Экспрессия генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой
реклама
На правах рукописи Григорьева Оксана Юрьевна ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛ TLR9-ОПОСРЕДОВАННОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ПРИ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Научные руководители: доктор медицинских наук Ганковская Оксана Анатольевна доктор медицинских наук, профессор Лавров Вячеслав Федорович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Борисова Татьяна Константиновна доктор медицинских наук, профессор Ведущая учреждение организация: Государственное высшего профессионального Семенков Виктор Фадеевич бюджетное образования образовательное «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития России. Защита состоится «15» декабря 2011г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, Малый Казенный пер., д. 5а). Автореферат разослан «___» ноября 2011г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.В. Яковлева 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования В настоящее время герпесвирусные инфекции входят в число наиболее распространенных заболеваний. По данным литературы свыше 90% людей инфицировано одним или несколькими вирусами герпеса человека [Кицак В.Я., 2005; Исаков В.А., 2006; Харламова Ф.С., 2006; Сухих Г.Т., 2010]. Особое значение активная форма герпесвирусной инфекции приобретает у беременных. Первичное заражение будущей матери, например, вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), цитомегаловирусом (ЦМВ) или реактивация латентного вируса во время инфицированию беременности, плода, может невынашиванию, привести к возникновению внутриутробному генерализованной инфекции у новорожденного, гибели плода и др. [Краснопольский В.И., 2006; Макаров О.В., 2007; Anzivino E.,2009; Corey L.,2009]. Известно, что первой линией защиты организма от инфекционных агентов является система врожденного иммунитета [Clark R., 2005; Ганковская О.А., 2010; Ярилин А.А., 2011]. На фоне физиологического изменения баланса между системами врожденного и адаптивного иммунитета во время беременности факторы врожденного иммунитета приобретают особое значение в защите от патогенов [Gonzalez J., 2007; Сухих Г.Т., 2010]. Клетки системы врожденного иммунитета способны распознавать консервативные структуры, представленные у различных микроорганизмов. Среди распознающих структур, активирующих клеточное звено врожденного иммунитета, ключевая роль отводится Toll-подобным рецепторам (TLRs) [Takeda K., 2005; Ковальчук Л.В., 2006; Семенов Б.Ф., 2009]. Активация TLRs приводит к выработке эффекторных молекул (ИФНα/β, ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и др.), необходимых для защиты организма от инфекционных агентов, в том числе вирусов [Sandor F., 2005; Parker L., 2007; Gribar S., 2008]. Экспрессия TLRs показана на клетках врожденного иммунитета (макрофагах, дендритных клетках и др.), а также на эпителиальных клетках слизистых оболочек 4 дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, репродуктивной системы и т.д. [Sandor F., 2005; Aflatoonian R., 2008; Chang Z., 2010]. В клетках слизистой оболочки женского репродуктивного тракта выявлена экспрессия TLR1-10 [Fazeli A., 2005; Sonnex C., 2010]. Установлено, что при герпесвирусной инфекции особое значение имеет эндосомальный TLR9, который распознает неметилированные повторы CpG ДНК [Andersen J., 2006; Bowie A., 2007; Gill N., 2008]. Взаимодействие TLR9 c лигандом запускает сигнальный путь рецептора, что приводит к активации важнейшего транскрипционного фактора клетки – NF-κB, инициирующего процесс транскрипции генов провоспалительных цитокинов, хемокинов, молекул адгезии и некоторых других факторов системы врожденного иммунного ответа [Sandor F., 2005; Martin T., 2005; Семенов Б.Ф., 2009; Chang Z., 2010]. В последние годы в научной литературе стали все чаще появляться работы, указывающие на непосредственное участие иммунных механизмов в развитии различных осложнений беременности [Abrahams, 2006; Макаров О.В., 2007; Ганковская О.