Ильинцева Надежда Викторовна Helicobacter желудка и двенадцатиперстной кишки
advertisement
На правах рукописи Ильинцева Надежда Викторовна Гуморальный и секреторный иммунный ответ к Helicobacter pylori у детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Гервазиева Валентина Борисовна Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Костинов Михаил Петрович доктор медицинских наук Сухарева Галина Васильевна Ведущая организация: ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России Защита диссертации состоится «24» марта 2011 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер. д.5а С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Автореферат разослан «18 » феврвля 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Яковлева И.В. 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. По данным статистики за последние 20 лет распространенность хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей возросла с 99,5 до 159,5, а у подростков - с 90,9 до 157,9 на 1000 детского населения. Наряду с неуклонным ростом заболеваемости хроническим гастритом (ХГ), гастродуоденитом (ХГД), дискинезией желчевыводящих путей (ЖВП) постоянно растет удельный вес язвенно-эрозивных форм заболеваний, отмечается отчетливое омоложение патологии (Новикова В.П., 2009). Большинством исследователей в качестве этиологического фактора развития ХГ, язвенной болезни (ЯБ) и ассоциированной с лимфоидной тканью опухоли желудка признается бактерия Helicobacter pylori (H.pylori). Инфицирование H. pylori происходит в раннем детстве, обычно после первого года жизни. Распространенность H. pylori в человеческой популяции высока и составляет более 50-80%, при этом у большинства людей инфицирование H.pylori протекает бессимптомно (Blaser M.J. et al, 2008). Однако последние десятилетия характеризуются неуклонным ростом H. pylori – ассоциированных заболеваний. С одной стороны, это объясняют высокой генетической изменчивостью бактерии с быстрым формированием высокотоксигенных (CagA+) и патогенных штаммов (Atherton J.C. et al, 2009). С другой стороны, важную роль в развитии хронической гастродуоденальной патологии, ассоциированной с Н.pylori-инфекцией, отводят состоянию иммунной системы в целом и секреторного иммунитета, в частности. (Гуреев А.Н. с соавт., 2008; Денисов Н.Л. с соавт., 2008). Особый интерес представляет исследование иммунного ответа к Н.pylori у детей с неблагоприятным течением гастродуоденальных заболеваний, а также у лиц с аллергопатологией. Полагают, что у людей с атопической реактивностью иммунный ответ к H.рylori отличается Th2-направленностью и усилением синтеза соответствующих цитокинов. При этом отмечается снижение уровня H. рyloriобусловленной выработки ИФН-γ, ИЛ-10 и ТНФ-α (Maciorkowska Е. et al., 2005). 2 Известно, что в слизистой ЖКТ содержатся IgE-продуцирующие плазматические клетки, повышенное количество которых отмечается при язвенной болезни и эрозиях слизистой оболочки (СО) желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК) (Berczi L. et al., 2000), а также у лиц с аллергическими заболеваниями (Liutu M. et al., 2004). Однако роль системы IgE в гуморальном и секреторном антихеликобактерном иммунитете не определена окончательно, и это диктует необходимость дальнейших исследований. Цель исследования Выявить особенности клинического течения и состояние гуморального и секреторного иммунного ответа к Н.pylori у детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированными с атопической реактивностью. Задачи исследования 1. Выявить клинические особенности течения хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной зоны у детей, в том числе на фоне атопической реактивности. 2. Определить содержание антител IgM, IgG, IgA, IgE изотипов к H.рylori, общего IgE и ИЛ-10 в сыворотке крови детей с хроническими заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки. 3. Исследовать содержание секреторного IgA, ИЛ-17 и цитотоксина CagА H.рylori в надосадочной жидкости проб фекалий у детей с хронической гастродуоденальной патологией. 4. Определить содержание IgЕ-АТ к H.рylori и его цитотоксину CagА в надосадочной жидкости проб фекалий у детей обследуемых групп. Научная новизна 1. Показано, что у детей с аллергопатологией и сопутствующими хроническими воспалительными заболеваниями гастродуоденальной зоны антихеликобактерный IgЕ ответ преобладает над IgА (81% и 25% серопозитивных лиц, соответственно), при этом уровень IgЕ-АТ к H.pylori повышается при обострении аллергического процесса. 3 2. Выявлено, что у детей с язвенной болезнью и эрозиями слизистой оболочки гастродуоденальной зоны, а также у детей с неэффективной эрадикацией H.pylori в анамнезе IgE-АТ к H.pylori в сыворотке крови определяются реже и в более низких концентрациях, чем у здоровых. 