке специальных кальциевых насосов, встроенных в наружную мембрану и мембраны саркоплазматического ретикулума, который оплетает миофибриллы (см. рис. 1). Рассмотрение представленной схемы дает понимания клеточных основ этого процесса, но далее обратимся к анализу свойств основных сократительных белков. Строение и свойства актина. Белок актин был открыт в 1948 году венгерским биохимиком Бруно Штраубом. Название этот белок получил из-за своей способности активировать (отсюда актин) гидролиз АТФ, катализируемый миозином. Актин обнаружен практически во всех клетках животных и растений. Этот белок очень консервативен. Мономеры актина (их часто называют Gактином, то есть глобулярным актином) могут взаимодействовать друг с другом, образуя так называемый фибриллярный (или F-актин). Полимеризацию можно инициировать повысив концентрацию одно- катионов добавив или или двухвалентных специальные белки. Процесс полимеризации становится возможным потому, что мономеры актина могут узнавать друг друга и образовывать межмолекулярные контакты. Рис. 2. Строение актинового филамента (а), влияние актин-связывающих полимеризацию G-актина белков и на образование структурных элементов цитоскелета (б). Для иллюстрации асимметрии глобулярного актина и полярности нити фибриллярного актина часть шарика актина заштрихована (по [6] с модификациями) Полимеризованный актин внешне похож на две скрученные друг относительно друга нитки бус, где каждая бусина представляет собой мономер актина (рис. 2, а). Обратите внимание, что молекула актина далеко не симметрична, поэтому для того, чтобы стала видна эта асимметрия, часть шарика актина на рис. 2, б затемнена. Процесс полимеризации актина строго упорядочен, и мономеры актина упаковываются в полимер только в соответствии с определенной ориентацией. расположенные Поэтому на одном мономеры, конце полимера, повернуты к растворителю одним, например, темным концом, а мономеры, расположенные на другом конце полимера, обращены к растворителю другим (светлым) концом (рис. 2, б). Вероятность присоединения мономера на темном и светлом концах полимера различна. Тот конец полимера, где скорость полимеризации больше, называют плюс-концом, а противоположный конец полимера обозначают как минус-конец. Актин является уникальным строительным материалом, широко используемым клеткой для построения различных элементов цитоскелета и сократительного аппарата. Использование актина для строительных нужд клетки обусловлено тем, что процессы полимеризации и деполимеризации актина можно легко регулировать с помощью специальных, связывающихся с актином белков. Известны белки, связывающиеся с мономерным актином (например, профилин, рис. 2, б). Эти белки, в комплексе с глобулярным актином, препятствуют его полимеризации. Существют специальные белки, которые, как ножницы, разрезают уже сформировавшиеся нити актина на более короткие фрагменты. Некоторые белки преимущественно связываются и формируют шапочку (“кепируют” от английского слова “cap”, шапка) на плюс-конце полимерного актина. Другие белки кепируют минус-конец актина. Обнаружены белки, которые могут сшивать уже сформировавшиеся нити актина, образуя либо крупноячеистые гибкие сети, либо упорядоченные жесткие пучки нитей актина (рис. 2, б). Как мы уже знаем, все нити актина в саркомере имеют постоянную длину и правильную ориентацию, при этом плюс-концы филаментов располагаются в Z-диске, а минусконцы – Вследствие в центральной такой части упаковки расположенные в левой саркомера, имеют и саркомера. нити актина, правой частях противоположную направленность (это показано ранее на рис. 1 в виде противоположно направленных галочек на нитях актина в нижней части рис. 1). Строение и свойства миозина. В настоящее время известно несколько различных видов молекул миозина. Рассмотрим строение наиболее подробно изученного миозина скелетных мышц (рис. 3, а). В состав молекулы миозина входят шесть полипептидных цепей – две так называемые тяжелые цепи миозина и четыре легкие цепи миозина (ЛЦМ). Эти цепи прочно ассоциированы друг с другом нековалентными связями и образуют единый ансамбль, который собственно и является молекулой миозина. Тяжелые цепи миозина характеризуются большой молекулярной массой (200 000–250 000) и сильно асимметричной структурой (рис. 3, а). У каждой тяжелой цепи есть длинный спиральный «хвост и маленькая компактная грушевидная «головка. Хвосты тяжелых цепей миозина скручены между собой наподобие каната (рис. 3, а). Рис. 3. Строение молекулы миозина скелетных мышц (а) и упрощенная схема одной из возможных моделей упаковки миозина в биполярный толстый филамент (б) (по [7] с модификациями) Этот канат обладает довольно высокой жесткостью, и поэтому хвост молекулы миозина образуют палочкообразные структуры. В нескольких местах жесткая структура хвоста нарушена и там располагаются так называемые шарнирные подвижность участки, отдельных обеспечивающие частей молекулы миозина. Шарнирные участки молекулы легко подвергаются расщеплению под действием протеолитических (гидролитических) ферментов, что приводит к образованию фрагментов, сохраняющих определенные свойства неповрежденной молекулы миозина (рис. 3, а). В области перехода грушевидной головки тяжелой цепи миозина в спиральный хвост (шейка), располагаются короткие легкие цепи миозина, имеющие молекулярную массу 18 000– 28 000 (эти цепи изображены в виде дуг на рис. 3, а). С каждой головкой тяжелой цепи миозина связаны одна регуляторная (красная дуга) и одна существенная (синяя дуга) легкая цепь миозина. Обе легкие цепи миозина тем или иным способом влияют на способность миозина взаимодействовать с актином и участвуют в регуляции мышечного сокращения. Палочкообразные «хвосты могут формировать комплекс (слипаться друг с другом) за счет электростатических взаимодействий (рис. 3, б). При этом молекулы миозина могут располагаться либо параллельно, либо антипараллельно друг относительно друга (рис. 3, б). Обратите внимание, что параллельные молекулы миозина смещены друг относительно друга на определенное расстояние. При этом головки вместе со связанными с ними легкими цепями миозина цилиндрической располагаются поверхности на (образованной хвостами молекул миозина) в виде своеобразных выступов-ярусов. Хвосты миозина скелетных мышц могут упаковываться как в параллельном, так и в антипараллельном параллельной и направлении. Комбинация антипараллельной упаковок приводит к формированию так называемых биполярных (то есть двухполюсных) филаментов миозина (рис. 3, б). Такой филамент включает примерно из 300 молекул миозина, причем половина молекул миозина ориентирована головами в одну сторону, а вторая половина – в другую сторону. Биполярный миозиновый филамент располагается в центральной части саркомера (см. рис. 1). На рисунке , разная направленность головок миозина в левой и правой частях толстого филамента обозначена разнонаправленными галочками на нитях миозина в нижней части рис. 1. Главной “моторной” частью миозина скелетных мышц является «головка тяжелой цепи миозина вместе со связанной с ней легкими цепями миозина. Головки миозина могут контактировать с нитями актина , образуя так называемые поперечные мостики, которые собственно формируют усилие и обеспечивают скольжение нитей актина относительно миозина. Попытаемся представить, как работает такой одиночный поперечный мостик. В 1993 году изолированных и модифицированных позволило удалось кристаллы специальным головок расшифровать образом миозина, структуру что головок миозина и сформулировать гипотезы о том, каким образом головки миозина могут перемещать нити актина. Обратите внимание, что в головке миозина можно выявить три основные части [1] (рис. 4). N-концевая часть головки миозина с молекулярной массой около 25 000 (обозначена зеленым цветом на рис. 4, а) формирует АТФсвязывающий центр. Центральная часть головки миозина с молекулярной массой 50 000 (обозначена красным цветом на рис. 4, а) содержит в своем составе центр связывания актина. Рис. 4. Строение головки миозина (а) и гипотетический механизм перемещения головки миозина по поверхности актина (б) а – головка миозина ориентирована таким образом, что актин-связывающий центр (окрашен красным) расположен в правой части. Ясно видна щель (“раскрытая пасть”), разделяющая две половинки (две “челюсти”) актин-связывающего центра б – схема одиночного шага головки миозина по нити актина. Актин изображен в виде гирлянды шариков. В нижней части головки изображена щель, разделяющая две части актинсвязывающего центра. Аденозин обозначен А, а фосфатные группы – в виде маленьких кружков. Между состояниями 5 и 1 схематически показана переориентация шейки миозина, происходящая при генерации тянущего усилия (по [1] с изменениями и упрощениями) Наконец, С-концевая часть с молекулярной массой 20 000 (обозначена фиолетовым цветом на рис. 4, а) образует как бы каркас всей головки. Эта часть соединена сочленением со гибким шарнирным спирализованным хвостом тяжелых цепей миозина (см. рис. 4, а). В Сконцевой части головки миозина располагаются центры связывания существенной и (желтая на рис. 4, а) регуляторной (светлофиолетовая на рис. 4, а) легких цепей миозина. Общий контур головки миозина напоминает змею с приоткрытой “пастью”. Челюсти этой “пасти” (окрашены красным на рис. 4, а) формируют актинсвязывающий центр. Предполагается, что в ходе гидролиза АТФ происходит периодическое открывание и закрывание этой “пасти”. В зависимости от положения “челюстей” головка миозина более или менее прочно взаимодействует с актином. Далее, рассмотрим цикл гидролиза АТФ и перемещение головки по актину. В исходном состоянии головка миозина не насыщена АТФ, “пасть” закрыта, (“челюсти”) актинсвязывающие сближены и головка центры прочно взаимодействует с актином. При этом спиральная “шейка” ориентирована под углом 45° относительно нити актина (состояние 1 на рис. 4, б). При связывании АТФ в активном центре “пасть” раскрывается, актин-связывающие участки, расположенные на двух “челюстях” пасти, удаляются друг от друга, прочность связи миозина с актином ослабевает и головка диссоциирует от нити актина (состояние 2 на рис. 4, б). Гидролиз АТФ в активном центре диссоциировавшей от актина головки миозина приводит к изменению конформации или закрыванию щели активного центра, изменению ориентации “челюстей” и переориентации спирализованной шейки. Обратите внимание, что после гидролиза АТФ шейка оказывается повернутой на 45° и занимает положение, перпендикулярное длинной оси нити актина (состояние 3 на рис. 4, б). Далее головка миозина вновь оказывается способной взаимодействовать с актином. Однако если в состоянии 1 головка контактировала со вторым сверху мономером актина, то сейчас из-за поворота шейки взаимодействует головка ориентирована уже третьим с и сверху мономером актина (состояние 4 на рис. 4, б). Образование комплекса с актином вызывает структурно- конформационные изменения в головке миозина. Эти изменения позволяют удалит из активного центра миозина неорганический фосфат, который образовался в ходе гидролиза АТФ. Одновременно происходит переориентация шейки. Она занимает положение под углом 45° по отношению к нити актина и в ходе переориентации развивается механическое усилие (состояние 5 на рис. 4, б). При этом головка миозина проталкивает нить актина на шаг вперед , а из активного центра десорбирует другой продукт реакции, АДФ. Цикл замыкается, и головка переходит в исходное состояние (состояние 1 на рис. 4, б). Очевидно, что каждая из головок формирует слабое механическое усилие (несколько пиконьютонов). Однако все они суммируются, и вследствие этого мышца развивает достаточно большое напряжение (механическую силу). Очевидно, что, чем больше область перекрытия тонких и толстых филаментов (то есть чем больше головок миозина может зацепиться за нити актина), тем большее усилие может генерироваться мышцей. Механизмы регуляции мышечного сокращения. Мышца не могла бы выполнять свою функцию, если