А., 2008]. Однако остается неисследованным TLR9-опосредованный сигнальный путь при герпесвирусной инфекции у беременных женщин. Изучение системы TLR-опосредованных сигнальных путей при активации факторов врожденного иммунитета у беременных с герпесвирусной патологией позволит на молекулярном уровне изучить патогенетические особенности развития инфекционного процесса, вызванного ВПГ-2, оценить степень участия иммунных механизмов в развитии осложнений беременности. Цель: изучение TLR9-опосредованного сигнального пути при моделировании герпесвирусной инфекции in vitro и в клетках слизистой оболочки цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией. Задачи: 1) Разработать на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) системы для количественного определения уровней экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα. 2) Изучить динамику экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках HeLa, инфицированных ВПГ-2 in vitro. 5 3) Исследовать TLR9-опосредованный сигнальный путь при блокировании NF-κB специфическим ингибитором (изохеленином) в культуре клеток HeLa, инфицированных ВПГ-2. 4) Определить уровни экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин с герпесвирусной патологией (ВПГ-2, ЦМВ). 5) Выявить корреляционную зависимость между уровнями экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин. 6) Провести сравнительный анализ экспрессии гена ФНОα в клетках слизистой цервикального канала и продукции ФНОα в сыворотке крови у женщин с нормально протекающей беременностью и беременностью на фоне герпесвирусной урогенитальной инфекции. Научная новизна Разработан подход к оценке TLR9-опосредованного сигнального пути, основанный на определении экспрессии генов рецептора TLR9, транскрипционного фактора NF-κB и эффекторной молекулы – ФНОα. Впервые показана активация TLR9-опосредованного сигнального пути в культуре клеток HeLa, инфицированных ВПГ-2. Впервые, используя специфический ингибитор NF-κB (изохеленин), доказано, что ВПГ-2-индуцированное повышение экспрессии гена ФНОα в клетках цервикального канала является следствием активации TLR9-опосредованного сигнального пути. Впервые определено увеличение экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией (УГИ). Впервые установлено наличие статистически значимой положительной корреляции между уровнями экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных. 6 Впервые показано, что увеличение экспрессии гена ФНОα в клетках слизистой цервикального канала сопровождается гиперпродукцией данного цитокина в сыворотке крови у беременных с герпесвирусной инфекцией. Практическая значимость работы На основе ПЦР в режиме реального времени разработаны лабораторные варианты систем, предназначенные для количественного определения экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα, позволяющие оценивать экспрессию генов компонентов TLR9-опосредованного сигнального пути. На основе культуры клеток HeLa создана модель герпесвирусной инфекции in vitro, с помощью которой возможна оценка факторов врожденного иммунитета в клетках цервикального канала. Положения, выносимые на защиту 1. Доказана ВПГ-2-индуцированная активация TLR9-опосредованного сигнального пути, приводящая к повышенной экспрессии гена ФНОα, в клетках цервикального канала in vitro. 2. Герпесвирусная урогенитальная инфекция вызывает повышение уровней экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных. Между показателями экспрессии исследуемых генов установлены положительные, статистически значимые корреляционные связи. 3. Активация TLR9-опосредованного сигнального пути в слизистой оболочке цервикального канала беременных сопровождается локальным с увеличением герпесвирусной экспрессии гена патологией ФНОα и гиперпродукцией данного цитокина в сыворотке крови. Внедрение результатов работы в практику Материалы диссертации в 2010-11 гг. использовались в педагогическом процессе (лекциях и семинарских занятиях) кафедры вирусологии ГБОУ ДПО 7 «Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Апробация работы Материалы диссертационной работы представлены на XIV Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011г.), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2007, 2010гг.), XVI Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2010г.), 29-th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Великобритания, Лондон, 2010г.), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008г.), III Международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2008г.), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006г.). Апробация диссертации состоялась 14 июня 2011 года на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. Публикации результатов исследования По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 135 источников, из которых 32 отечественных и 103 зарубежных. Работа выполнена на 120 страницах машинописного текста и иллюстрирована 6 таблицами и 17 рисунками. 