3. Впервые показано, что положительная уреазная активность чаще встречается у H.pylori-серопозитивных (73%), чем у H.pylori-негативных пациентов (32%); при выявлении сывороточных IgЕ-АТ к H.pylori она регистрируется в 92-94% случаев и ассоциирована с наличием более высоких концентраций цитотоксина CagА H.pylori в надосадочной жидкости проб фекалий. 4. Впервые установлена высокая частота выявления IgЕ-АТ к H.pylori (89-100%) и IgЕ-АТ к CagА H.pylori (65%-77%) в надосадочной жидкости проб фекалий у детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки. 5. У детей с аллергопатологией и хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны выявлена прямая корреляция между уровнем цитотоксина CagА H.pylori и IgЕ-АТ к H.pylori в надосадочной жидкости проб фекалий (r=+0,5; р<0,05) и отмечена высокая частота обнаружения ИЛ-17 по сравнению с больными без атопии. Практическая значимость Определение IgЕ-АТ к H.pylori в сыворотке крови детей, наряду с определением IgG-АТ и IgA-АТ (или суммарных АТ), можно рекомендовать для повышения эффективности серодиагностики H.pylori-инфекции в детской практике. Полученные данные о высокой частоте выявления IgE-АТ к H.pylori в надосадочной жидкости медицинской технологии проб фекалий неинвазивной инфекции. 4 обосновывают диагностики создание новой хеликобактерной Апробация материалов диссертации и публикации Материалы диссертации доложены на Всесоюзном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в 2009 г. Апробация диссертации состоялась 24 ноября 2010 г. на научной конференции отделов аллергологии и иммунологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Основные положения диссертации отражены в 4 печатных работах, 3 из них - в журнале, рекомендованном ВАК. Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 97 страницах машинописного текста, иллюстрированы 7 таблицами и 6 рисунками. Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 120 работ отечественных и зарубежных авторов. Содержание работы Материалы и методы исследования Обследовано 83 ребенка. Из них 69 детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и ДПК в стадии обострения проходили курс лечения на базе пульмонологического отделения ГКБ №1 и педиатрического отделения ДГКБ №1 г. Ульяновска. Критериями включения пациентов в исследование являлись наличие хронического заболевания желудка/ДПК в стадии обострения с эндоскопической верификацией диагноза; отсутствие или наличие подтвержденного аллергического заболевания. В исследование не включали требующими приема детей с нестероидных сопутствующими заболеваниями, противовоспалительных препаратов, сопровождающимися декомпенсацией жизненно важных функций организма, эндокринной патологией и оперативными вмешательствами на органах брюшной полости в анамнезе. Группу контроля (14 человек) составили практически здоровые дети того же возраста. Общее клиническое обследование пациентов включало сбор гастроэнтерологического и аллергологического анамнеза и жалоб, физикальное 5 исследование, клинические анализы крови, мочи и кала, ЭКГ, УЗИ органов брюшной полости, ЭГДС по общепринятым методикам. Инфицирование H. pylori в группах больных детей подтверждали при наличии положительных результатов не менее двух из нижеперечисленных методов: быстрый уреазный метод, аммонийный дыхательный тест, серологический метод. Материалом для иммунологического исследования служили: образцы сыворотки крови больных и здоровых детей; образцы экзосекрета ротовой полости и образцы надосадочной жидкости проб фекалий больных детей. Для получения надосадочной жидкости к пробам фекалий добавляли фосфатсодержащий буферный раствор (рН 7,4-7,6) в соотношении 1:1, образцы встряхивали, затем отделяли надосадочную жидкость центрифугированием при 1500 об/мин. Анализ уровня общего IgE, ИЛ-10, антихеликобактерных (IgG-, IgA-, IgM-) антител в сыворотке крови, sIgA в экзосекрете ротовой полости и копрофильтратах, ИЛ-17 в надосадочной жидкости проб фекалий проводили с помощью отечественных коммерческих ИФА-наборов в соответствии с Инструкцией по применению. Титры антихеликобактерных АТ подсчитывали путем перевода в log2. Анализ количественного содержания IgE-АТ к H.pylori в сыворотке крови и в надосадочной жидкости проб фекалий осуществляли методом ИФА с использованием конъюгата моноклональных анти-IgE-АТ (ООО «Полигност» Россия) и сорбированной корпускулярными антигенами H. pylori твердой фазы (ЭКОлаб – Россия). Количественный учет результатов проводили по калибровочной кривой, построенной с использованием IgE-референс реагентов фирмы «Dr. Fooke» (Германия). Выявление IgE-АТ к CagA H.pylori проводили аналогичным методом с использованием твердой фазы, сорбированной рекомбинантным rCagA fr4-антигеном в концентрации 1 мкг/мл. Содержание CagA H.pylori в надосадочной жидкости проб фекалий определяли методом двухцентрового 6 ИФА, с помощью двух типов моноклональных антител, распознающих разные эпитопы на молекуле CagA H.pylori. Стандартом служил контрольный образец rCagAfr.4 (Климович А.