она постоянно находилась бы в сокращенном состоянии. Для эффективной работы необходимо, чтобы были специальные “выключатели”, которые позволяли бы «головке миозина перемещаться по нити актина только в строго определенных условиях (например, при химической или электрической стимуляции мышцы). Действительно, стимуляция приводит к кратковременному увеличению концентрации Са2+ внутри мышцы с 10−7 до 10−5 М, что является сигналом для начала мышечного сокращения. Таким образом, для регуляции сокращения необходимы специальные регуляторные системы, которые могли концентрации бы Са2+ отслеживать внутри изменения клетки. Такие регуляторные белки могут располагаться на тонком и толстом филаментах или находиться в цитоплазме. В зависимости от того, где располагаются Са-связывающие белки, принято различать так актиновый называемый типы регуляции миозиновый и сократительной активности. Миозиновый тип регуляции сократительной активности. Простейший способ миозиновой регуляции описан моллюсков. для Миозин некоторых моллюсков по мышц своему составу не отличается от миозина скелетных мышц позвоночных. В обоих случаях в состав миозина входят две тяжелые цепи (с молекулярной массой 200 000–250 000) и четыре легкие цепи (с молекулярной массой 18 000–28 000) (см. рис. 3). Считается, что при отсутствии Са2+ легкие цепи обернуты вокруг шарнирного участка тяжелой подвижность Головка цепи шарнира миозина не миозина. сильно При этом ограничена. может совершать колебательных движений, она фиксирована, как бы заморожена в одном положении относительно ствола толстого филамента (рис. 5, а). Очевидно, что в таком состоянии головка не может осуществлять колебательные (как бы сказали коментаторы на соревнованиях по академической гребли - “загребательные”) движения и вследствие этого не может перемещать нить актина. При связывании Са2+ происходят изменения структуры легких и тяжелых цепей миозина. Резко повышается подвижность в области шарнира. Теперь после гидролиза АТФ головка миозина может осуществлять колебательные движения и проталкивать нити актина относительно миозина. Рис. 5. Миозиновый тип регуляции сократительной активности. А – гипотетическая регуляции сокращения схема мышц механизма моллюсков. Изображены одна головка миозина с легкими цепями и нить актина в виде пяти кружков. В состоянии расслабления (а) легкие цепи миозина уменьшают подвижность шарнира, соединяющего головку со стволом миозинового филамента. подвижность После связывания шарнира Са2+ повышается, (б) головка миозина осуществляет колебательные движения и проталкивает актин относительно миозина. Б – схема регуляции сократительной активности гладких мышц позвоночных. СаМ – кальмодулин; КЛЦМ – киназа легких цепей миозина; ФЛЦМ – фосфатаза легких цепей миозина;Р-миозин – фосфорилированный миозин (по [3] с упрощениями и изменениями) Для гладких мышц позвоночных (таких, как мышцы сосудов), а также для некоторых форм немышечной подвижности (изменение формы тромбоцитов) также характерен так называемый миозиновый тип регуляции. Как и в случае мышц моллюсков, миозиновый тип регуляции гладких мышц связан с изменением структуры легких цепей миозина. Однако в случае гладких мышц этот механизм заметно усложнен. Обратите внимание на то, что с миозиновыми филаментами гладких мышц связан специальный фермент. Этот фермент получил название “киназа легких цепей миозина” (КЛЦМ). Он относится к группе протеинкиназ, ферментов, способных переносить концевой остаток фосфата АТФ на оксигруппы остатков серина или треонина белка. В состоянии покоя мышечной клетки, при низкой концентрации Са2+ в цитоплазме, киназа легких цепей миозина неактивна. Это связано с тем, что в структуре ингибиторный фермента есть специальный (блокирующий активность) участок. За счет конформации этот участок попадает в активный центр фермента и, препятствует взаимодействию активного центра с истинным субстратом, активность фермента выражению полностью блокирует [2]. образному профессора По МГУ, Николая Борисовича Гусева, таким образом, фермент как бы усыпляет сам себя. Как мы с вами уже знаем ( из раздела курса по молекулярной биофизики), в цитоплазме гладких мышц есть специальный белок кальмодулин, в структуре которого имеются четыре Са-связывающих центра [2]. Связывание Са2+ вызывает изменения в структуре кальмодулина. Насыщенный Са2+ кальмодулин оказывается способным взаимодействовать с киназой (КЛЦМ) (рис. 5, Б). Формирование комплекса кальмодулина и киназы приводит к удалению ингибиторного участка из активного центра, и фермент, как бы просыпается. Он начинает узнавать свой субстрат и переносит остаток фосфата от АТФ на один (или два) остатка серина, расположенных около N-конца регуляторной легкой цепи миозина. Фосфорилирование регуляторной легкой цепи миозина приводит к значительным изменениям структуры как самой легкой цепи, так, повидимому, и тяжелой цепи миозина в области ее контакта с легкой цепью. Только после фосфорилирования легкой цепи миозин оказывается способным взаимодействовать с актином и начинается мышечное сокращение (рис. 5, Б). Понижение концентрации кальция в клетке вызывает диссоциацию ионов Са2+ из катионсвязывающих центров кальмодулина. Кальмодулин диссоциирует от киназы легких цепей миозина, которая тут же теряет свою активность под действием своего же ингибиторного пептида и опять как бы впадает в спячку. Но пока легкие цепи миозина находятся в фосфорилированном продолжает состоянии, осуществлять миозин циклические акты движения нитей актина. Для того чтобы это остановить, надо удалить остаток фосфата из регуляторной легкой цепи миозина. Этот процесс осуществляется под действием другого фермента – так называемой фосфатазы легких цепей миозина (ФЛЦМ на рис. 5, Б). Обратите внимание на то, что фосфатаза катализирует быстрое удаление остатков фосфата из регуляторной легкой цепи миозина. дефосфорилированный производить Важно, миозин циклические не что способен движения своей головкой и подтягивать нити актина. Наступает расслабление (рис. 5, Б). Таким образом, как в мышцах моллюсков, так и в гладких мышцах позвоночных основой регуляции является изменение структуры легких цепей миозина. Далее обсудим актиновый механизм регуляции мышечного сокращения. Связанный с актином механизм регуляции сократительной активности характерен для поперечнополосатых скелетных мышц позвоночных и сердечной мышцы. Обратите внимание на то, что нити фибриллярного актина в скелетных и сердечных мышцах имеют вид двойной нитки бус (рис. 2 и 6, а). Так как нитки бус актина перекручены друг относительно друга, то с двух сторон филамента образуются канавки, размещается сильно в глубине которых спирализованный белок тропомиозин. Каждая молекула тропомиозина состоит из двух одинаковых (или очень похожих друг на друга) полипептидных цепей, которые перекручены друг относительно друга наподобие девичьей косы. Располагаясь внутри канавки актина, палочкообразная молекула тропомиозина контактирует с семью мономерами актина. Рис. 6. Структурные основы актинового типа регуляции сокращения мышц а – актиновый филамент с расположенным в канавках спирали непрерывным тяжем молекул тропомиозина; б – взаимное расположение тонких и толстых филаментов в саркомере поперечнополосатых и сердечных мышц. Укрупненное изображение части актинового филамента в состоянии расслабления (в) и сокращения (г). TnC, TnI и TnT соответственно тропонин С, тропонин I и тропонин Т. Буквами N, I и C обозначены соответственно N-концевая, ингибиторная и Сконцевая части тропонина I (по [4] с изменениями и упрощениями) Каждая молекула тропомиозина взаимодействует не только с мономерами актина, но и с предыдущей и последующей молекулами тропомиозина, вследствие чего внутри всей канавки актина формируется непрерывный тяж молекул тропомиозина. Таким образом, внутри всего актинового филамента проложен как бы своеобразный кабель, образованный молекулами тропомиозина. На актиновом филаменте, помимо тропомиозина располагается еще и тропониновый комплекс. Этот комплекс состоит из трех компонентов, каждый из которых выполняет характерные функции [4]. Первый компонент тропонина, тропонин С, способен связывать Са2+ (аббревиатура С указывает именно на способность этого белка связывать Са2+). По структуре и свойствам тропонин С очень похож на кальмодулин. Второй компонент тропонина, это тропонин I, был обозначен так потому, что он может ингибировать (подавлять) гидролиз АТФ актомиозином. Наконец, третий компонент тропонина называется тропонином Т потому, что этот белок прикрепляет тропонин к тропомиозину. Обратите внимание на то, что полный тропониновый комплекс имеет форму запятой, размеры которой сопоставимы с размерами 2–3 мономеров актина (см. рис. 6, в, г). Один тропониновый комплекс приходится на семь мономеров актина. В состоянии расслабления концентрация Са2+ в цитоплазме очень мала. Регуляторные центры тропонина С не насыщены Са2+. Именно поэтому тропонин С только своим С-концом слабо взаимодействует с тропонином I (рис. 6, в). Ингибиторный и С-концевой участки тропонина I взаимодействуют с актином и с помощью тропонина Т выталкивают тропомиозин из канавки на поверхность актина. До тех пор, пока тропомиозин располагается на периферии канавки, доступность актина для головок миозина ограниченна. Контакт актина с миозином возможен, но площадь этого контакта мала, вследствие чего головка миозина не может переместиться по поверхности актина и не может генерировать механическое смещение ( усилие). При повышении концентрации Са2+ в цитоплазме происходит насыщение регуляторных центров тропонина С (рис. 6, г). Тропонин С образует прочный комплекс с тропонином I. При этом ингибиторная и С-концевая части тропонина I диссоциируют с актина. Теперь ничто не удерживает тропомиозин на поверхности актина, и он перемещаетчя на дно канавки. Такое перемещение тропомиозина доступность актина увеличивается для площадь увеличивает головок контакта миозина, актина с миозином, и головки миозина приобретают возможность не только контактировать с актином, но и перемещаться по его поверхности, формируя при этом усилие. Таким образом, Са2+ вызывает изменение структуры тропонинового комплекса. Эти изменения структуры тропонина приводят к перемещению тропомиозина. Из-за того, что молекулы тропомиозина взаимодействуют друг с другом, изменения положения одного тропомиозина повлечет за собой перемещение предыдущей и последующей тропомиозина. Именно поэтому молекул локальные изменения структуры тропонина и тропомиозина быстро распространяются вдоль всего актинового филамента. ИТАК Мышцы совершенным и являются наиболее специализированным приспособлением для перемещения клеток или тканей в ходе циклического замыкания и размыкания контактов между нитями актина и миозина. Эти контакты формируются головками миозина, которые могут гидролизовать АТФ и за счет освободившейся энергии генерировать перемещение и силу натяжения. Регуляция сокращения мышц обеспечивается специальными которые Са-связывающими могут располагаться белками, либо на миозиновом, либо на актиновом филаменте. В одних типах мышц (например, в гладких мышцах позвоночных) главная роль принадлежит регуляторным белкам, расположенным на миозиновом филаменте, а в других типах мышц (скелетные и сердечные мышцы позвоночных) главная роль принадлежит регуляторным белкам, расположенным на актиновом филаменте. ЛИТЕРАТУРА 1. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt- Base K. et al.// Science. 1993. Vol. 261. P. 50–58. 2. Гусев Н.Б. связывающие Внутриклеточные белки // Са- Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 5. С. 2–16. 3. Walsh M. // Mol. Cell. Biochem. 1994. Vol. 135. P. 21–41. 4. Farah C.S., Reinach F.C. // FASEB J. 1995. Vol. 9. P. 755–767. 5. Davidson V.L., Sittman D.B. Biochemistry. Philadelphia, Harwal Publ., 1994. 584 p. 6. Wray M., Weeds A. // Nature. 1990. Vol. 344. P. 292–294. 7. Pollack G.A. Muscles and Molecules. Seattle: Ebner and Sons Publ., 1990. 