ВАКЦИНЫ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ: КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАНДЕМИЧЕСКОЙ H5N1 DELNS1 ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Шурыгина А-П.С., Стукова М.А., Ерофеева М.К., Охапкина Е.А., Максакова В.Л., Поздеев В.К., Романовская-Романько Е.А., , Войцеховская Е.М., Вакин В.С, Васильева А.А., Кривицкая В.З., Романова Ю.Р., Егоров А.Ю., Киселев О.И. ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург. Введение. НИИ гриппа совместно с компанией АВИР Грин Хилс Биотехнолоджи (GHB) (Австрия, Вена) разрабатывает новый подход к созданию интраназальных гриппозных вакцин на основе дефектных по репликации вирусов гриппа с удаленным геном NS1 (delNS1). Делеция гена NS1 приводит к неспособности вируса реплицироваться в интерферон-компетентных клетках и организмах (Egorov et al., 1998; Garcia-Sastre et al., 1998). При интраназальном введении вакцинный вирус способен инфицировать эпителиальные клетки, но не производит инфекционное потомство, и вследствие этого не распространяется из носоглотки привитых. В то же время, несмотря на отсутствие репликации, delNS1 вакцинные вирусы являются достаточно иммуногенными из-за повышенной продукции цитокинов в месте аппликации вакцины (назальный эпителий). Местное высвобождение цитокинов, таких как интерфероны первого типа и ИЛ-1, стимулирует мукозальный иммунитет, опосредованный секреторными антителами класса IgA, цитотоксический иммунитет, а также системный В - и Т- клеточный иммунный ответ. Вследствие этого, вакцина NS1 иммуногенна и способна обеспечить перекрестную защиту даже без использования адъювантов. Безопасность и эффективность delNS1 вакцинных вирусов была продемонстрирована на различных животных моделях, в том числе приматах (Ferko et al., 2004; Romanova et al., 2009). Цель исследования. Основной задачей 1 фазы данного исследования являлась оценка безопасности и переносимости двух доз delNS1 вакцинного препарата, полученного с помощью методов обратной генетики на основе вирусного штамма A/Вьетнам/1203/04(H5N1) - вакцинный реассортант с модификацией в сайте расщепления гемагглютинина и удаленным NS1 геном. Также в задачи исследования входила оценка местного и системного иммунных ответов и фармакокинетики (вирусовыделения) данного препарата при двукратном аэрозольном интраназальном введении. Материалы и методы. Согласно протоколу исследования (фаза 1, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование) 36 здоровых добровольцев мужского и женского пола, в возрасте от 18 до 50 лет с титрами специфических антител к вирусам гриппа A H5N1 и H1N1 <1:10 были рандомизированы в соотношении 2:1 в группы, получивших вакцину (два уровня дозы: 6.8 lg и 7.5 lg ТИД50/доза) или плацебо. Оценка безопасности и переносимости вакцинного препарата производилась путем тщательного мониторинга состояния здоровья добровольцев в ходе исследования (регистрация нежелательных явлений, физикальное обследование, оторинолариногологическое обследование, лабораторные показатели). Оценка иммуногенности проводилась на 29-й день (перед второй вакцинацией) и на 57-й день (окончание исследования) по следующим критериям: местный иммунный ответ - оценка местного специфического иммунного ответа к вирусу гриппа А(H5N1) (IgA) в образцах носовых секретов методом иммуноферментного анализа (ИФА); системный иммунный ответ оценивался по выработке гемагглютинин-ингибирующих антител в образцах сыворотки крови в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и выявлению сывороточных вирус специфических IgG методом ИФА. Определение ЦТЛ иммунного ответа проводилось у МНС класс I А02 аллель позитивных добровольцев путем измерения активности Гранзима-В (Granzyme B) продуцирующих Т-клеток методом иммуноферментного бляшкообразования (ELISPOT). Фармакокинетика (вирусовыделение) оценивалась путем титрования образцов носовых смывов на культуре клеток Vero (определение ТИД50/мл) на 2-й, 3-й и 4-й день исследования. Результаты. Отмечена хорошая переносимость вакцинного препарата при двукратном интраназальном введении. Важным аспектом безопасности живых гриппозных вакцин является их потенциальная способность к репликации и последующему вирусовыделению и трансмиссии. В данном исследовании вирусовыделения ни в одной контрольной точке после вакцинации отмечено не было, что подтверждает дефектный по репликации фенотип вакцины и ее безопасность. У всех привитых добровольцев было отмечено формирование местного и системного иммунного ответов (Таблица 1). Таблица 1. Уровень сероконверсий (%) после однократной (день 29-й) и двукратной вакцинации (день 57-й) пандемической H5N1 delNS гриппозной вакцины. Доза вакцинного препарата (кол-во лиц) РТГА 29-й день 57-й день Секреторные IgA (ИФА) Сывороточные IgG (ИФА) 29-й день 29-й день 57-й день 57-й день 6,8 lg ТИД50/мл 41,7* 91,7* 0,0 45,5* 0,0 60,0* (n=12) 7,5 lg ТИД50/мл 75,0* 91,7* 18,2 45,5* 20,0 50,0* (n=12) Плацебо 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 (n=12) * p<0,05 при сравнении с группой плацебо (точный критерий Фишера). Иммунный ответ, зарегистрированный хотя бы в одном исследовании 29-й 57-й день день 66,7* 100,0* 91,7* 100,0* 0,0 0,0 После двух иммунизаций в группе низкого уровня дозы вакцины (6.8 lg ТИД50/доза) был выявлен 8-кратный прирост СГТ в РТГА, а в группе вакцинированных высокой дозой (7.5 lg ТИД50/доза) был отмечен 9.5 кратный прирост; уровень сероконверсий составил 92% в обеих группах. Уровень сероконверсий секреторных IgA был выше при двукратной вакцинации (46% для каждого уровня дозы), чем после однократной вакцинации (0% при введении низкой дозы, 18% при введении высокой дозы). Кроме того, у трех из пяти добровольцев, получивших высокую дозу вакцины, через 4 недели после вакцинации наблюдалось ≥ 3- кратное повышение Гранзим В-секретирующих Т-клеток/ 1х106 ПМЯЛ (полиморфнояденые лимфоциты) по сравнению с базовым уровнем. Повышение количества Гранзим В-секретирующих Т-клеток сохранялось и после второй вакцинации. Заключение. Данные, полученные в ходе клинического исследования I фазы, свидетельствуют о безопасности и хорошей переносимоси пандемической H5N1 delNS1 вакцины. Исследуемый препарат, несмотря на свой высоко аттенуированный фенотип (delNS1), подтвержденный отсутствием вирусовыделения вакцинного штамма, обладает высоким уровнем иммуногенной активности, формируя как местный, так и системный, иммунные ответы, уже после однократного интраназального введения.