см. вложение

Соглашение о представлении субсидии от 17.06.2014 №14.604.21.0022 с Минобрнауки
России в рамках Федеральной целевой программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014-2020 годы»
по теме: «Синтетаза цефалоспоринов-кислот»
Цефалоспорины-кислоты
«В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 17.06.2014
№14.604.21.0022 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 1 в период с
17.06.2014 по 31.12.2014 выполнялись следующие работы:
1.1 Аналитический обзор информационных источников.
1.2 Обоснование и выбор направления исследований.
1.3 Расшифровка генома штамма Escherichia coli CZ-08 – продуцента новой синтетазы
цефалоспоринов-кислот (Cephalosporin Acid Synthethase, CASA).
1.4 Идентификация методами биоинформатики гена синтетазы цефалоспоринов кислот
(CASA).
1.5 Выделение гена CASA
1.6 Создание конструкций для экспрессии гена CASA в клетках E.coli и выбор наиболее
оптимальной конструкции.
1.7 Разработка методики определения ферментативной активности CASA.
1.8 Разработка методики контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина.
1.9 Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей генома штамма
Escherichia coli CZ-08.
1.10 Проведение патентных исследований.
При этом были получены следующие результаты:
Расшифрована геномная последовательность штамма E.coli СZ-08 (ВКПМ В-10182)
с использованием платформы пиросеквенирования Roche 454 GS FLX. Выявлены
множественные различия с геномом родительского штамма ATCC9637 (рис1).
Рис.1. Общая характеристика генома штамма E.coli СZ-08 и его сравнение с геномом
штамма ATCC9637.
Методами биоинформатики идентифицирован ген CASA как прямой гомолог гена
пенициллин G ацилазы. Вывод подтвержден результатами клонирования гена, его
экспрессии, определения ферментативной активности в реакции синтеза цефазолина. Ген
CASA (PGA) штамма CZ-08 выделен методом ПЦР, клонирован в оригинальный вектор
экспрессии, получен эффективный штамм-продуцент CASA. (Рис2)
Рис 2. Система экспрессии гена CASA в клетках E.coli
Разработана аналитическая методика определения ферментативной активности
CASA, которая позволяет характеризовать по синтетазной активности биомассу клеток
рекомбинантного штамма, получаемые из нее ферментные препараты разной степени
очистки и гетерогенный биокатализатор на основе CASA (Рис3).
Рис 3. Схема кинетически-контролируемого синтеза цефазолина с помощью
синтетазы цефалоспоринов-кислот.
Разработан метод разделения компонентов реакционной смеси, образующейся при
биокаталитическом синтезе цефазолина с использованием ВЭЖХ. Метод обеспечивает
хроматографическое разделение и количественное определение обоих субстратов
процесса биокаталитического синтеза, целевого и побочного продуктов, а также
возможных примесей, содержащихся в исходных компонентах (Рис4).
Рис 4. ВЭЖХ мониторинг биосинтеза цефазолина с помощью CASA.
Разработана аналитическая методика контроля процесса биокаталитического синтеза
цефазолина, позволяющая проводить операционные испытания технологического
биокатализатора на основе CASA с целью определения таких технологических
характеристик как максимальная степень превращения бета-лактим-содержащего
субстрата в цефазолин и период полуинактивации биокатализатора, а также осуществлять
динамический контроль процесса синтеза для исследовательских целей.
Проведены патентные исследования на тему «Ферментативный синтез
цефалоспориновых антибиотиков», в результате которых выявлена патентоспособность
основных предлагаемых к реализации в проекте технических решений.
На основании аналитического обзора информационных источников по
биокаталитическому синтезу бета-лактамов-кислот сделан вывод, что работы,
запланированные по данному соглашению обладают новизной и соответствуют мировому
уровню.
Полученные на первом этапе работ результаты послужат основой для дальнейших
исследований в рамках данного проекта. Будет оптимизирована система продукции
рекомбинантной CASA, в том числе с использованием лабораторных биореакторов,
разработаны альтернативные системы экспрессии CASA. Будет разработан лабораторный
метод получения технологического биокатализатора на основе рекомбинантной CASA,
включающий стадии биосинтеза фермента, его выделения из биомассы клеток (БМК),
частичной очистки и иммобилизации. Постадийный контроль процесса получения
технологического БК будет осуществляться с использованием разработанной на первом
этапе аналитической методики определения ферментативной активности CASA. Кроме
того, с использованием методики динамического контроля процесса биокаталитического
синтеза цефазолина будет осуществлено изучение влияния условий протекания процесса
на эффективность синтеза антибиотика, а затем разработан лабораторный
технологический регламент осуществления процесса синтеза антибиотика. Разработанные
на первом этапе работ аналитические методики лягут в основу проекта Технических
условий на технологический биокатализатор на основе рекомбинантной CASA.
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном
этапе исполненными надлежащим образом.