300 p. Обратим внимание на основные положения модели скользящих нитей: 1. Длины нитей актина и миозина в ходе сокращения не меняются. 2. Изменение длины саркомера при сокращении – результат относительного продольного смещения нитей актина и миозина. 3. Поперечные мостики, отходящие от миозина, могут присоединяться к комплементарным центрам актина. 4. Мостики прикрепляются к актину не одновременно. 5. Замкнувшиеся структурному мостики переходу, при подвергаются котором они развивают усилие, после чего происходит их размыкание. 6. Сокращение и расслабление мышцы состоит в нарастании и последующем уменьшении числа мостиков, совершающих цикл “замыкание- размыкание. 7. Каждый цикл связан с гидролизом одной молекулы АТФ. 8. Акты замыкания-размыкания мостиков происходят, не зависимо друг от друга. Электромеханическое сопряжение в мышцах это цикл последовательных начинающийся действия (ПД с возникновения на сарколемме процессов, потенциала (клеточной мембране) и заканчивающийся сократительным ответом мышцы. В качестве примера рассмотрим процессы, обеспечивающие сокращение кардиомиоцита: 1) при подаче на клетку стимулирующего импульса открываются быстрые (время активации 2 мс) натриевые каналы, ионы Na+ входят в клетку, вызывая деполяризацию мембраны; 2) в результате деполяризация плазматической мембраны в ней и в Т-трубочках открываются потенциал-зависимые медленные кальциевые каналы (время жизни 200 мс), и ионы Са2+ поступают из внеклеточной среды, где их концентрация ~ 2·10-3 моль/л, внутрь клетки (внутриклеточная концентрация Са2+~107 моль/л); 3) кальций, активирует поступающий мембрану в клетку, саркоплазматического ретикулума (СР), являющегося внутриклеточным депо ионов Са2+ (в СР их концентрация достигает 103 моль/л), и высвобождает кальций из СР, в результате чего возникает так называемый "кальциевый залп". Ионы Са2+ из СP поступают миофибрилл, на актин-миозиновый открывают комплекс активные центры актиновых цепей, вызывая замыкание мостиков и дальнейшее развитие силы и укорочения процесса сокращения саркомера; 4) по окончании миофибрилл ионы Са2+ с помощью кальциевых насосов, находящихся в мембране СР, активно заканчиваются внутрь саркоплазматического ретикулума; 5) процесс электромеханического сопряжения заканчивается тем, что К+ пассивно выходит из клетки, вызывая реполяризацию мембраны; 6) ионы Са2+ активно выводятся во внеклеточную среду с помощью кальциевых насосов сарколеммы. Таким образом, в кардиомиоците электромеханическое сопряжение осуществляется в две фазы: сначала входящий поток кальция активирует способствуя большему мембраны выбросу кальция СР, из внутриклеточного депо, а затем в результате этого выброса происходит сокращение саркомера. Многочисленные опыты показали, что: 1) отсутствие потока кальция в клетку прекращает сокращение саркомеров; 2) в условиях постоянства количества кальция, высвобождаемого из СР, изменение амплитуды потока кальция приводит к хорошо коррелирующему изменению силы сокращения. Поток ионов Са2+ внутрь клетки выполняет таким образом две функции: формирует длительное (200 мс) плато потенциала действия кардиомиоцита и участвует в процессе электромеханического сопряжения. Следует отметить, что не во всех мышечных клетках процесс сопряжения происходит, как в кардиомиоците. Так, в скелетных мышцах теплокровных потенциал действия короткий (2-3 мс) и медленный поток ионов кальция в них отсутствует. В связи с этим в клетках сильно развита Т-система подходящих поперечных непосредственно к трубочек, саркомерам близко к z-дискам. Изменения мембранного потенциала во время деполяризации через Тсистему передается непосредственно залповое в таких на мембрану высвобождение клетках СР, ионов вызывая Са2+ и дальнейшее сокращение. Обратите внимание, что общим для сокращения любых мышечных клеток является процесс освобождения ионов Са2+ из внутриклеточных депо –саркоплазматического ретикулума и дальнейшая активация сокращения. Ход кальциевого экспериментально выброса выявлен флуоресцентных зондов , а развития сокращения в из с СР помощью задержка начала скелетных мышцах составляет 20 мс, а в сердечной –несколько больше (до 100 мс). Биомеханика мышечного сокращения Для обсуждения биофизики и биомеханики сокращения в качестве упрощения мышцу можно представить как сплошную среду, то есть среду, состоящую из большого числа элементов, взаимодействующих между собой без соударений и находящихся в поле внешних сил. Обратите внимание на то, что мышца одновременно обладает свойством упругости и вязкости, то есть является вязко-упругой средой. Для такой среды в биомеханике предполагаются справедливыми законы классической механики. В связи с этим рассмотрим некоторые термины, которые могут быть использованы для биомеханики Фундаментальными сплошных сред понятиями являются механики деформация, напряжение, упругость, вязкость, а также энергия и температура. Упругость–свойство тел менять размеры и форму под действием сил и самопроизвольно восстанавливать их при прекращении внешних воздействий. Упругость тел обусловлена силами взаимодействия его атомов и молекул. При отсутствии внешнего самопроизвольно воздействия возвращается в тело исходное состояние. Вязкость –внутреннее трение среды. Тогда Вязкоупругость –это свойство материалов твердых тел сочетать упругость и вязкость. Деформация – это относительное изменение длин: ε =l/l , где l – начальная длина, Δl – значение удлинения. Напряжение механическое – мера внутренних деформации сил, материала. возникающих Для при однородного стержня: σ = F/S, где S –площадь сечения, F – сила, приложенная к стержню. Упругая деформация возникает и исчезает одновременно с нагрузкой и не сопровождается рассеянием энергии. Для упругой деформации справедлив закон Гука: определяемый σу= εЕ, где Е–модуль Юнга, природой вещества. При растяжении, в общем случае, Е= f(ε). При малых растяжениях считают Е= const. В случае вязкой среды напряжение σв определяется скоростью деформации: σв= η ddt , где η –коэффициент вязкости среды. Для вязкоупругой деформации характерна явная зависимость от динамики загрузки, причем при удалении нагрузки деформация с течением некоторого времени самопроизвольно стремится к нулю. Для исследования сокращающихся мышц характеристик используют два искусственных режима: 1. Изометрический режим, при котором длина мышцы постоянна, а регистрируется развиваемая сила. 2. Изотонический режим, при котором мышца поднимает постоянный груз, а регистрируется изменение ее длины во времени. При изометрическом режиме фиксируют длину мышцы. После фиксации длины на электроды подается электрический стимул и с помощью датчика регистрируется функция. Максимальная сила, которую может развивать мышца, зависит от ее начальной длины и области взаимодействия актиновых и миозиновых нитей, поэтому максимальная сила сокращения генерируется тогда, когда мышца предварительно растянута на установке так, чтобы длины ее саркомеров были близки к 2,2 мкм. При изотоническом режиме к незакрепленному концу мышцы подвешивают груз. После этого подается стимул и регистрируется изменение длины мышцы во времени. Чем больше груз, тем меньше сокращение мышцы и короче время удержания груза. При некоторой нагрузке мышца совсем перестает поднимать груз; это значение и будет максимальной силой изометрического сокращения для данной мышцы. Рис.4.5. Развитие во времени потенциала действия (А) и изометрического сокращения мышцы, приводящей большой палец кисти (Б). 1 — фаза развития напряжения; 2 — фаза расслабления. Рис.4.6. Одиночные (а) и тетанические (б,в,г,д) сокращения скелетной мышцы. Накладывание волн сокращения друг на друга и образование тетануса при частотах раздражения: 5 -15 раз/с; в — 20 раз/с; г — 25 раз/с; д — более 40 раз в 1 сек (гладкий тетанус). Зависимость скорости величины нагрузки параметром при исследуя сокращения является изучении важнейшей работы закономерности от мышцы, мышечного сокращения и его энергетики. Она была подробно изучена при разных режимах сокращения Хиллом. b(P0 − P) V(P) = . P+a Это выражение называется «уравнение Хилла» и является основным мышечного уравнением сокращения. изометрическое механики Ро–максимальное напряжение, развиваемое мышцей, или максимальный груз, удерживаемый мышцей без ее удлинения; b –константа, имеющая размерность скорости, а–константа, имеющая размерность силы. Из уравнения следует, что максимальная скорость развивается при Р = 0: b. Vmax = P0 a .При Р= Ро получаем V = 0, то есть укорочение не происходит. Обратите внимание на то, что работа, производимая мышцей при одиночном укорочении на величину Δl равна А = PΔl. Эта зависимость, очевидно, нелинейная, так как V = f(P), но на ранних фазах сокращения этим можно пренебречь, считая что V = const. Тогда Δl = VΔt, а развиваемая мышцей мощность W = dA/dt имеет вид: W = PV. В результате получаем зависимость мощности от развиваемой силы: W(P) = PV = b(P0 − P) P/ P + a Легко посчитать, что мощность равна нулю при Р= Р0 и Р= 0 и достигает максимального значения при оптимальной величине нагрузки Ро .. Эффективность сокращении работы может быть мышцы при определена как отношение совершенной работы к затраченной энергии. Развитие максимальной мощности и эффективности сокращения достигается при усилиях 0,3-0,4 от максимальной изометрической нагрузки для данной мышцы. Практически эффективность может достигать значений 40-60 % для разных типов мышц, максимальная эффективность наблюдается у мышц черепахи, достигающая 75-80 %. Кинетические свойства мышцы В нестационарных условиях проявляются упругие свойства мышцы. Так, в опытах по быстрому выходу (quick release), в которых изометрически сокращенная освобождается и изотоническое сокращение, мышца испытывает быстрое наблюдаются медленно затухающие колебания. Частота этих колебаний порядка килогерц для мышц, длиною в несколько сантиметров. Возникновение колебаний обусловлено нелинейностью кинетических уравнений, в мышце нестационарных не содержащих упругости в явном виде. Возможность колебаний обусловлена в этом случае кинетикой замыкания и размыкания молекулярных мостиков. С другой стороны, сам мостик является вязкоупругой системой. Напряжение, генерируемое замкнутым мостиком, может изменяться шаг за шагом, в зависимости от угла, под которым «головка» располагается относительно актина, а также от степени растяжения.Таким образом, причина колебаний состоит в упругой деформации самого мостика. Большой интерес для изучения мышечного сокращения представляют летательные мышцы насекомых (ЛМН) и близкие к ним тимпанальные мышцы цикад. Эти мышцы способны к быстрым периодическим сокращениям с частотой порядка 100 Гц. Морфология ЛМН аналогична с поперечно-полосатыми мышцами: позвоночных, а механизм сокращения ЛМН соответствует модели с мостиками актин-миозин. Быстрые колебания ЛМН требуют наличия непосредственно функционирующего упругого элемента. Установлено, что в отличие от мышц позвоночных в ЛМН имеется прямая вязкоупругая связь между миозиновыми нитями и Z-мембранами, осуществляемая специальным элементом. По-видимому, этот элемент способен испытывать упругие деформации. Отметим, что известно большое различие между колебаниями ЛМН и колебаниями потенциала, который на них подается. Так, у мухи частота потенциала, подаваемого на ЛМН, равна 3 Гц, а частота колебаний крыльев достигает 120 Гц. Следовательно, колебания ЛМН имеют характер автоколебаний. Автоколебания возникают в нелинейных системах за счет сил, зависящих от состояния движения самой системы; размах автоколебаний не зависит от начальных условий. Автоколебания ЛМН возбуждаются при наличии обратной связи между деформацией Соотношение между и ними напряжением. изменяется в зависимости от состояния активности системы. По-видимому, в ЛМН имеется «элемент- преобразователь», реагирующий на механические события и сократительной контролирующий системы. состояние Этот элемент локализован в миофибриллах, что доказывается наличием автоколебаний и у препаратов ЛМН, отмытых глицерином. При одиночном позвоночного ритмическая сокращении мышцы наблюдается характерная периодичность, «зубчатость» процесса. Это доказано оптическим методом. Для изучения молекулярной динамики мышцы оказывается очень важным метод скоростной рентгенографии, основанный на применении синхротронного излучения. Однако кинетические свойства мышцы изучены недостаточно. Общий подход к их пониманию должен основываться на теории нелинейных динамических систем. Контрольные вопросы 1. Структура и ультраструктура мышечного волокна. 