8 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика клинических групп. Работа была проведена при сотрудничестве с кафедрой иммунологии РГМУ (зав. кафедрой, д.м.н., проф. Ковальчук Л. В., д.м.н., проф. Ганковская Л.В., к.м.н. Карташов Д.Д.) и кафедрой акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (зав. кафедрой, д.м.н., проф. Макаров О.В., д.м.н. Бахарева И.В., к.м.н. Романовская В.В., к.м.н. Кузнецов П.А., к.м.н. Гришук А.Ю.). Общее количество обследуемых беременных женщин составило 173 человека, среди них 119 беременных с урогенитальной инфекцией различного генеза и 54 беременных с физиологически протекающей беременностью и срочными родами, которые составили контрольную группу. Возраст обследуемых женщин составлял 24-34 лет, срок беременности – 27-33 недели гестации. Критериями отбора в контрольную группу служили следующие показатели: отсутствие воспалительных и инфекционных заболеваний, аутоиммунной и эндокринной патологии, гестоза. Беременные с УГИ были разделены на 4 группы в зависимости от этиологии урогенитальной инфекции: - группа беременных с герпесвирусной УГИ составили 99 женщины, у которых обнаружили ВПГ-2 (ЦМВ); - группа беременных с бактериальной УГИ составили 7 женщин с положительным анализом на Ureaplasma urealyticum и/или Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium; - группу беременных с грибковой УГИ составили 8 женщин с Candida albicans; - группа беременных со смешанной УГИ составили 5 женщин, у которых выявили бактериальную, вирусную и/или грибковую УГИ. В качестве клинического материала в работе использовали клетки слизистой цервикального канала и сыворотку крови здоровых беременных и беременных с УГИ различного генеза. 9 Обследуемые женщины являлись пациентами родильного отделения ГБ №8 (главный врач – Дуленков А.Б.) и женской консультации при роддоме №10 (главный врач – Озимковская Е.П.) г. Москвы. В данных медицинских учреждениях проводились комплексное клинико-лабораторное обследование женщин, анализы на наличие инфекций, забор клинического материала (клетки слизистой цервикального канала, сыворотка крови) и сбор данных анамнеза пациентов. Материалы и методы исследования Материалы. В работе использовали культуру клеток HeLa, которая представляет собой эпителиальные клетки, полученные из аденокарциномы цервикального канала человека. Культура клеток HeLa была любезно предоставлена сотрудником ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии Н.Ф. Гамалеи, к.б.н. Парфеновой Т.М. В проводимых экспериментах для заражения клеток использовали ВПГ-2 штамм MS (Национальная коллекция вирусов, Великобритания). Для блокирования TLR9-опосредованного сигнального пути в экспериментах in vitro применяли специфический ингибитор транскрипционного фактора NF-κB – изохеленин (Calbiochem, Германия). Методы. Ведение культуры клеток HeLa. Клетки HeLa поддерживали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащую 80мМ гентамицина (Ферейн, ПанЭко, Россия), 0,6М L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 10% эмбриональную сыворотку телят (HyClone, Великобритания). Клетки инкубировали при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2. Пересев культуры проводили через каждые 3-4 суток. Заражение культуры клеток HeLa. 48-и часовой монослой культуры клеток HeLa заражали ВПГ-2 в дозе 2,5 или 3,5 ТЦД50/0,1 мл и инкубировали в культуральной среде при температуре 37 С в атмосфере 5% СО2 в течение 1, 3, 6, 12 и 24 часов. Через указанные интервалы времени клетки лизировали, и затем из них выделяли РНК для последующего проведения реакций обратной транскрипции 10 и ПЦР в режиме реального времени с целью определения уровней экспрессии исследуемых генов. Для ингибирования NF-κB в клетках культуры HeLa в лунки с монослоем клеток добавляли 20µМ или 30µМ изохеленина (Calbiochem, Германия) и культивировали в атмосфере 5% СО2 при температуре 37С в течение 30 мин. Выделение РНК из клеток слизистой цервикального канала проводили с помощью метода кисло-фенольной экстракции [Херрингтон С., 1999]. РНК из клеток HeLa выделяли методом сорбции на силикагеле с использованием набора “Рибо-сорб” (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, АмплиСенс, Россия) согласно инструкции производителя. Выделенные образцы РНК хранили при температуре минус 70оС. Реакцию обратной транскрипции проводили согласно стандартным протоколам [Херрингтон С., 1999] с использованием Random праймеров (Синтол, Россия), 25 мМ дНТФ (Сибэнзим, Россия), 10-кратного SE-буфера для обратной транскриптазы M-MulV (Сибэнзим, Россия) и 5 е.