В. c соавт., 2010). Все реагенты и алгоритм исследования любезно предоставлены доктором медицинских наук М.П.Самойлович (Российский научный центр радиологии и хирургических технологий МЗ СР РФ). Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием непараметрических методов статистики при помощи пакета прикладных программ “Statistica 6,0” (StatSoft, USA). Результаты исследования и их обсуждение Обследовано 83 ребенка (37 мальчиков и 46 девочек), средний возраст которых составил Ме=14 (12; 16) лет. 69 детей имели хронические воспалительные заболевания желудка и/или ДПК в стадии обострения. 14 практически здоровых детей составили группу контроля. Эндоскопически у контингента больных выявили: ЯБ ДПК – у 8 человек (12%); эрозии желудка и/или ДПК – у 29 человек (41,6%); хронический (неэрозивный ) гастрит/гастродуоденит – у 32 человек (46,4%). 22 ребенка (32%), помимо гастродуоденальной патологии, имели подтвержденные аллергические заболевания: в фазе обострения – 12 детей, в фазе ремиссии – 10 детей. Аллергопатология была представлена бронхиальной астмой (9 человек), атопическим дерматитом (11 человек), аллергическим риноконъюнктивитом (2 человека). Следует отметить, что в структуре гастродуоденальной патологии у детей с аллергией преобладал ХГ/ХГД (в 91% случаев) и только у 2 детей с атопическим дерматитом при эндоскопии обнаружили ЯБ ДПК и эрозии ДПК. На основании инструментального клинико-анамнестических обследования данных сформированы исследования (Табл. 1.) 7 и группы лабораторнодетей для Таблица 1. Распределение обследуемых детей по группам. Группы Число детей Характер гастродуоденальной и сопутствующей патологии I 20 ХГ/ХГД + аллергия II 12 ХГ/ХГД III 35* ЯБ ДПК, эрозии желудка/ДПК IV 14 Практически здоровые дети *Двое детей, у которых ЯБ и эрозии СО гастродуоденальной зоны сочетались с аллергопатологией, не включены в III группу исследования. Клиническая картина ХГ/ХГД у детей с аллергией (I группа) характеризовалась слабо выраженной субъективной симптоматикой в 80% случаев и преобладанием диспепсического синдрома над болевым (Рис.1). 100% 100% 92% 100% 90% 80% 67% 70% 60% 50% 33% * 25% 40% ** 40% *** 37% Дисп. Боль Изжога 30% 10% 20% 10% 0% I II III Примечание:*р<0,02 по сравнению со II и III группами; **р<0,01 по сравнению с I и II группами; ***р<0,05 по сравнению с I группой. Рис.1. Частота встречаемости симптомов гастродуоденального заболевания в обследуемых группах. У детей с ХГ/ХГД без аллергии (II группа) отмечалось сочетание болевого и диспепсического синдромов при их слабой или умеренной выраженности. В III группе детей с деструктивными изменениями СО 8 превалировал болевой синдром, его выраженность была максимально высокой, что значительно сказывалось на общем самочувствии больных. Кроме того, пациентов этой группы чаще беспокоила изжога. Болезненность при пальпации живота, в эпигастральной и/или пилородуоденальной зоне, была характерна для 100% больных, что облегчало топическую диагностику. Положительный симптом Менделя отмечался у 57% (20) детей III группы. На рисунке 2 показана частота выявления различных нарушений моторной функции ЖКТ в ходе инструментального обследования больных детей. Примечание: *р<0,05; **р<0,01. Рис. 2. Частота встречаемости нарушений моторной функции ЖКТ по данным инструментальных методов исследования. Дискинезия ЖВП чаще отмечалась у больных без аллергии – во II и III группах. В III группе, кроме того, выявлена самая высокая частота дуоденогастрального рефлюкса (ДГР). Инфицирование H. pylori удалось подтвердить у 45% детей I группы, 75% детей II группы, 66% детей III группы. Следует отметить, что 19% всех больных (13 человек), по данным анамнеза, уже получали антихеликобактерную терапию, причем у пятерых эрадикацию проводили неоднократно с использованием разных медикаментозных схем. В настоящем исследовании у 10 (77%) из них вновь 9 подтверждено инфицирование Н. pylori, а у 8 (62%) детей выявлены ЯБ/эрозии СО желудка/ДПК. В среднем, от последнего курса эрадикационной терапии до момента наблюдения прошел Ме=1 (0,5; 1,5) год. Таким образом, данный контингент больных можно охарактеризовать неблагоприятным течением гастродуоденальных как группу лиц с заболеваний и низким эффектом от проводимой эрадикационной терапии. Далее, в рамках поставленных задач, мы определили некоторые показатели иммунного статуса обследуемых лиц. При исследовании содержания общего IgE в сыворотке крови детей (табл.2) выявлен повышенный в сравнении с возрастной нормой его уровень у лиц с аллергопатологией [Ме=189,6 (76,5; 334) МЕ/мл], что в целом подтверждает наличие у них атопической реактивности. Таблица 2. Содержание общего IgЕ в сыворотке крови детей. Показатели I гр. (n=20) II гр. (n=12) III гр. (n=35) IV гр. (n=14) P Концентрация IgЕ, МЕ/мл, Ме (25%;75%) 189,6 (76,5; 334) 28 (0,5; 64) 46,1 (17,3; 104,2) 22,8 (0; 22,6) P I- II,III,IV <0,01 Р III-IV=0,01 Частота выявления повышенного уровня IgE, %, (абс). 