2. Экспериментальные методы мышц. 3. Физические свойства мышц. исследования 4. Молекулярный механизм сокращения мышц. 5. Роль ионов в развитии мышечного сокращения. 6. Тепловые процессы при мышечном сокращении. 7. Зависимость между напряжением и удлинением. ЛЕКЦИЯ ПО БИОФИЗИКЕ РЕЦЕПЦИИ Основные биологические функции клетки реализуются посредством экстраклеточного взаимодействия стимула (первичного мессенджера) с рецептором на поверхности клетки и передачи сигналов внутрь клетки. Изучение биофизических механизмов передачи и усиления слабых сигналов является одной из основных задач биологии клетки. Их знание необходимо для формирования понимания механизмов функционального ответа клеток в норме, его регуляции и коррекции при патологических состояниях. ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА В ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ КЛЕТКАХ СЕТЧАТКИ Фоторецепторные молекулы специализированных клеток воспринимают в качестве сигнала энергию кванта света. Но, принципы передачи сигнала через мембрану у фоторецепторов и рецепторов гормонов весьма сходны. Зрительный родопсин локализован у большинства позвоночных в специализированных фоторецепторных клетках двух типов - палочках и колбочках, которые выстилают внутреннюю сторону сетчатки глаза (рис. 70). Палочки функционируют в условиях слабого освещения. Они очень чувствительны к световым сигналам и при сильном освещении десенсибилизируются. При ярком свете зрительный процесс обеспечивается колбочками. По-видимому, именно колбочки отвечают за объемное изображение, реагируют на перемещение предметов. Колбочки передают цветовую гамму изображения. В колбочках содержатся пигменты, поглощающие различных в областях спектра. У человека Рис. 70. Строение палочки и колбочки различают три вида колбочек, поглощающих свет в коротковолновой, средней и длинноволновой областях видимого спектра. Именно эти различия в свойствах пигментов колбочек лежат в основе цветового зрения. При слабом освещении колбочки не принимают сигнала, и глаз не воспринимает цвет объектов. Рецепторная мембрана палочек состоит из замкнутых дисков, не соприкасающихся с цитоплазматической мембраной, в то время как в колбочках она образует систему складок. Таким образом, для передачи сигнала в палочках от диска к плазма тической мембране необходим гидрофильный посредник. Обратите внимание, что как палочки, так и колбочки условно делят на два сегмента: наружный и внутренний. Наружный сегмент содержит фоторецепторные мембраны, а внутренний - специализируется на генерации энергии и содержит аппарат, синтезирующий молекулы вторичных посредников, участвующих в передаче сигнала. Зрительный родопсин (как и бактериородопсин), содержит в активном центре 11-г/цис-ретиналь. Белковая часть родопсина без ретиналя называется опсином и функционирует как фермент. Молекулярная структура зрительного родопсина и бактериородопсина различны. Полипептидная цепь родопсина состоит из 348 аминокислот. К молекуле белка присоединены две присоединенные олигосахаридные к остаткам цепи, аспарагина в положении 2 и 15. Как и у бактериородопсина, молекула зрительного родопсина пересекает мембрану 7 раз, используя гидрофобные участки первичной структуры. Между собою они соединены короткими цепями гидрофильных аминокислот. Ретиналь расположен ближе к С-концу белка. Пигменты из колбочек сетчатки глаза человека, условно названные по области поглощаемого ими света «красный», «голубой» и «зеленый», обнаруживают в своей структуре чередование гидрофобных и гидрофильных участков, при этом «красный» и «зеленый» пигменты обладают высокой степенью гомологии с родопсином из палочек, а «голубой» значительно отличается от него. Бактериородопсин и родопсин из палочек сетчатки практически не имеют гомологичных участков, однако они формируют сходные структуры в мембране, состоящие в каждом случае из 7 гидрофобных колонн. Вряд ли эти два пигмента имеют либо прямую эволюционную связь. По-видимому, упаковка молекулы ретиналя в 7 а-спиральных колонн является оптимальным способом функционирования в обеспечения мембране в его качестве первичного акцептора кванта света. Обратите внимание, что родопсин обладает характерным спектром поглощения в областях 280 и 500 нм (рис. 71). В основе функционирования как родопсина, так и бактериородопсина лежит светозависимая изомеризация ретиналя. При поглощении кванта света 11-г/ис-ретиналь родопсина переходит полностью в транс-форму. Эта изомеризация запускает каскад реакций, сопровождающихся изменением спектра поглощения молекулы родопсина. Таким образом, в результате поглощения света зование Рис. 71. Спектр поглощения зрительного родопсина фотона родопсином происходит обра- опсина и свободного ретиналя. Другой результат этого процесса гиперполяризация мембраны палочек. В норме на мембране палочек регистрируется так назы- ваемый «темновой ток», обеспечиваемый входом в клетку натрия и выходом калия за счет работы Nа/К-АТ-Фазы. Трансмембранный потенциал при этом составляет 20 мВ. Вспышка света вызывает гиперполяризацию мембраны до 70 мВ. При этом ее величина пропорциональна интенсивности освещения. Гиперполяризация мембран измеряется с помощью микроэлектродной техники и может быть вызвана в эксперименте приложением потенциала к самой мембране. С помощью этого метода было доказано, что гиперполяризация мембраны палочки является необходимым и достаточным условием передачи светового сигнала через синапсы к зрительным нейронам. Таким образом, поглощение кванта света ретиналем родопсина, локализованным в диске, должно привести плазматической к гиперполяризации мембраны палочек, непосредственно не связанной с мембраной фоторецепторного диска. Наличие вторичного мессенджера (ц-ГМФ) предполагало участие специального белка-посредника между ГТФ и родопсином, регулирующего процесс образования цГМФ. Этот белок был назван трансдуцином, так как он участвует в трансдукции (преобразовании) светового сигнала в электрический. Оказалось, что трансдуцин состоит из трех субъединиц - а, и , способных к обратимой диссоциации. Активированная светом молекула родопсина метародопсин-II комплекс с - образует трансдуцином, специфический находящимся в комплексе с ГДФ, которая связывается с асубединицей трансдуцина Взаимодействие родопсина (рис. с 72). трансдуцином катализирует обмен на а-субъединице ГДФ на ГТФ. После этого комплекс трансдуцина с родопсином диссоциирует, одновременно и происходит практически диссоциация трансдуцина на а-субъединицу, связанную с ГТФ, и на комплекс, состоящий из- и -субъединиц. а-субъединица трансдуцина в ГТФ-связанной форме активирует фосфодиэстеразу. аналогичное строение цГМФ-зависимую Этот фермент (состоит из имеет трех субъединиц,). Ингибирование осуществляется за счет связывания связанной с ГТФ а-субъединицы с -субъединицей фосфодиэстеразы. При этом субъединица отделяется, а свободные а- и беттасубъединицы осуществляют гидролиз ГТФ. Этот процесс протекает с очень большой скоростью (до 4000 молекул в секунду). Активирующее влияние трансдуцина на фосфодиэстеразу прекращается после гидролиза ГТФ. В дальнейшем комплекс фосфата- и субъединиц трансдуцина ассоциирует с ГДФсвязанной формой а-субъединицы, и молекула трансдуцина снова взаимодействовать приобретает с способность фотоактивированным родопсином и весь цикл повторяется. В результате активации одной молекулы родопсина образуется несколько сотен активных комплексов а-субъединицы трансдуцина с ГТФ. Это первая стадия усиления. Затем а-субъединица активирует фосфодиэстеразу. На этой стадии усиления сигнала нет, так как каждой субъединицей активируется фосфодиэстеразы. только Затем одна молекула комплекс а- субъединицы с фосфодиэстеразой (который не диссоциирует, пока не пройдет гидролиз ГТФ) осуществляет превращение нескольких тысяч молекул цГМФ. В этот период происходит более чем тысячекратное усиление сигнала. Далее механизм усиления работает на мембранном уровне, регулируя натриевые каналы и генерируя электрический импульс. Рис. 72. функционирования Механизм зрительного Подробное описание участия трансдуцина в передаче зрительного сигнала свидетельствует об участие G-белков в образовании вторичных мессенджеров (см. ниже) Трансдуцин играет ключевую роль не только в активации, но и в инактивации сигнала. Включение и выключение сигнала осуществляются через а-субъединицу. При этом ключевой стадией управления является гидролиз ГТФ до ГДФ. Реакции, ведущие к активации процесса, энергетически выгодны. Некоторые реакции инактивации требуют дополнительной энергии. Родопсин инактивируется с помощью специальной протеинкиназы. Этот фермент присоединяет фосфатные группы к нескольким аминокислотам на одном конце полипептидной цепи опсина. Затем родопсин образует комплекс с белком, называемым арестином, который блокирует связывание трансдуцина и возвращает систему в исходное «темновое» состояние. Несмотря на то, что механизм передачи сигнала от фоторецепторного диска к плазматической мембране изучен достаточно подробно, ряд вопросов остается не выясненным. Во-первых, не вполне понятна роль ионов кальция. В некоторых работах было показано, что светозависимое увеличение внутриклеточного кальция приводит к гиперполяризации мембраны, которая исчезает после удаления ионов Са. При хелатирующих Са2+ агентов, чувствительность фоторецепторной этом снижает клетки к свету. В последнее время активно обсуждается роль фосфоинозитидных мессенджеров в передаче сигнала в фоторецепторной клетке. Показано, что однократное освещение приводит к активации фосфоинозитидного цикла. Было показано, что освещение палочек активирует фосфолипазу А2, и этот процесс зависит от трансдуцина, так как ингибируется видимому, коклюшным токсином. фосфоинозитидный цикл Потакже участвует в передаче сигнала в фоторецепторной клетке, однако механизмы этого участия еще предстоит исследовать. Функционирование родопсина в фоторецепторных дисках существенно зависит от липидного окружения. В фоторецепторной мембране низко содержание холестерина, а основные фосфолипиды, входящие в ее состав (фосфатидилхолин - 40%, фосфатидилэтаноламин - 38%, фосфатидилсерин - 13%), содержат подавляяющее количество полиненасыщенных жирных кислот (до 90%). Такой состав мембраны, по-видимому, обеспечивает низкую вязкость мембраны, необходимую для функционирования родопсина. В то же время, большое количество полиненасыщенных фосфолипиды жирных сетчатки кислот делает уязвимыми для окислительного повреждения. Механизмы рецепторов работы гормонов фоторецепторов во многом и подобны: связывание гормона с рецептором приводит к активации G-белка, а возбуждение родопсина квантом света - к активации трансдуцина (рис. 73). Как активация G-белка, так и активация трансдуцина включают субъединицей. связывание (АЦ), а а- активирует G-белок аденилатциклазу ГТФ трансдуцин - фосфодиэстеразу (ФДЭ). Оба этих фермента осуществляют свои функции через циклические нуклеотиды. цАМФ участвует в регуляции ферментов - эффекторов гормонов, а цГМФ индуцирует открывание натриевого канала в плазматической мембране фоторецепторной клетки. Аналогия в механизме передачи сигнала в фоторецепторной клетке с передачей гормонального сигнала усиливается тем, что трансдуцин и G-белок имеют не только общие функции, но и общую структуру. Все исследованные к настоящему Рис. 73. Сравнение путей передачи гормонального и времени белки этой группы имеют идентичные бетта-субъединицы, а а-субъединица выполняет сходные функции. Исследование первичной структуры трансдуцина и трех G-белков из различных клеток выявило, что более 50% их по- липептидных цепей практически гомологичны. При этом в составе а-субъединиц как трансдуцина, так и G-белков имеются как консервативные мотивы, так и мотивы, возникающие в ходе эволюции. И G-белки, и трансдуцин имеют три центра связывания: для рецептора, для гуаниловых нуклеотиодов для белка-эффектора (аденилатциклазы рецептор и трансдуцина). для комплекса фосфодиэсте-разы Наиболее последовательностями гормонв случае консервативными аминокислот обладают центры связывания гуаниловых нуклеотидов. Интересно, что участки связывания гуаниловых нуклеотидов в G-белках и трансдуцине оказались гомологичны областями связывания ГТФ в белке совершенно другого класса, в так называемом факторе элонгации. Этот фактор участвует в синтезе белка, образует комплекс цГМФ с молекулами аминоацил-тРНК и обеспечивая доставку аминокислот к месту удлинения полипептидной цепи. Цикл функционирования этого белка похож на цикл G-белков и трансдуцина - в основе его лежит механизм расщепления связанного в активном центре цГМФ. Возможно, что фактор элонгации является эволюционным предком транс-дуцина и G-белков. Если это так, мы имеем еще одно подтверждение единства путей биохимической эволюции. Однажды найденный природой механизм используется для решения многих сходных задач. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ОБОНЯНИЯ В начале 50-х годов ХХ в. Эрл Сёзерленд на примере адреналина, стимулирующего образование глюкозы из гликогена, расшифровал принципы действия адреналинового рецептора, который оказался общим для широкого круга рецепторов. Уже в конце ХХ в. было обнаружено, что восприятие запахов осуществляется аналогичным образом, вплоть до деталей строения белков-рецепторов. Первичные рецепторные белки - это весьма сложные молекулы, связывание которых со своими субстратами вызывает в них ощутимые структурные изменения. Карман Субстрат обонятельного J ^J рецептора Рис. 66. Схема строения обонятельного рецептора Туг 278 J ^ вслед за которыми начинается каскад каталитических (ферментативных) реакций. Для рецептора запаха (одорантного), так же как и для зрительного рецептора, этот процесс завершается нервным импульсом, воспринимаемым нервными клетками соответствующих отделов мозга. На рис. 66 схематически показан механизм Pne104, I] адреналинового рецептора. последним действия Согласно данным, строение одорантного рецептора совершенно аналогично. Как видно на рисунке 74 рецепторный белок включает такую аминокислот, последовательность которая содержит семь гидрофобных регионов от 20 до 28 остатков в каждом. Эти полипептидные участки, свернутые в а-спираль, образуют микротрубочки. Таким образом, рецепторный интегральный белок представляет собой своеобразную пачку из семи микротрубочек, Толщина пересекающих липидного бислоя мембрану. в мембране составляет 30 А, а длина одного остатка в аспирали равна 1,5 А. Пептидные участки в 20-28 остатков на а-спиральном участке белковой молекулы имеют достаточную длину, чтобы пересечь мембрану. Такая структура инте- гральных белков характерна для рецепторов опсина в сетчатке глаза, рецепторов серотонина, адреналина, гистамина и одорантов. С внешней стороны клеточной мембраны белок-рецептор представляет собой розетку, построенную однотипно для разных рецепторных к Рис. 75. Схематическая диаграмма строения обонятельного жгутика и два химических механизма усиления сигнала запаха внутри обонятельного волоска I - мембранный интегральный комплекс - рецептор (R) + ГТФсвязывающий белок (G) + аденилатциклаза (АЦ); II - мембранный интегральный комплекс - рецептор (R) + ГТФ-связывающий белок + фосфолипаза С (ФЛС). систем. На рис. 74 взаимодействия между (синтетический одорант) рецепторов крысы, гидрофобными представлена схема молекулой лирала и обонятельным представленным пятью доменами Согласно этим представлениям, обонятельный рецептор образован доменами семью мембранного связывающие формируют гидрофобными белка. Лиганд- аминокислотные «карман», остатки расположенный, по крайней мере, на расстоянии 12 А от поверхности клетки. Он похож на аналогичный центр рецептора адреналина и связывающий карман других надмолекулярных комплексов, гидрофобных также мембранных содержащих спиральных по доменов семь внутри мембранной структуры. В мембране представлены обонятельного обе триады волоска мембранных интегральных белков, представляющих собой нековалентно связанные рецепторы, G-белки и ферменты, образующие соответствующие вторичные мессенджеры, которые запускают внутриклеточный каскад реакций (рис. 75). Таким образом, фосфорилирование протеинкиназами и соответствующими белков дефосфорилирование фосфатазами их оказалось универсальным механизмом мгновенного ответа клетки на внешнее воздействие. В результате фосфорилирования мембранных белков открываются каналы проводимости катионов, и, как следствие, мгновенно меняется мембранный потенциал клетки, в результате чего генерируется потенциал действия. Последний передается по аксону в обонятельную луковицу, где и происходит биологически оценка и значимых отделение сигналов от обонятельного «шума», а затем отобранные сигналы направляются в мозг, где и вызывают поведенческий ответ. БИОФИЗИКА ТАКТИЛЬНОГО ВОСПРИЯТИЕ И МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ Функционирование ионных каналов может зависеть от локального растяжения мембраны и изменения градиента ее кривизны. Канальные структуры, которые изменяют свою активность в зависимости от натяжения мембраны, называются механо-чувствительными, хотя кроме них описаны каналы, увеличивающие активность и при обратном изменении натяжения. Впервые Са2+-проводящие механо-чувствительные каналы были показаны на эндотелиальных клетках животных, где они выполняют роль сенсора кровяного давления. Каналы с аналогичными свойствами были обнаружены в бактериях, грибах и высших растениях. Функционирование механо-чувствительных каналов происходит в тесном взаимодействии с цитоскелетом. Чувствительность этих каналов к натяжению возрастает, если сила, приложенная к большому участку мембраны, концентрируется на канале посредством элементов цитоскелета. Связь осуществляется набором белков, известных как анкирины . Выделяют два типа каналов, чувствительных к натяжению мембраны: SA-каналы активирующиеся activated), мембраны и которые при SI-каналы при (stretch- растяжении (stretch-inactivated), растяжении мембраны инактивируются. В зависимости от объекта и типа клетки встречаются механо-чувствительные каналы, селективные к К+, Cl-, а также Са2+ и другим двухвалентным одно- и катионам, проницаемые для катионов, и слабоселективные) для двухвалентных неселективные (или анионов и катионов. Наиболее часто в качестве ингибитора механо-чувствительных каналов используют гадолиний (Gd3+), который обратимо блокирует работу каналов в низких концентрациях (10 мкМ), действуя с наружной стороны мембраны. В отличие от рецептор- и потенциал-зависимых ионных каналов, механочувствительные каналы имеют гораздо меньшую плотность распределения в мембранах (она составляет в среднем 1/мкм2). Обратите внимание, что при мембранном потенциале -60 мВ кальциевый ток через SA-канал может достигать величин 0,1 нА. Наиболее важное значение механочувствительные ионные каналы имеют в ростовых регуляции движениях различного работы аппарата типа и в устьица. Механическое взаимодействие клеток в ходе их развития приводит к натяжению (или сдвигам) клеточных мембран, активации механочувствительных каналов и появлению векторных ионных непосредственно потоков, которые осуществляют уже регуляцию процессов роста и дифференцировки. У млекопитающих (в том числе, у человека) функционирование механо-рецепторов выстилки слизистой желудка обеспечивают ощущение сытости. При генетическом нарушении этих каналов возникают заболевания, приводящие к булимии. БИОФИЗИКА ТРАНСПОРТА МАКРОМОЛЕКУЛ В КЛЕТКУ Известно, что информация может передаваться в клетку не только с помощью ионных каналов или цепи реакций, регулируемых G-белками. На поверхности рецепторы, некоторых клеток способные имеются распознавать макромолекулы и «организовывать» их перенос через мембрану внутрь клетки. К таким клеткам относятся макрофаги, осуществляющие один из первых актов активации иммунной системы. В этом случае участок плазматической мембраны обволакивает захватываемый материал, который в итоге попадает внутрь клетки. В процессе этого акта он заключается в мембранный пузыреквезикулу, стенки которой образуются из участков плазматической мембраны. Этот процесс называется эндоцитозом. Существуют три вида эндоцитоза: 1) фагоцитоз - захват клеткой больших структурных компонентов, вплоть до целых клеток, например клеток бактерий одноклеточными организмами и макрофагами; 2) пиноцитоз - неспецифический захват клетками внеклеточной жидкости и ее содержимого; 3) специфический захват молекул, опосредованный специальными рецепторами (рис. 78). В этом разделе мы рассмотрим только специфический эндоцитоз. Впервые эндоцитоз, обусловленный специфическими рецепторами, был обнаружен в середине прошлого века при изучении явления захвата яйцеклетками белков, которые используются для питания зародыша. Позднее было выяснено, что некоторые белки синтезируются в печени, оттуда переносятся руслом крови к яичникам, там связываются со специфическими рецепторами плазматической мембраны ооцита, а затем происходит «впячивание» плазматической мембраны, после чего рецептор с белком попадает внутрь клетки. Экщитоз Рис. 78. мембранного Эндацитз фагоцитоз Схематическое транспорта изображение между внутриклеточными вакуолями и плазматической мембраной ЭР - эндоплазматический ретикулум, СГ секреторная гранула, СВ - секреторная везикула, Л - лизосома, Э1 - периферическая эндосо-ма, Э2 - перинуклеарная эндосома, ОВ - окаймленная везикула, ОЯ окаймленная - ямка, РВ - рециклируюшаяся везикула, ФЛ - фаголи-зосома, Ф - фагосома, Г - аппарат Гольджи. У млекопитающих по механизму опосредованного специфическими рецепторами эндоцитоза передаются структурные носители иммунитета от материнского организма к плоду. Антитела из кровотока материнского организма связываются с клетками плода, окружающими желточный мешок. На поверхности этих клеток имеются рецепторы, связывающиеся с специфически иммуноглобулинами и переносящие их в кровоток плода. Клетки иммунной функционируют с системы помощью также эндоцитоза. Макрофаги захватывают антиген, внутри клетки он претерпевает процессинг расщепление - гидролитическими ферментами с вычленением сравнительно небольших фрагментов, несущих отдельные антигенные детерминанты. Заключительный этап этого процесса - экспрессия фрагментов антигена на поверхность макрофага, где они оказываются в комплексе с собственными антигенами гистосовместимости II класса (которые можно рассматривать как своего рода рецепторы). Далее запускается специфическая цепь иммунологических реакций, в которой участвуют лимфоциты различных типов. В основе пиноцитоза и опосредованного рецепторами поглощения растворенных веществ лежит образование окаймленных ямок и окаймленных везикул. Термин «окаймленные ямки» относится к морфологии этих структур, выявляемой с помощью электронной микроскопии. Отличительной их особенностью является наличие решетчатой структуры из молекул белка клатрина, который связывается с углублениями на поверхности плазматической мембраны и везикулами, образующимися из таких ямок. На долю окаймленных ямок обычно приходится 1-2% общей плазматической белков площади мембраны, плазматической обнаруживаются на этих поверхности и большинство мембраны участках. не Однако определенные белки концентрируются в области формирования окаймленных ямок (возможно, с помощью специальных механизмов), и концентрация некоторых белков в этих ямках очень высока. Как показано в модельных экспериментах in vitro, после образования эндоцитозных везикул оболочка из клатрина удаляется специфическим белком в ходе АТФ-зависимой Везикулы без клатрина сложной системы реакции. становятся трубочек и частью везикул, называемых периферическими эндосомами; они локализованы вблизи плазматической мембраны. Конечный пункт эндоцитозного пути находится во вторичных лизосомах, где происходит деградация отдельных растворенных веществ (таких, как ЛНП). В табл. 12 перечислены некоторые рецепторы плазматической мембраны, участвующие в поглощении специфических лигандов с помощью окаймленных ямок и везикул. В некоторых случаях сродство рецептора к окаймленным ямкам постоянно, в других случаях рецепторы концентрируются в этих структурах только при связывании лиганда (например, рецептор фактора роста эпидермиса). Примерно 70% рецепторов ЛНП сконцентрировано в клатриновых ямках, где они легко подвергаются интернализации. Физиологический смысл этого явления заключается в том что с рецепторами клетками помощью эндоцитоза ЛНП из опосредованного происходит кровяного русла. захват Этот механизм представляет собой основной путь «доставки» холестерина к клеткам. Таблица 12. Некоторые рецепторы, интернализуемые при эндоцитозе __________ Группы IgA/IgM-рецептор, IgGрецепторов рецептор Трансферриновый I.