а. M-MulV Обратной транскриптазы (Сибэнзим, Россия). Праймеры для обратной транскрипции были подобраны с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол (Россия). Полученные образцы кДНК хранили при температуре минус 70ºС. Для определения количества копий кДНК исследуемых генов проводили полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени. Для приготовления реакционной смеси использовали компоненты “Набора реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)” (Синтол, Россия), а также Hot Start Taq ДНК-полимераза (СибЭнзим, Россия). Реакционную смесь готовили согласно инструкции фирмы-производителя. ПЦР-РВ проводили в амплификаторах АНК-16 и АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, Россия), используя следующую программу: 50оС – 2 минуты; [60 – 64оС – 50 секунд; 95оС – 20 секунд] – 40 циклов. Результаты реакции рассчитывали с помощью программного обеспечения приборов. Подсчет копий кДНК исследуемого гена проводили относительно 106 копий гена β-актина. Количество копий гена β-актина определяли в ходе ПЦР в режиме реального 11 времени с использованием «Набора реактивов для обнаружения и определения кДНК β-актина человека» (Синтол, Россия). Используемые в ПЦР-РВ TaqMan зонды и праймеры были сконструированы с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол (Россия). Иммуноферментный анализ (ИФА). Концентрацию ФНОα в сыворотке крови беременных женщин определяли методом твердофазного ИФА с помощью диагностической тест-системы (BioSource, Бельгия, 0-1000 пг/мл). Анализ проводили согласно инструкции фирмы-производителя. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с помощью анализатора иммуноферментных реакций (Пикон, Россия). Статистическую обработку результатов проводили в рамках непараметрической базовой статистики с использованием критерия Манна-Уитни для сравнения двух выборок. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от среднего». Различия в группах рассматривались как значимые при р<0,05. Наличие статистически достоверной корреляции между уровнями экспрессии исследуемых генов оценивали по коэффициенту ранговой корреляции Спирмена [Гланц С., 1999]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка систем для количественного определения экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα методом ПЦР в режиме реального времени На первоначальном этапе исследования были разработаны лабораторные системы на основе ПЦР в режиме реального времени для количественного определения уровней экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα. Для этого были подобраны праймеры и зонды, определены оптимальные условия проведения реакций, построены калибровочные графики для стандартизации и количественной обработки полученных результатов. Данные системы использовались для определения динамики экспрессии исследуемых генов в модели герпесвирусной инфекции in vitro. Также с помощью разработанных систем были определены 12 уровни экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клинических образцах клеток цервикального канала беременных женщин. В таблице 1 представлены экспериментально установленные данные по разработанным системам. Таблица 1 Экспериментальные условия проведения ПЦР в режиме реального времени для определения экспрессии исследуемых генов Система Температура отжига праймеров, оС TLR9 64 Концентрация прямого праймера, пкмоль/мкл Концентрация обратного праймера, пкмоль/мкл Концентрация зонда, пкмоль/мкл Концентрация MgCl2, мМ 4,04 5,16 3,39 25 NF-κB 64 4,08 4,36 3,09 50 ФНОα 60 5,32 4,41 3,80 50 Экспрессия генов TLR9, NF-κB и ФНОα под действием ВПГ-2 в культуре клеток HeLa Уровни экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα эпителиальными клетками цервикального канала под действием ВПГ-2 оценивали in vitro в модели культуры клеток HeLa, инфицированной различными дозами ВПГ-2 (2,5 и 3,5 ТЦД50/0,1мл). В качестве контроля использовали неинфицированную культуру клеток HeLa. Относительные значения количества копий мРНК TLR9, NF-κB и ФНОα в неинфицированных клетках в динамике не имели статистически значимых различий по сравнению с данными показателями в “нулевой точке” эксперимента. Проведенные эксперименты показали, что под действием ВПГ-2 в клетках культуры HeLa значительно увеличивались уровни экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα с первых часов после заражения (рис. 1). 