70% (14) 16% (2) 26% (9) 14% (2) P I- II,III,IV <0,01 У детей без атопии содержание общего IgE в сыворотке крови соответствовало возрастной норме. Однако обратила на себя внимание тенденция более частого выявления (26%) повышенного уровня общего IgЕ в сыворотке крови детей с деструктивным поражением СО гастродуоденальной зоны. При этом уровень общего сывороточного IgЕ у больных III группы был достоверно выше, чем у здоровых лиц. Следует отметить, что повышение концентрации общего IgE в сыворотке крови больных ЯБ при отсутствии признаков аллергического заболевания отмечали и другие авторы (Бельмер 10 С.В. с соавт., 2004; De Lazzari F. et al,1994). По мнению Saito H. (2009), конститутивное повышение уровня общего IgE в отсутствии симптомов аллергии определяется иммунным отклонением в дифференцировке CD4+Тлимфоцитов в пользу Тh2/Treg. Количество Treg при ЯБ часто снижено, чем, собственно, и объясняется высокий уровень общего IgE (Atherton J.C. et al, 2009). Далее в сыворотках крови детей определяли содержание ИЛ-10 – основного фактора роста всех популяций регуляторных Т-клеток. Показано, что Н. pylori опосредованно способствует повышению уровня ИЛ-10 через воздействие на дендритные клетки (Kao J.Y. et al, 2010). Однако роль ИЛ-10, как и самих Treg, при Н.pylori-ассоциированных заболеваниях до сих пор неясна и широко обсуждается в литературе. Показатели уровня ИЛ-10 в сыворотке крови детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и ДПК, представлены на рис. 3. Примечание: *р<0,05. Рис. 3. Концентрация ИЛ-10 в сыворотке крови больных детей. Концентрация сывороточного ИЛ-10 у детей с ЯБ и эрозиями СО желудка и ДПК (III группа) оказалась выше, чем у больных ХГ/ХГД как с 11 аллергией (I группа), так и без нее (II группа), и составила [МЕ=17,8 (15,1; 25,1) пг/мл]. При сравнении с нормальными показателями ИЛ-10, составляющими у взрослых 5 (0-31) пг/мл («Вектор-Бест», Россия), мы обнаружили повышение его уровня у 20% детей III группы, в то время как у детей I, II и IV групп исследования показатели ИЛ-10 соответствовали нормальным. Таким образом, ЯБ и эрозии СО гастродуоденальной зоны сопровождаются повышением уровня ИЛ-10 в сыворотке крови по сравнению с ХГ/ХГД у детей I и II групп. Возможно, усиление синтеза ИЛ-10 является в данном случае компенсаторным механизмом, направленным на подавление избыточных реакций иммунного воспаления в СО желудка и ДПК. Для характеристики гуморального иммунного ответа к Н. pylori у больных и здоровых детей нами были определены сывороточные антихеликобактерные антитела IgM-, IgА-, IgG- и IgЕ-изотипов. IgM-АТ к Н.pylori в сыворотке крови обнаружены в единичных случаях у детей II и III групп исследования (у 2 и 4 человек, соответственно), что объясняется быстрым переключением В-лимфоцитов с синтеза антихеликобактерных IgM-АТ в начальной стадии болезни на синтез АТ других изотипов (Шкитин В.А. с соавт., 2002). Антихеликобактерные IgG-АТ, напротив, обнаруживали довольно часто как в крови больных (40%, 50%, 43% серопозитивных лиц в I, II и III группах соответственно), так и здоровых лиц (50%), что косвенно свидетельствует о широком распространении инфекции Н.pylori среди детей школьного возраста. При этом титры IgG-АТ к Н.pylori (1:208; 1:208; 1:194; 1:208) во всех сравниваемых группах были практически одинаковыми. IgА-АТ к Н.pylori (табл. 3) с высокой частотой обнаруживали в сыворотке крови детей с заболеваниями гастродуоденальной зоны без аллергии (II, III группы), в то время как у детей с аллергией (I группа) IgА-АТ к Н. pylori 12 выявляли в 3-4 раза реже. Слабо выраженный IgА ответ к Н. pylori у большинства детей I группы отражает, по-видимому, низкую способность к выработке IgА в целом, что характерно для лиц с аллергическими заболеваниями (Leman Y., 2010). Титры IgА-АТ к Н.pylori в сыворотке крови здоровых лиц были ниже, чем у больных. У детей с ЯБ/эрозиями СО (III группа) титры антихеликобактерных IgА-АТ превышали таковые у пациентов с ХГ/ХГД (II группа). Таблица 3. Частота выявления и титр IgА-АТ к Н.pylori в сыворотке крови детей. Показатели Частота выявления IgААТ к Н.pylori, %, (абс). Титр IgА-АТ к Н.pylori, log2 Ме (25%;75%). I гр. (n=20) II гр. (n=12) III гр. (n=35) IV гр. (n=14) 20% (4) 83% (10) 57% (20) 43% (6) 1:194 1:147 1:194 1:125 7,6 (7,5; 8,6) 7,2 (7; 7,2) 7,6 (7,2; 8,4) 6,96 (6,9; 7,1) P P I-II,III<0,01 P II, IV<0,05 P II- I,III<0,05 P IV- I,II,III <0,05 Особый интерес представляло выявление IgЕ-АТ к Н.pylori в сыворотке крови детей, поскольку ранее такое исследование при Н.pylori- ассоциированных заболеваниях проводили только у взрослых больных (Чернуцкая С.