Рецептор возвращается к рецептор клеточной поверхности, лиганд поступает в лизосомы II.Рецептор и лиганд поступают в лизосомы Ш. Трансцитоз IV. Рецептор и лиганд возвращаются к одному и тому же домену плазматической мембраны _________ __________ Примеры рецепторов Рецепторы маннозы, асиалогликопротеи-на (галактозы), маннозо-6фосфата, у-макроглобулина, ЛНП Рецепторы ФРЭ, инсулиновый Рецепторы липиды низкой плотности (ЛНП) были открыты на мембранах фибробластов в конце ХХ в. Оказалось, что они специфически связывают ЛНП за счет «узнавания» апопротеина или 5-100 апопротеина специфичность узнавания Е. так При этом велика, что связывание происходит даже при концентрации ЛНП 10-9М. Рецепторы ЛНП присутствуют практически во всех тканях, наибольшая их плотность наблюдается в клетках печени, надпочечников и яичников - органах, испытывающих наибольшую потребность в холестерине. ЛНП-рецептор человека это - типичный рецептор группы I, который возвращается к плазматической мембране, в то время как его лиганд, сывороточный лизосому. По данным ЛНП, об попадает в аминокислотной последовательности рецептора он состоит из пяти доменов. Выраженная гомология с другими мембранными рецепторами отсутствует. Рецептор имеет единственный трансмембранный домен и непротяженный цитоплазматический Сконцевой домен. Показано, что у лиц с таким генетическим заболеванием, как семейная гиперхолестеролемия, функция ЛНП-рецепторов существенно ослаблена. В настоящее время эти биофизические механизмы используются в методологии адресной доставки разработке лекарств нанобиотехнологии ядерной медицины. и ДАЛЕЕ ИДЕТ ЛЕКЦИЯ ПО СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫМ РЕАКЦИЯМ Лекция. Биофизика воздействия электромагнитного излучения и поля Поле – форма материи, посредством которой осуществляется частицами взаимодействие вещества или между телами. Полю свойственны непрерывность в пространстве и отсутствие массы покоя. Поле и вещество неразрывно связаны, образуя единую материю нашего мира. Электромагнитной (ЭМ) волной называется процесс распространения в пространстве взаимоиндуцирующих друг друга переменных электрических и магнитных полей. Основные положения об ЭМ поле были сформулированы английским физиком объединившим в рамках Максвеллом, единой теории электрические и магнитные явления. Им было показано, что ЭМ волны распространяются в среде с конечной напряженности скоростью, электрического поля векторы Е и магнитного поля Н взаимно-перпендикулярны и фазы их колебаний одинаковы. Для плоской гармонической ЭМ волны, распространяющейся в изотропной среде без затухания: -длиной волны называется расстояние между двумя ближайшими точками, колебания величин Е и Н в которых происходят в одинаковой фазе. -скорость распространения ЭМ волны в вакууме (с) есть величина постоянная. Важнейшей характеристикой волны является интенсивность (I): – среднее количество энергии Wcp, переносимое волной за единицу времени через единичную площадку, расположенную перпендикулярно направлению распространения волны. Вместе с тем Планк показал, что для объяснения излучения закона равновесного необходимо принять теплового гипотезу о дискретном характере излучения, полагая, что энергия излучения кратна некоторой величине е, названная им квантом энергии. В дальнейшем трудами показано, Эйнштейна что и ряда ученых ЭМ-излучение не было только испускается, но и распространяется квантами. Так возникло представление о частицах света фотонах, несущих квант энергии Еи движущихся со скоростью света. РИСУНОК окружающего Понятие мира», «физические очевидно, поля является широким и может включать в себя многие явления в зависимости от целей и контекста изучения. Если употреблять его в строго физическом смысле, то есть как вид материи, то следует иметь электрическое, в виду, магнитное, прежде всего электромагнитное, гравитационное поля и поле внутриядерных сил. В это понятие могут быть включены потоки ионизирующих частиц, акустические и вибрационные поля, атмосферные изменения и ряд других. Вся биосфера Земли: простейшие, обширные царства растений и животных и человек – находится в окружении единого материального мира, составляющего ее среду обитания. Сфера обитания является развития жизни неотъемлемым и условием одновременно суммой факторов, влияющих на живые организмы и определяющих Одним из эволюцию живой существенных природы. факторов сферы обитания являются потоки излучений, действию которых подвергается все живое на Земле. Это электромагнитные волны, в океане которых находится Земля, межзвездное и галактическое пространство, и ионизирующие излучения. При авариях на АЭС или при ядерных взрывах в атмосферу могут выбрасываться различные радионуклиды. Эти изотопы могут накапливаться в организме, вызывая в нем нарушение деятельности, как отдельных органов, так и организма в целом. Особую опасность представляют повышенные дозы радиоактивных излучений для кроветворной системы, пищеварительного тракта и желез внутренней секреции человека. (РИС. ПЛАТОНОВ) Ионизирующее биологических излучение объектах вызывает в различные патологические изменения, крайним проявлением которых является гибель организмов. Степень и характер эффектов проявления зависят радиобиологических от различных факторов радиации, характеризующих условия облучения, и от биологических факторов, характеризующих объект облучения. К радиационным факторам относят: –место расположения источника излучения по отношению к облучаемому организму; –вид ионизирующего излучения; –пространственное распределение дозы ионизирующего излучения в организме; –кинетика распределение дозы ионизирующего излучения; –доза облучения. К биологическим факторам относят: вид живого организма, возраст, пол, физиологическое состояние, используемая пища и т.д. В зависимости от места расположения источника излучения по отношению к облучаемому биологическому объекту облучение может быть: 1) внешним –когда источник излучения находится во внешней среде вне облучаемого организма; 2) внутренним –когда облучение происходит в результате воздействия излучения от попавших в организм (радионуклидов); радиоактивных веществ 3) комбинированным –в реальной экологической обстановке встречается наиболее часто. Проникновение организм (инкорпорирование) радиоактивных веществ в может осуществляться различными путями: 1) ингаляционным путем (т.е. с вдыхаемым воздухом); 2) алиментарным, или пероральным путем (т.е. с продуктами питания и водой); 3) перкутанным путем (т.е. через кожные покровы); 4) через слизистые оболочки (глаза); 5) через раны. Инкорпорированные радионуклиды в в организм зависимости от своих химических и физико-химических свойств могут распределяться в организме либо равномерно, либо неравномерно – органотропно, т.е. преимущественно в определенных органах и тканях. Для большинства радионуклидов характерна неравномерность распределения в организме, т.е. органотропность. Соответственно органы и ткани, в которых накапливается тот или иной радионуклид, подвергаются бóльшему радиационному поражению при поступлении в организм этих радионуклидов. Отметим, что в некоторых случаях тип распределения радионуклида может меняться. В частности, распределение кислорода, азота, водорода и углерода зависит от тех химических соединений, в составе которых они поступают в организм. Снижение содержания попавших в организм радионуклидов происходит главным образом через желудочно-кишечный тракт (т.е. с калом) и почки (т.е. с мочой), в меньшей степени –через легкие (с выдыхаемым воздухом) и кожу (с потом), а также с молоком и плодом (например, яйца). Скорость выделения радионуклидов связана с их физико- химическими свойствами. Основное количество радионуклидов выводится в первые дни после поступления в организм. Быстрее всего выводятся из организма благородные газообразные радионуклиды, например радон (несколько часов). Из мягких тканей радионуклиды обычно выводятся быстрее, чем из костной ткани. Покзано, что уменьшение количества радионуклидов в организме осуществляется по экспоненциальному закону в результате двух процессов: биологического выведения и радиоактивного распада. Ct = C0 ⋅e−λэффt = C0 ⋅e−(λбиол+λрасп)t . Константа λэфф называется константой эффективного выведения и представляет собой сумму константы биологического выведения λбиол и константы радиоактивного распада λрасп. Вместо константы эффективного выведения часто пользуются величиной эффективного периода полувыведения. Эффективный период полувыведения представляет собой время, в течение которого содержание радионуклида в организме (или в органе) снижается вдвое. Константа эффективного выведения и эффективный период полувыведения связаны следующими соотношениями: Tэфф = 0,693λэфф или λэфф = 0,693Tэфф . Обратите внимание, что эффективный период полувыведения долгоживущих радионуклидов (т.е. имеющих большой период полураспада Tрасп) определяется в основном биологическим периодом полувыведения Tбиол, а эффективный период полувыведения короткоживущих радионуклидов (т.е. имеющих небольшой период полураспада Tрасп) определяется в основном периодом полураспада Tрасп. Эффективный существенно период зависит от полувыведения вида, возраста, функционального состояния организма. Радиобиологические эффекты в значительной степени зависят от вида ионизирующего излучения, воздействующего на биологический объект. имеют: Наибольшее практическое рентгеновское излучение, значение гамма- излучение, бета-излучение, альфа-излучение, нейтронное излучение. При внешнем облучении наибольшую опасность представляют те виды ионизирующих излучений, которые обладают наиболее высокой проникающей способностью, т.е. нейтронное, гамма- и рентгеновское излучения. Альфа-излучение из-за низкой проникающей способности (в живой ткани –до 130 мкм) практически не представляет опасности при внешнем облучении организмов, размеры которых значительно превышают проникающей способности α-излучения. Наружный слой кожи, образованный отмершими клетками, ткань одежды практически полностью задерживают α-излучение. Однако при внешнем облучении организмов, сравнимых по размерам с величиной проникающей способности α-излучения (например, одноклеточных организмов), а также при внутреннем облучении более крупных биологических объектов (т.