13 6000000 ** 700000 5000000 ** ** 600000 ** 4000000 ** ** 500000 3000000 ** ** * ** 2000000 ** * * 300000 1000000 ** ** * * * 200000 * 100000 0 А ** 400000 0ч 1ч 3ч 6ч 12ч 0 Б 24ч 0ч 4500000 1ч 3ч 6ч 12ч 24ч контроль 4000000 3500000 ВПГ-2 (3,5 ТЦД50/0,1мл) ** 3000000 ВПГ-2 (2,5 ТЦД50/0,1мл) 2500000 2000000 ** 1500000 ** * 1000000 * 500000 ** * 0 В 0ч 1ч 3ч 6ч 12ч 24ч Рис. 1. Динамика экспрессии генов TLR9 (A), NF-κB (Б) и ФНОα (В) в культуре клеток HeLa под действием ВПГ-2. По оси абсцисс – время после инфицирования клеток ВПГ-2. По оси ординат – относительное значение числа копий мРНК TLR9 (A), NF-κB (Б) и ФНОα (В). Различия между количеством копий мРНК в инфицированных клетках и в контроле достоверны на уровне значимости р<0,05 (*) или р<0,01 (**). Максимальные значения экспрессии генов TLR9 и NF-κB наблюдались через 3 часа после заражения клеток ВПГ-2. К 12-му часу эксперимента экспрессия генов TLR9 и NF-κB снижалась, но оставалась значительно выше по сравнению с данными показателями в контрольных клетках. Через 24 часа после заражения было 14 зафиксировано повторное повышение экспрессии гена NF-κB и TLR9 в клетках HeLa. Подобная динамика снижения экспрессии гена NF-κB с 6-й по 24-й час эксперимента, видимо, связана с тем, что в данный промежуток времени под действием ВПГ-2 увеличивается синтез ингибирующей субъединицы IκB, что было показано в исследованиях, проводимых на культуре клеток HCE [Li H., 2009]. Эти данные позволяют предположить, что повышение продукции ингибирующей субъединицы IκB в клетках подавляет процесс транскрипции и, соответственно, образования мРНК NF-κB. Вероятно, повышение продукции ингибирующей субъединицы IκB и снижение синтеза NF-κB под действием ВПГ-2 необходимо для предотвращения гиперпродукции провоспалительных цитокинов, поскольку связывание субъединицы IκB с NF-κB блокирует транскрипционный фактор и, как следствие, транскрипцию большого числа генов (провоспалительных цитокинов, хемокинов и др.). Максимальная экспрессия гена ФНОα была определена на 6-й час после инфицирования клеток. После достижения максимальных значений уровни экспрессии гена ФНОα снижались. Обобщая полученные результаты, можно отметить, что ВПГ-2 способствовал значительному увеличению экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα клетками цервикального канала с первых часов после инфицирования в модели in vitro. Кроме того, проведенные эксперименты показали, что в дальнейшем культура клеток HeLa может быть использована для изучения системы TLRs и сигнальных путей рецепторов на уровне клеток цервикального канала. Динамика экспрессии генов TLR9 и ФНОα под действием ВПГ-2 в культуре клеток HeLa при ингибировании NF-κB На следующем этапе для установления взаимосвязи между экспрессией генов TLR9, NF-κB и ФНОα был проведен ряд экспериментов по определению ВПГ-2индуцированной экспрессии исследуемых генов в клетках HeLa при блокировании TLR9-опосредованного сигнального пути специфическим ингибитором NF-κB (изохеленином). Проведенные эксперименты показали, что в присутствии 15 изохеленина динамика экспрессии генов TLR9 и ФНОα под действием ВПГ-2 в клетках HeLa менялась (рис. 2). 16000000 14000000 ** 12000000 10000000 8000000 6000000 ** 4000000 ** * * * 2000000 0 А 0ч 1ч 3ч 6ч 12ч 24ч 4000000 3500000 3000000 * 2500000 2000000 1500000 ** 1000000 500000 Б ** ** 6ч 12ч ** 0 0ч контроль 1ч В ПГ -2 3ч В ПГ -2+ изох еленин 20µМ 24ч В ПГ -2+ изох еленин 30µМ Рис. 2. Динамика экспрессии гена TLR9 (А) и ФНОα (Б) в культуре клеток HeLa под действием ВПГ-2 в присутствии специфического ингибитора NF-κB (изохеленина). По оси абсцисс – время после инфицирования клеток ВПГ-2. По оси ординат – относительное значение числа копий мРНК TLR9 (А) и ФНОα (Б). Различия между количеством копий мРНК в инфицированных клетках, обработанных изохеленином, по сравнению с необработанными, достоверны на уровне значимости р<0,01 (**) и р<0,05 (*). 