П., 2009; Liutu M. с соавт., 2001). Как видно из таблицы 4, частота выявления IgЕ-АТ к Н.pylori в сыворотке крови была наиболее высокой у здоровых лиц (86%) и снижалась у детей с ХГ/ХГД до 75% и 65% во II и I группах, соответственно. У детей с язвенно-эрозивным поражением СО гастродуоденальной зоны (III группа) частота выявления IgЕ-АТ к Н. pylori составила 54%, что было достоверно ниже, чем у здоровых детей, а их концентрация [Ме=0,87 (0,71;1,48) МЕ/мл] 13 достоверно ниже, чем у здоровых лиц и у детей с аллергическими заболеваниями. Таблица 4. Частота выявления и уровень IgЕ-АТ к Н.pylori в сыворотке крови детей. Показатели I гр. (n=20) II гр. (n=12) III гр. (n=35) IV гр. (n=14) P Частота выявления IgЕАТ к Н.pylori, %, (абс.). 65% (13) 75% (9) 54% (19) 86% (12) P III- IV = 0,04 Уровень IgEАТ к Н.pylori, МЕ/мл, Ме (25%;75%). 1,84 (0,96;3,01) 0,85 (0,6; 1,13) 2,8 0,87 (0,71;1,48) (1,6; 3,4) P III- I, IV <0,05 Мы исследовали также содержание сывороточных IgЕ-АТ к H.pylori у больных, в анамнезе которых имелись повторные курсы эрадикации H.pylori без должной эффективности. Оказалось, что IgЕ-АТ к Н.pylori в сыворотке крови этих детей выявлялись значительно реже (30,7% против 86%, р=0,005) и в более низкой концентрации ([Ме=0,71 (0,6; 0,98) МЕ/мл] против [2,8 (1,6; 3,4) МЕ/мл], р=0,004), чем у здоровых. На рисунке 4 представлено содержание IgЕ-АТ к H.pylori в сыворотке крови детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и ДПК с учетом фазы аллергического процесса у лиц I группы исследования. Из графика видно, что при обострении аллергии концентрация IgЕ-АТ к H.pylori в сыворотке крови составила [Ме=2,99 (1,12; 3,53) МЕ/мл] и была достоверно выше, чем в ремиссии, а также выше, чем у больных без аллергической патологии (II и III группы). 14 Примечание: *р<0,05. Рис. 4. Концентрация IgЕ-АТ к H.pylori в сыворотке крови детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и ДПК. При сравнении частоты выявления антихеликобактерных IgМ-, IgG-, IgА-, IgЕ-АТ в сыворотке крови H.pylori – серопозитивных лиц было обнаружено, что у больных аллергическими заболеваниями IgЕ-ответ к H.pylori преобладал над IgА-ответом (81% и 25% серопозитивных лиц, соответственно). В то же время следует отметить, что у 2-х детей с атопией, имеющих язвенноэрозивные изменения СО ДПК, IgЕ-АТ к H.pylori в сыворотке крови выявлены не были. Таким образом, выявлены различия в содержании сывороточных IgЕ-АТ к H.pylori в зависимости от характера поражения СО желудка/ДПК и наличия атопии. У детей с аллергопатологией синтез IgЕ-АТ к H.pylori, вероятно, облегчен в силу атопической направленности иммунного ответа, что проявляется в высокой частоте обнаружения IgЕ-АТ к H.pylori на фоне снижения частоты выявления IgА-АТ к H.pylori и в повышении уровня IgЕ-АТ к H.pylori при обострении аллергического процесса. У детей без атопии обнаружение IgЕ-АТ к H.pylori можно объяснить переключением иммунного ответа на Тh2-тип при длительной персистенции микроба в ЖКТ. Продукция IgЕ-АТ к H.pylori может расцениваться как защитная реакция организма в 15 условиях хронического воспаления. Защитный эффект IgЕ-АТ к H.pylori подтверждается также их наличием в высоком проценте случаев в крови здоровых лиц. В целом, доля детей, серопозитивных по суммарным антителам к Н.pylori (IgM-, IgG-, IgA-, IgE-АТ), составила: в I группе - 80% (16), во II - 100% (12), в III - 86% (30), в IV - 86% (12). У части H.pylori-серопозитивных лиц антихеликобактерные АТ были представлены только IgE-изотипом: в I группе – у 6 человек, во II – у 2, в III – у 5, в IV – у 4 человек. Мы проанализировали, каким образом обнаружение антихеликобактерных IgЕ-АТ при серологическом исследовании больных соотносится с данными других методов диагностики Н.pylori. На рисунке 5 показана связь между наличием уреазной активности в быстром и дыхательном антихеликобактерных АТ в уреазных тестах сыворотке крови и детей обнаружением с хронической гастродуоденальной патологией. Примечание: *р<0,05 Рис.5. Наличие уреазной активности у H.pylori – серонегативных и H.pylori – серопозитивных лиц. У H.pylori – серонегативных лиц положительная уреазная активность отмечалась лишь в 33% случаев, в то время как у H.pylori-(IgM-, IgG-, IgA-) серопозитивных лиц - в 73,5%. При обнаружении IgE-АТ к H.pylori совпадение 16 с положительной уреазной активностью достигло 92%. При этом наличие в сыворотке крови только IgE-АТ к H.pylori при отсутствии антихеликобактерных АТ других изотипов также было ассоциировано с высокой частотой положительных уреазных тестов (94%). Учитывая, что в детском возрасте пороговые значения АТ к H.pylori ниже, чем у взрослых, а IgМ- и IgА-АТ не являются чувствительным индикатором H. pylori – инфицирования (Подусенко В.