е., когда процесс попавших в α-распада организм, радионуклидов, осуществляется в непосредственной близости от жизненно важных клеток организма) чрезвычайно α- опасным. излучение В этих является случаях α- излучение при одинаковой поглощенной дозе гораздо опаснее γ-излучения –в среднем способность α-излучения повреждать клетки в 20 раз выше, чем у γ-излучения. Проникающая способность β-излучения занимает промежуточное положение между α- и γ-излучениями: пробег в живой ткани составляет 1-1,5 см. Поэтому при внешнем облучении относительно крупных организмов (например, человека) поражающему действию β-излучения подвержены в основном только внешние ткани – кожа и глаза. Наибольшую опасность β- излучение представляет (как и α-излучение) при внутреннем облучении. Способность β-излучения повреждать биологические клетки такая же, как у γ-излучения (при одинаковой поглощенной дозе). Важным фактором, в значительной степени определяющим является радиобиологический пространственное эффект, распределение поглощенной дозы ионизирующего излучения в облучаемом организме. В зависимости от того, подвергается ли воздействию излучения весь организм или только какая-либо его часть, облучение разделяют на следующие типы: 1) общее (или тотальное) облучение – воздействию излучения подвергается все тело; 2) субтотальное облучение – воздействию излучения подвергается бóльшая часть тела при защитном экранировании (например, свинцовыми пластинами) отдельных его областей или органов (например, головы, области живота, грудной клетки, конечностей, половых органов, и т.д.); 3) парциальное облучение –воздействию излучения подвергается отдельная область тела (например, голова, живот, грудная клетка и т.д.); 4) локальное облучение –воздействию узких пучков излучения подвергается отдельный орган или небольшой участок тела. Обратите внимание, что все перечисленные типы облучения применяют в экспериментальной радиобиологии. парциальное В и частности, локальное субтотальное, облучения в экспериментальной радиобиологии применяют для оценки значения нарушения функционирования отдельных органов и тканей в развитии лучевого поражения организма. При аварийных ситуациях происходит обычно либо общее, либо парциальное облучение.Локальное и парциальное облучения используют в лучевой терапии для лечения различных заболеваний, главным образом злокачественных опухолей. Следует отметить, что общее облучение не подразумевает наличия равномерности облучения всего организма. Даже в условиях помещения облучаемого организма в равномерное поле глубоко-проникающего γ- или рентгеновского излучения более удаленные от источника излучения области тела получают меньшую поглощенную дозу излучения вследствие экранирования их менее удаленными областями тела. Степень неравномерности облучения в первом приближении можно оценить учитывая, что живая ткань на 90% состоит из воды, а слой половинного ослабления для наиболее часто используемых в радиобиологических экспериментах жестких рентгеновских лучей с энергией 250 кэВ составляет для воды 5,5 см. Для достижения бóльшей равномерности облучения внутри объектов вместо используют крупных биологических рентгеновских γ-излучение 60Co лучей (обладающее энергией 1,17 и 1,33 МэВ); слой половинного ослабления в воде в этом случае составляет несколько более 10 см. Бóльшую равномерность облучения крупных достигают также двустороннего, биологических путем объектов использования четырехстороннего или многостороннего облучения. Принято считать, что облучение является равномерным, если различия в распределении поглощенной дозы в облучаемом организме не превышает ±10%. Для большинства радиобиологических эффектов исключительно важное значение имеет динамика распределения поглощенной дозы, т.е. длительность облучения, а также наличие или отсутствие перерывов в облучении. Основным показателем, характеризующим распределение поглощенной дозы во времени, является мощность поглощенной дозы (часто говорят мощность дозы облучения). На практике единицу поглощенной дозы часто применяют с кратными или дольными приставками (обычно – кило, санти, милли и микро), а в качестве единицы времени используют также минуту, час, сутки, неделя, год. Поэтому в качестве внесистемных единиц мощности поглощенной дозы часто используют Гр/мин, сГр/сут, кГр/час и т.п. В зависимости от длительности облучения, величины используемой мощности поглощенной дозы, наличия или отсутствия перерывов между облучениями условно можно выделить следующие четыре основные типа облучения: 1) острое (или кратковремееное) облучение – лучевое воздействие при большой мощности дозы (ориентировочно от 0,1 Гр/мин и выше) длительностью от нескольких секунд до 2 часов; 2) пролонгированное облучение –лучевое (или протяженное) воздействие при сравнительно небольшой мощности дозы (от 0,1 Гр/час и ниже) длительностью от 2 часов до нескольких недель; 3) дробное (или фракционированное) облучение – многократное лучевое воздействие с любой мощностью дозы (чаще при высокой мощности дозы в каждой фракции) с временными интервалами между фракциями облучения; 4) хроническое облучение –лучевое воздействие длительностью от нескольких месяцев до нескольких лет, осуществляемое либо постоянно (т.е. без перерывов) при низкой мощности дозы (порядка 0,01 фракционированно Гр/сут (т.е. и ниже), с либо некоторыми перерывами) в небольших разовых дозах при любой мощности дозы. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют, что фракционирование дозы и снижение мощности дозы приводит обычно к ослаблению большинства биологических эффектов (при одной и той же поглощенной дозе), причем эффект может снижаться весьма существенно –в несколько раз. Наиболее сильное ослабление радиобиологических реакций наблюдается при снижении мощности дозы в диапазоне от нескольких единиц до долей рад/мин. В диапазоне от сотен до десятков рад/мин ослабление менее выражено. Однако, в области сверхвысоких мощностей дозы (выше нескольких тысяч противоположная рад/мин) возможна зависимость величины радиобиологического эффекта от мощности дозы, т.е. наблюдается снижение эффекта с увеличением мощности дозы. Таким величины образом, в целом зависимость радиобиологического эффекта от величины мощности дозы не является линейной, а имеет куполообразный характер. Ослабление снижении эффекта мощности фракционировании облучения дозы дозы или связано при при с осуществлением в организме восстановительных (репарационных) которых часть процессов, радиационных в результате повреждений клеточных структур к моменту следующего взаимодействия с ними кванта излучения успевает репарироваться. (СМ, ПЛАТОНОВА). Эта репарация, однако, не успевает произойти при более высокой мощности дозы, т.е., когда попадание квантов излучения в клеточную структуру происходит более часто. В результате этого чаще возникают невосстанавливаемые (нерепарируемые, нерепарабельные) повреждения клеточных структур (пример – двунитиевые повреждения ДНК). По этой же причине ослабление эффекта облучения при снижении мощности дозы выражено отчётливее в случае редкоионизирующих γ- и рентгеновского излучений и может быть значительно слабее или даже полностью отсутствовать при действии плотноионизирующих излучений, вызывающих значительно более тяжелые, невосстанавливаемые повреждения. Эффект ослабления более характерен также для тех тканей организма, которые обладают высокой пролиферативной соответственно более активностью высоким и уровнем восстановительных (репарационных) процессов. Особенно отчетливо этот эффект наблюдается при лучевом поражении слизистой тонкой кишки. При лучевом воздействии на ткани с низким уровнем пролиферативной восстановительных нервную ткань, процессов печень, активности и (например, на мышцы) феномен ослабления эффекта облучения при снижении мощности дозы отсутствует менее при выражен воздействии или любых даже видов ионизирующих излучений. Одним из наиболее часто применяемых критериев оценки действия излучения на биологические объекты является такой четко регистрируемый интегральный показатель как гибель организма, являющаяся конечным итогом многочисленных нарушений, происходящих при лучевом поражении. Оценку летального действия излучения на биологические объекты проводят на основе изучения зависимости гибели или выживаемости организмов от дозы облучения (т.е. от поглощенной дозы). Срок наблюдения, в течение которого обычно регистрируется гибель (или выживаемость) зависит, в частности от вида используемого объекта. При исследовании летального действия излучения на большинство видов позвоночных животных срок наблюдения составляет обычно некоторых видов 30 суток позвоночных (однако, для этот срок составляет 60 суток). Полулетальная доза –это доза облучения, при действии которой погибает 50% облученных организмов. Эту дозу обозначают как ЛД50 или ЛД50/30 (ЛД50/60), где в знаменателе подстрочного индекса указывают срок (в сутках), в течение которого наблюдают за гибелью. Минимальная (МАЛД) абсолютно-летальная –минимальная доза, доза вызывающую гибель всех облученных организмов. Минимальная летальная доза (МЛД) – практически та максимальная доза, которая не вызывает гибели ни одного из облученных организмов. Строго говоря, термины «минимальная абсолютно летальная доза» и «минимальная летальная доза» не совсем правомерны. Поэтому обычно за минимальную абсолютно летальную дозу принимают дозу, вызывающую гибель 99% объектов (ЛД99), а за минимальную летальную дозу –дозу, вызывающую гибель 1% объектов (ЛД1). Дозы облучения, в диапазоне от минимальной летальной дозы до минимальной абсолютно летальной летальными дозами. минимальную дозы, Дозы, абсолютно называют превышающие летальную дозу, определяют как сверхлетальные. Дозы, лежащие ниже минимальной летальной дозы –как сублетальные. Биологические факторы, определяющие радиобиологические эффекты Величина радиобиологического эффекта (при одной и той же дозе облучения) существенно зависит от вида облучаемого биологического эффекта. Иными словами биологические объекты обладают различной радиочувствительностью. Термин радиочувствительность используется в радиобиологии широко и означает поражаемость биологических объектов (клеток, тканей, органов или организма ионизирующим в целом) излучением. Радиочувствительность живых организмов широко варьирует в зависимости от их видовой принадлежности. радиочувствительности Сравнение обычно проводят по величине полулетальной дозы ЛД50. Чем выше значение ЛД50, тем ниже радиочувствительность; чем ниже значение ЛД50, тем выше радиочувствительность. Наиболее радиочувствительными являются млекопитающие, для которых полулетальные дозы варьируют для разных видов в основном от 1,5 до 15 Гр. Напротив, наиболее высокой радиоустойчивостью (радиорезистентностью) обладают простейшие, бактерии и вирусы, для которых ЛД50 может достигать нескольких тысяч грей. Таким образом, в целом по мере усложнения биологической организации радиочувствительность существенно повышается. Однако встречаются и исключения, когда среди низших филогенетических обнаруживаются отдельные групп виды, радиочувствительность которых очень высока и сравнима с таковой для млекопитающих (или даже превышает ее). В целом для низших филогенетических групп характерна значительно большая вариабельность радиочувствительности, чем для высших. Наиболее радиоустойчивым из известных биологических объектов является бактерия Micrococcus radiodurans, обнаруженная в воде охлаждающего канала американского ядерного реактора, где мощность дозы составляла 100 тысяч Гр/сут. В таких суровых условиях эти бактерии не погибали, размножались, в общем, прекрасно себя чувствовали, за что и получили своё название. Приведенные данные о радиочувствительности различных биологических объектов относятся к взрослым организмам. Однако многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют, что в процессе онтогенетического радиочувствительность существенно данные в насекомых, организмов изменяться. этом развития Наиболее отношении может четкие получены радиочувствительность для которых резко снижается в ходе онтогенеза. Обратите внимание, что у млекопитающих взрослые половозрелые радиоустойчивы, животные более а особи молодые относительно и стареющие радиочувствительны. У новорожденных радиочувствительность может быть либо относительно высокой, либо низкой, в зависимости от видовой принадлежности животных. Однако, наиболее чувствительным к действию ионизирующих излучений (т.