16 При ингибировании NF-κB уровни экспрессии гена ФНОα в клетках, зараженных ВПГ-2, достоверно снижались по сравнению с аналогичными показателями в инфицированных клетках, в которые не добавляли изохеленин. Кроме того, при воздействии большей дозы изохеленина максимальная экспрессия ФНОα наблюдалась на 6 часов позже (через 12 часов после заражения). Таким образом, блокирование TLR9-опосредованного сигнального пути за счет ингибитора NF-κB (изохеленина) подавляет продукцию ФНОα в клетках, зараженных ВПГ-2. Снижение ВПГ-2-индуцированной экспрессии гена ФНОα при блокировании транскрипционного фактора свидетельствует о том, что синтез данного провоспалительного цитокина в инфицированных клетках цервикального канала является NF-κB-зависимым. При блокировании NF-κB максимальная экспрессия гена TLR9 также наблюдалась на 6-й час после инфицирования клеток (т.е. на 3 часа позже по сравнению с контрольными клетками). Однако уровень экспрессии гена TLR9 при этом был достоверно выше, чем в инфицированных клетках, не обработанных изохеленином, что позволяет предположить наличие так называемой обратной связи, как механизма регуляции экспрессии TLRs. Установленная взаимосвязь между экспрессией исследуемых генов подтверждает предположение о том, что ВПГ-2 в клетках цервикального канала активирует TLR9-опосредованный сигнальный путь, а также увеличивает синтез ФНОα, непосредственно оказывающего цитопатическое действие на инфицированные клетки. Экспрессия генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин Следующей задачей настоящего исследования было оценить экспрессию компонентов TLR9-опосредованного сигнального пути на локальном уровне при герпесвирусной урогенитальной инфекции беременных. Для этого были определены уровни экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала здоровых беременных и беременных с герпесвирусной инфекцией. В качестве групп сравнения использовали группы здоровых беременных и 17 беременных с бактериальной, грибковой и смешанной УГИ. В группе беременных с герпесвирусной инфекцией статистически достоверно увеличивались уровни экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα, в 5,7; 4,4 и 3 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой (рис. 3). Достоверного повышения уровня экспрессии гена TLR9 в группах сравнения не было выявлено. Установленное в ходе исследования увеличение экспрессии генов NF-κB и ФНОα у беременных с бактериальной, грибковой и смешанной УГИ, вероятно, объясняется активацией NF-κB за счет распознавания бактериальных и грибковых компонентов поверхностными TLRs. 800000 1800000 700000 1600000 * 600000 1400000 * 1200000 500000 * 1000000 400000 800000 300000 * 600000 200000 400000 100000 А 200000 0 Б 300000 0 здоровые беременные * 250000 * беременные с бактериальной УГИ 200000 * беременные со смешанной УГИ 150000 100000 50000 В беременные с грибковой УГИ беременные с герпесвируной инфекцией 0 Рис. 3. Экспрессия генов TLR9 (А), NF-κB (Б) и ФНОα (В) в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин. По оси ординат – относительное значение числа копий мРНК TLR9 (А), NF-κB (Б) и ФНОα (В). По оси ординат – клинические группы. Различия между количеством копий мРНК достоверны на уровне значимости р<0,05 (*). 18 Анализ показал наличие статистически значимой положительной корреляции между показателями экспрессии исследуемых генов, что свидетельствует о взаимосвязи между экспрессией генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала при герпесвирусной УГИ. Значения коэффициентов корреляции между уровнями экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных представлены в таблице 2. Таблица 2 Коэффициенты корреляции между уровнями экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала Анализируемые показатели экспрессии генов Коэффициент корреляции r TLR9 NF-κB 0,77 *(р ≤ 0,05) NF-κB ФНОα 0,64 *(р ≤ 0,05) TLR9 ФНОα 0,67 *(р ≤ 0,05) * – коэффициент корреляции r статистически достоверно отличается от нуля на уровне значимости р≤0,05 Обобщая полученные данные, можно сделать вывод, что при инфицировании ВПГ-2 происходит активация TLR9-опосредованного сигнального пути на уровне слизистой цервикального канала во время беременности. Герпесвирусная инфекция у беременных не только вызывает увеличение экспрессии гена ФНОα в клетках слизистой цервикального канала, но и повышает концентрацию цитокина на системном уровне. Проведенные исследования показали, что в группе беременных с герпесвирусной инфекцией концентрация ФНОα в сыворотке крови составила 125,2 ± 20,5 пкг/мл, тогда как в группе здоровых беременных ФНОα практически не определялся (6,2 ± 1,3 пкг/мл) (рис.4). 