В., 2006), определение IgE-АТ к H.pylori можно рекомендовать при серодиагностике H.pylori в детской практике, особенно у детей с аллергопатологией, у которых IgE-АТ к H.pylori обнаруживаются чаще, чем все другие изотипы антихеликобактерных АТ. В данном исследовании определение IgE-АТ к H.pylori позволило увеличить частоту диагностики случаев хеликобактериоза у больных детей в целом на 27%, причем в группе детей с аллергическими заболеваниями прирост составил 67%. Для характеристики секреторного иммунитета больных детей в надосадочной жидкости проб фекалий и в экзосекрете ротовой полости мы определяли содержание секреторного IgА (sIgA) (Табл. 5). sIgA является важнейшим фактором защиты СО ЖКТ от патогенов: он обеспечивает иммунное исключение микроорганизмов, длительно сохраняет свою структуру и не расщепляется микробными протеазами (Денисов Н.Л. с соавт., 2007). В нашем исследовании у больных без атопии (II и III группы) уровень sIgA в экзосекрете ротовой полости превышал нормальные показатели (57-260 мкг/мл) в 50% и в 66% случаев, соответственно. У детей с аллергопатологией (I группа) повышение уровня sIgA по сравнению с нормой отмечалось существенно реже (в 15% случаев, р<0,05), а концентрация sIgA была ниже, чем у больных детей других групп. При сравнении уровня sIgA в надосадочной жидкости проб фекалий у детей с хронической гастродуоденальной патологией оказалось, что у лиц с ХГ/ХГД без аллергии 17 содержание sIgA выше, чем у больных ХГ/ХГД на фоне атопии и у детей с деструктивным поражением СО гастродуоденальной зоны. Таблица 5. Показатели sIgA у детей с гастродуоденальной патологией. Показатели sIgA Содержание sIgA в слюне (мкг/мл), Ме (25%;75%) Содержание sIgA в кале (мкг/мл), Ме (25%;75%) Группа I n= 20 Группа II n= 12 Группа III n= 35 Р 140,85 2247 1465 Р I,III = 0,04 (12,7; 550,7) (81; 4000) (131; 1463) 8,5 18,2 7 (0; 18,04) (13,3; 31,2) (0; 19,2) Р II-I,III<0,05 Так как обычно при длительном и/или рецидивирующем повреждении СО ЖКТ реагирует усилением продукции слизи синхронно с увеличением синтеза sIgA покровным эпителием (Денисов Н.Л. с соавт., 2007), обнаруженный нами высокий уровень sIgA в экзосекрете ротовой полости и в надосадочной жидкости проб фекалий у больных ХГ/ХГД, по-видимому, связан с защитной реакцией организма. Более низкая концентрация sIgA у детей с аллергопатологией отражает снижение системного синтеза IgА (Leman Y. 2010). По нашим данным, у детей с ЯБ и эрозиями СО желудка и ДПК содержание sIgA в надосадочной жидкости проб фекалий сопоставимо с таковым у аллергических больных и достоверно ниже, чем у детей с ХГ/ХГД. По мнению ряда авторов, при нарушении целостности эпителиального покрова желудка и ДПК мономерный IgA попадает в просвет пищеварительного тракта в обход секреторной транспортной системы, чем и объясняется возникновение дефицита sIgA у больных с деструктивными изменениями СО желудка и ДПК (Денисов Н.Л. с соавт., 2007, 2008). 18 В надосадочной жидкости проб фекалий детей с гастропатологией мы, кроме того, определили содержание ИЛ-17 – основного цитокина Тh17. Известно, что в норме Тh17 участвуют в защите от бактериальных и грибковых инфекций, дополняя Тh1-и Тh2-эффекты (Ramiro-Puig E.С., et al, 2008). Но если роль Тh1 и Тh2 при хеликобактериозе подробно изучена, то значение Тh17 и продуцируемого ими ИЛ-17 остается не вполне ясным. В настоящее время влияние ИЛ-17 активно изучается не только при Н.pylori-ассоциированных заболеваниях, но и при многих других патологических состояниях (аллергия, аутоиммунитет). В нашем исследовании частота выявления ИЛ-17 в надосадочной жидкости проб фекалий у больных I группы с аллергопатологией была выше чем у детей II и III группы без атопии (53% и 32%, соответственно; р<0,05). Это подтверждает данные литературы о более высоком содержании ИЛ-17 у пациентов с аллергическими заболеваниями, в частности, больных бронхиальной астмой, у которых ИЛ-17 вносит вклад в развитие аллергениндуцированной гиперреактивности респираторного тракта (Saito H., 2009). Защитная роль ИЛ-17 при хеликобактериозе была показана в исследованиях на мышиных моделях, в которых ИЛ-17-дефицитные мыши имели более высокую плотность колонизации СО желудка Н.pylori и более выраженное хроническое воспаление с моноядерной инфильтрацией, чем мыши дикой линии (Algood H.M. et al, 2009). В нашей работе высокая частота выявления ИЛ-17 у детей с аллергическими клиническим заболеваниями течением была хронической ассоциирована с гастродуоденальной благоприятным патологии: у большинства больных (91%) она была представлена ХГ/ХГД, и только у двух детей выявлены язвенно-эрозивные изменения СО ДПК. Учитывая, что более 99% всего IgE секретируется через эпителий ЖКТ в просвет кишки, где ему отводится роль защиты от паразитов, простейших и некоторых патогенных бактерий (Хаитов Р.М., 2000), особый интерес представляло выявление IgЕ-АТ к Н.pylori в содержимом кишечника. 19 Оказалось, что в надосадочной жидкости проб фекалий у детей с хроническими воспалительными заболеваниями желудка и ДПК IgЕ-АТ к Н.pylori и его цитотоксину CagA определяются с высокой частотой (соответственно, в I группе – в 89% и 65% случаев, во II – в 100% и 58%, в III группе – в 97% и 77% случаев). Полученные нами данные согласуются с результатами исследований, в которых отмечено увеличение доли IgЕ-содержащих плазматических клеток в СО ЖКТ при хеликобактериозе (Berczi L. et al, 2000; Ducat H. et al,1986). Повидимому, наличие IgЕ-АТ к Н.pylori гастродуоденальной патологией отражает в копрофильтратах детей с защитную реакцию организма, опосредуемую секреторным иммунитетом слизистой ЖКТ. Для характеристики патогенных свойств возбудителя в надосадочной жидкости проб фекалий больных хроническими воспалительными заболеваниями желудка и ДПК мы определили также содержание CagA Н.pylori. Известно, что белковый цитотоксин CagA вызывает альтерацию клеток покровного эпителия, а CagA+ штаммы Н.pylori ассоциированы с деструктивным поражением СО желудка/ДПК (Говорун В.М. с соавт., 2002; Кудрявцева Л.В. с соавт., 2004). Однако в нашем исследовании не удалось выявить различий по содержанию и уровню CagA Н.pylori в копрофильтратах больных детей разных групп. Так, CagA Н.pylori был обнаружен с частотой 47%, 40% и 51% в концентрации [Ме=1,05 (0,6; 1,9)], [0,8 (0,5; 0,98)] и [0,86 (0,6; 1,2)] мкг/мл в I, II и III группах, соответственно. Возможно, различные клинические варианты гастродуоденальной патологии обследуемых детей были в большей степени обусловлены свойствами макроорганизма, в том числе, особенностями иммунного ответа. Так, нами было обнаружено, что у детей с аллергопатологией концентрация IgE-АТ к Н.pylori в надосадочной жидкости проб фекалий находилась в прямой корреляционной зависимости от уровня CagA Н.pylori (r=0,5; р=0,03). При сопоставлении результатов определения CagA Н.pylori в надосадочной жидкости проб фекалий и результатов уреазных тестов мы установили, что частота выявления CagA Н.pylori не различается значимо у лиц 20 с положительной уреазной активностью (53% случаев) и у лиц с отрицательной уреазной активностью (36% случаев). Однако концентрация CagА в копрофильтратах лиц с положительной уреазной активностью была в два раза выше, чем у лиц с отрицательной уреазной активностью, и составила Ме=1 (0,6; 1,5) мкг/мл против 0,5 (0,4; 0,6) мкг/мл (р=0,03). Можно предположить, что малые концентрации CagA Н.pylori в копрофильтратах соответствовали низкой степени обсемененности СО Н.pylori, чем и объясняется отрицательный результат уреазных методов исследования. Итак, в соответствии с современными представлениями, характер течения Н.pylori-ассоциированных заболеваний во многом зависит от функционирования иммунной системы человека. В нашем исследовании мы показали роль системы IgE в защите от Н.pylori у детей. Защитный эффект IgEАТ к Н.pylori подтверждается высокой частотой их выявления в крови практически здоровых лиц и больных неэрозивным гастритом. В то же время, у детей с ЯБ и эрозиями СО гастродуоденальной зоны и у пациентов с низким эффектом от проведенной ранее антихеликобактерной терапии отмечается низкая частота выявления антихеликобактерных IgЕ-АТ. Мы полагаем, что у лиц с аллергией синтез IgЕ-АТ к H.pylori облегчен в силу атопической направленности иммунного ответа, и это проявляется в высокой частоте их обнаружения на фоне снижения частоты выявления IgА-АТ к H.pylori в сыворотке крови, а также в повышении уровня IgЕ-АТ к H.pylori в крови при обострении аллергического процесса. Специфичность антихеликобактерного IgЕ ответа подтверждается прямой зависимостью концентрации IgE-АТ к Н.pylori в копрофильтратах от уровня CagA Н.pylori (r=0,5; р=0,03). На течение Н.pylori – ассоциированных заболеваний оказывают влияние не только IgE-АТ, но и другие факторы, зависящие от типа иммунного реагирования, который, согласно гигиенической гипотезе, формируется в раннем детстве. Так, ИЛ-17 в нашем исследовании чаще выявляли у больных с аллергопатологией, для которых также было характерно наличие высоких 21 концентраций общего IgE и IgE-АТ к Н.pylori в сыворотке крови, что отражает Th2/Th17-направленность иммунного ответа (Saito H., 2009). При этом у детей с аллергическими заболеваниями отмечалась стертая клиническая симптоматика гастродуоденальной патологии, в структуре которой превалировали ХГ/ХГД. Высокая частота выявления различных изотипов антихеликобактерных АТ, в частности IgЕ- и IgА-АТ, а также высокие уровни sIgА были характерны для лиц с ХГ/ХГД без атопии. В то же время у детей с ЯБ и эрозиями СО была установлена низкая частота выявления IgE-АТ к Н.pylori и низкий уровень sIgА в копрофильтратах. При этом уровень ИЛ-10 в сыворотке крови у них был выше, чем у больных ХГ/ХГД, что, с одной стороны, может являться компенсаторным механизмом, а с другой – способствовать изменению активности эффекторных Т-лимфоцитов (Th1, Th2, Th17) и приводить, в частности, к снижению синтеза антихеликобактерных IgE-АТ. В этих условиях возможно проявление агрессивных свойств бактерии. Выводы 1. В структуре заболеваний гастродуоденальной зоны у детей с аллергопатологией случаев), которые превалируют протекают хронические со слабо гастродуодениты выраженной (в 91% субъективной симптоматикой и преобладанием диспепсического синдрома над болевым. У детей без атопии выраженность гастродуоденальных симптомов варьирует от умеренной - у лиц с хроническим гастродуоденитом, до сильной - у больных с деструктивным поражением желудка и/или двенадцатиперстной кишки. Для последних характерны максимальная выраженность болевого синдрома и частое нарушение моторной функции желудочно-кишечного тракта, проявляющееся изжогой, дуодено-гастральным рефлюксом, дискинезией желчевыводящих путей. 2. У детей с аллергопатологией и заболеваниями гастродуоденальной зоны на фоне повышенного уровня общего IgЕ антихеликобактерный IgЕ-ответ в сыворотке крови преобладает над IgА- (81% и 25% серопозитиных лиц, 22 соответственно), при этом уровень IgЕ-АТ к H.pylori увеличивается при обострении аллергического процесса. 3. У детей с язвенной болезнью и эрозиями слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, а также у детей с неэффективной эрадикацией H.pylori в анамнезе IgE-АТ к H.pylori в сыворотке крови выявляются реже, а их концентрация ниже, чем у здоровых (р<0,05). 4. Концентрация ИЛ-10 в сыворотке крови у детей с язвенной болезнью и эрозиями слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки выше, чем у больных хроническим гастродуоденитом с аллергией и без нее (р<0,05). 5. У больных хроническим гастродуоденитом на фоне атопической реактивности уровень sIgА в экзосекрете ротовой полости и в надосадочной жидкости проб фекалий ниже, чем у больных без атопии. 6. Выявление сывороточных IgЕ-АТ к H.pylori в комплексе с антителами других изотипов у детей с гастропатологией в 92-94% случаев сочетается с положительной уреазной активностью, которая ассоциирована с наличием высоких концентраций цитотоксина CagА H.pylori в надосадочной жидкости проб фекалий. 7. У детей с заболеваниями гастродуоденальной зоны в надосадочной жидкости проб фекалий с высокой частотой определяются IgЕ-АТ к H.pylori (89-100%) и его цитотоксину CagА (65%-77%), при этом у детей с атопической реактивностью отмечается прямая корреляция между уровнем CagА H.pylori и IgЕ-АТ к H.pylori (r=+0,5; р<0,5), а ИЛ-17 у них определяется чаще, чем у лиц без атопии. 23 Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Ильинцева Н.В. Мазурина С.А., Гервазиева В.Б. IgE-ответ к Helicobacter pylori у детей с поражением гастродуодепнальной зоны и сопутствующей аллергопатологией. Российский аллергологический журнал. 2010; №3, с.24-29. 2. Гервазиева В.Б., Чернуцкая С.П., Ильинцева Н.В. Особенности иммунного ответа к Helicobacter pylori у аллергических больных с гастропатологией. Материалы XШ Всероссийского научного форума с международным участием «Дни иммунологии в С-Петербурге».2009; с.350-351. 3. Агафонов В.Е., Ильинцева Н.В., Гервазиева В.Б. Особенности секреторного иммунитета желудочно-кишечного тракта. Российский аллергологический журнал. 2011, №1 с.14-24. 4. Агафонов В.Е., Мазурина С.А., Ильинцева Н.В., Гервазиева В.Б. Гуморальный ответ к антигенам Helicobacter pylori у детей с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки, аллергопатологией. Российский аллергологический с.103-104. 24 ассоциированными журнал. 2011; с №1,