е. наиболее радиопоражаемым) у млекопитающих является период (пренатального) развития. экстраполяции животных, внутриутробного данных, На основании полученных считают, что на наиболее радиочувствительным периодом внутриутробного развития человека является интервал от оплодотворения до примерно 38-х суток (5,5 недель). Наибольшую встречаемость уродств и гибели новорожденных следует ожидать при облучении в период между 18 и 38 сутками эмбрионального развития, т.е. в период, когда интенсивно осуществляется обособление зачатков и формирование основных органов и тканей. Эти данные, однако, не означают, что при облучении в более поздние сроки (в плодный период) не могут происходить более тонкие функциональные нарушения, индуцированные облучением. Обследование лиц, подвергшихся облучению во время атомных бомбардировок в Японии, показало, что наиболее критическим периодом в отношении умственного развития человека (а именно, появления является период внутриутробного облучение в умственной от 8 развития. этот период до отсталости) 15 недели Показано, что внутриутробного развития даже в дозах 0,1-0,2 Гр может вызвать заметное увеличение встречаемости умственной отсталости. При облучении в период от 15 до 25 недели внутриутробного развития частота умственной отсталости была в 4 раза ниже, чем при облучении в период от 8 до 15 недели. При облучении в период до 8 недели или после 25 недели появление умственной отсталости не было отмечено. Дозы порядка 0,1 Гр достоверно повышают также встречаемость новообразований у злокачественных лиц, подвергшихся облучению на стадии внутриутробного развития (особенно в течение последних трех месяцев внутриутробного развития). Доза 0,1 Гр (10 рад) рассматривается радиологами как предельная доза для наиболее чувствительного периода внутриутробного развития (от 10 дней до 26 недель), выше которой беременным пациенткам можно рекомендовать осуществление аборта, чтобы избежать возможности рождения ребенка с заметными дефектами. Общей половых закономерности различий в относительно радиочувствительности живых организмов не существует. Даже разные линии животных одного вида (например, мышей) могут иметь противоположные половые различия в радиочувствительности: у одних линий более радиочувствительными являются самки, у других –самцы. Но устойчивы к все же обычно действию самки облучения. более Однако обычно половые различия в радиочувствительности не превышают 10-15%. Физиологическое состояние животных может вносить определенные изменения в степень и время проявления радиационного поражения. Так, широко известны эксперименты, в которых при облучении животных, находящихся в состоянии естественной спячки (например, у сусликов), развитие существенно лучевого замедлялось. поражения Однако после пробуждения лучевое поражение в большинстве случаев развивалось также, как и у бодрствующих животных, т.е. выживаемость не изменялась, увеличивалось лишь время жизни животных. Тем не эксперименты, впадающие в в менее, известны которых также животные, не спячку, но естественную находящиеся в состоянии глубокого охлаждения во время облучения, проявляли и более высокую постлучевую выживаемость по сравнению с неохлажденными во время облучения животными. Таким образом, состояние обмена веществ в организме в момент облучения может в определенной степени влиять на развитие лучевого поражения: в большинстве случаев повышение интенсивности обмена веществ в момент облучения увеличивает радиочувствительность. Развитие лучевого поражения в некоторой степени зависит и от используемой диеты. Наличие в пище витаминов, различных микроэлементов, повышающих общую резистентность организма, увеличивает и его радиоустойчивость. В литературе имеется большое количество сообщений о благоприятном влиянии витаминов Е, А, β-каротина и других, которое проявляется в частичном предотвращении лучевых эффектов и более быстром восстановлении. Известны также эксперименты, в которых включение в состав стандартной для лабораторных животных диеты определенной растительной пищи или экстрактов некоторых растений приводило к увеличению выживаемости облучаемых животных. Защитные эффекты пищевых компонентов, однако, не велики. Эффективность воздействия пищевых благоприятного компонентов при их скармливании после облучения обычно еще ниже, чем при скармливании до облучения. В общем виде кривая выживаемости клеток в полулогарифмическом масштабе состоит из двух участков: т.н. «плеча» и линейного участка. Величина плеча зависит от 1) вида излучения и 2) типа клеток. Типичные кривые выживаемости могут наблюдаться при облучении только редкоионизирующим излучением (рентгеновским или γ-излучении). плотноионизирующим При излучением облучении кривые выживаемости имеют слабовыраженное плечо или вовсе его не имеют (например, в случае αоблучения). Для обсуждения использовать «теорию результатов точечного пытались тепла», разработанную Дессауэром (Dessauer) в 1922 г. Эта теория опиралась на следующие основные идеи: –несмотря на то, что плотность поглощенной энергии в облучаемом объекте в среднем очень низкая, энергия самих актов поглощения весьма велика и поэтому в микрообъемах вещества, в которых произошли акты поглощения энергии, происходит его локальное нагревание (т.е. появление т.н. "точечного тепла"), в результате чего вещество претерпевает значительные локальные изменения, обусловленные разрывом химических связей или активацией химических реакций; –клетка гетерогенна (т.е. неоднородна) по своему объему в отношении чувствительности к облучению и имеет как исключительно важные для жизни области, повреждение которых приводит клетку к гибели, так и области, относительно несущественные для выживания клетки; –пространственное распределение появления "точечного тепла" внутри облученной клетки имеет случайный характер, т.е является чисто статистической (т.е. вероятностной) функцией. Таким образом эта теория постулировала, что конечный эффект в клетке (например, гибель) определяется вероятностью осуществления акта поглощения энергии (т.е. появления "точечного тепла") в жизненно важных (областях) клетки. При облучения вероятность микрообъемах увеличении дозы осуществления акта поглощения энергии в этих клеточных областях возрастает, при снижении дозы –уменьшается. Однако даже при очень высокой дозе облучения существует определенная вероятность того, что в каком-то количестве клеток не произошло актов поглощения энергии в жизненно важных клеточных областях и поэтому эти клетки останутся неповрежденными облучением. И наоборот –даже при очень низкой дозе существует вероятность того, что в части клеток произойдут акты поглощения энергии в жизненно важных клеточных областях, что вызовет гибель этих клеток. В дальнейших работах Дж. Кроутера (J.A. Crowther; в русскоязычной литературе встречаются также и другие варианты написания фамилии этого исследователя –Краузер, Кроузер), Д. Ли (D.E. Lea), К. Циммера (K.G. Zimmer) и Н.В. Тимофеева-Ресовского прошлого столетия в 20-30-е основные идеи годы теории точечного тепла получили дальнейшее развитие в результате чего были сформулированы два фундаментальные положения в радиобиологии. Первое положение, получившее название «принцип попадания», сформулировано Поглощение энергии может следующим в облучаемом быть образом: объеме происходит в результате дискретных актов взаимодействия квантов излучения с веществом – т.н. «попаданий», пространственное распределение которых в облучаемом объекте имеет случайный характер. Таким образом, «принцип попадания» отмечает дискретность и вероятностный (случайный) взаимодействия характер излучения с актов веществом. Фактически попаданием считается возникновение акта ионизации каких-либо молекул в облучаемом объеме. Второе положение, получившее название «теория мишени», может быть сформулировано следующим образом: Клетка имеет в своем составе как выживания исключительно области – важные т.н. для «мишени», радиационное повреждение которых приводит клетку к гибели, так и области, относительно несущественные для выживания клетки. Таким образом, «теория биологическую областей мишени» отмечает гетерогенность (микрообъемов) различных внутри клетки в отношении чувствительности к облучению и наличие внутри чувствительных клетки «мишеней» областей, – радиационное повреждение которых приводит клетку к гибели. Поражение происходить клеточных как при мишеней одном может единственном попадании в нее –это т.н. одноударные мишени, так и при нескольких попаданиях –это т.н. многоударные мишени. Более того, в клетке возможно наличие нескольких мишеней и гибель клетки может наступить лишь после того, как все они получили определенное число попаданий. В реальности анализ много-мишенных кривых гибели требует слишком много допущений и исследования влияния многих параметров и поэтому в большинстве случаев оказывается очень ненадежным. Кроме того, принцип попадания и теория мишени не учитывают наличия в клетке репарационных процессов, которые существенно затрудняют интерпретацию кривых выживаемости. В настоящее время ясно, что интерпретация кривых выживаемости клеток чисто с позиций принципа попадания и теории мишени в большинстве случаев не является корректной, так как здесь не восстановления учитываются индуцированных процессы облучением повреждений. Тем не менее, все перечисленные выше характеристики кривых выживаемости широко используются при анализе этих кривых. Принцип попадания и теория мишени имеют ряд очень важных практических приложений. Например, на основании их положений возможно определение размера мишени. Это возможно, если процесс гибили клеток (или процесс инактивации какого-либо фермента при его облучении in vitro) описывается кривой, неимеющей плеча, т.е. является одноударным процессом. В этом случае массу, молекулярную массу и объем мишени можно легко рассчитать по следующим формулам: ность мишени. Рассчитанные таким образом молекулярные массы большого числа ферментов (в данном случае речь идет не об облучении клеток, а об облучении ферментов в водных растворах) очень хорошо совпадали с их молекулярными массами, рассчитанными другими физико-химическими методами. Что же является основной клеточной мишенью при действии радиации? Очевидно, что основной мишенью в клетке является клеточное ядро, а точнее –молекулы ДНК. Тот факт, что именно ядро является основной клеточной мишенью при действии радиации, было, в частности, определению Оказалось, показано в размеров что размер экспериментах мишени в клеточной по клетке. мишени примерно совпадает с размером клеточного ядра. Отсюда следует один из важнейших выводов из принципа попадания и теории мишени: чем выше содержание ДНК, тем чувствительнее клетка к действию ионизирующего излучения. Корреляция между радиочувствительностью и количеством нуклеотидов в нуклеиновой кислоте наблюдается особенно четко, если эти биологические объекты сгруппировать в четыре группы в организации зависимости их от структурной нуклеиновых кислот и проанализировать эту корреляцию внутри каждой из них. Это следующие группы: группа вирусов с одноцепочечной ДНК и РНК, группа вирусов с двуцепочечной бактерий и ДНК, дрожжей, группа гаплоидных группа диплоидных бактерий и дрожжей, а также клеток птиц и млекопитающих. В каждой из этих групп –чем больше число нуклеотидов, тем выше радиочувствительность. Важно, что при одном и том же числе нуклеотидов вирусы с двуцепочечной ДНК примерно на порядок более устойчивы, чем вирусы с одноцепочечной ДНК и РНК, а диплоидные клетки примерно на порядок более устойчивы, чем гаплоидные клетки. Это, в частности свидетельствует о том, что наличие двух цепочек в молекуле ДНК и двойного набора хромосом (т.е. двух копий каждой из молекул ДНК) повышает надежность биологического объекта и его устойчивость к облучению. Предполагают, что второй по значению мишенью в клетке являются биологические мембраны. Однако большинство исследователей всё же считает, что это утверждение является недостаточно доказанным.