19 160 ** 140 120 100 80 60 40 20 0 здоровые беременные беременные с герпес вирус ной инфекцией Рис. 4. Концентрация ФНОα в сыворотке крови здоровых беременных и беременных с герпесвирусной инфекцией. По оси ординат – концентрация ФНОα, пкг/мл. По оси абсцисс – клинические группы. Различия в группах статистически достоверны на уровне значимости p<0,05 (*). Анализ данных по клиническим группам показал, что у беременных с герпесвирусной УГИ по сравнению с контрольной группой частота развития преждевременных родов была достоверно выше и составляла 53% (в России частота преждевременных родов составляет 7-10% от общего числа родов [Сидельникова В. М., 2005]). Вероятно, одним из механизмов развития преждевременных родов у беременных с герпесвирусной инфекций является ВПГ-2-индуцированное повышение выработки ФНОα. С учетом полученных результатов и данных литературы была составлена возможная схема участия механизмов врожденного иммунитета в патогенезе преждевременных родов у беременных с герпесвирусной инфекцией (рис. 5). Согласно данной схеме, при действии инфекционного агента (ВПГ-2, ЦМВ) происходит активация факторов врожденного иммунитета через систему TLRs, за счет распознавания белков оболочки вирионов и вирусной ДНК, соответственно, рецепторами TLR2 и TLR9. Активация факторов врожденного иммунитета заключается в повышенной продукции провоспалительных цитокинов и индукции воспалительных процессов в женском репродуктивном тракте. Острый 20 воспалительный внеклеточного простагландинов, процесс матрикса, в тканях сопровождается активацией способствующих протеаз изменением и протеинов увеличением синтеза развитию родовой преждевременному деятельности. Таким образом, под действием инфекционного агента запускается каскад воспалительных реакций, приводящий к активации миометрия, раскрытия шейки матки и преждевременному разрыву плодных оболочек, что в свою очередь, может стать причиной развития преждевременных родов [Макаров О.В.,2007; 2009; Koga K., 2010; Noguchi T., 2010; Riley J., 2010; Thaxton J., 2010]. Воздействие инфекционного агента (вирусная ДНК, белки оболочки ВПГ) Активация специфических рецепторов (TLR2,TLR9) Секреция провоспалительных цитокинов (ФНОα, ИЛ-1,6,8 и др.) Активация воспалительных процессов на уровне женского репродуктивного тракта ↑ Простагландинов Преждевременный разрыв плодных оболочек Активация миометрия Раскрытие шейки матки ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫЕ РОДЫ Рис. 5. Схема развития преждевременных родов при герпесвирусной урогенитальной инфекции у беременных женщин. Схема составлена на основе полученных результатов и данных литературы [Макаров О.В.,2007; Lyttle B., 2009; Patni S., 2009; Koga K., 2010; Noguchi T., 2010; Riley J., 2010; Thaxton J., 2010]. 21 Выявленные изменения в экспрессии генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках слизистой цервикального канала и повышенная продукция ФНОα в сыворотке крови у беременных с герпесвирусной инфекцией, вероятно, в комплексе могут служить прогностическими критериями течения беременности. Выводы 1) На основе ПЦР в режиме реального времени разработаны лабораторные варианты систем для количественного определения уровней экспрессии генов Toll-подобного рецептора 9, транскрипционного фактора NF-κB и провоспалительного цитокина ФНОα. 2) Установлено, что под действием ВПГ-2 увеличивается экспрессия генов TLR9, NF-κB и ФНОα в клетках HeLa, и максимальные значения экспрессии генов TLR9 и NF-κB достигаются на 3-ий час, гена ФНО – на 6-ой час после инфицирования клеток. 3) Доказано, что повышение экспрессии гена ФНОα под действием ВПГ-2 является следствием активации TLR9-опосредованного сигнального пути в клетках HeLa. 4) Определено, что в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией уровни экспрессии генов TLR-9, NF-κB и ФНОα увеличены в 5,6; 4,4 и 3,0 раза, соответственно. Между показателями экспрессии исследуемых генов установлены положительные, статистически значимые корреляционные связи. 5) Установлено, что в группе беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией повышение цервикального канала, экспрессии гена сопровождалось ФНОα в клетках значительным слизистой увеличением концентрации данного цитокина в сыворотке крови (до 125,2 ± 20,5 пкг/мл, относительно 6,2 ± 1,3 пкг/мл в сыворотке крови здоровых беременных). 6) Показано, что ВПГ-2-индуцированная активация TLR9-опосредованного сигнального пути в эпителиальных клетках цервикального канала коррелирует с повышенной частотой развития преждевременных родов. 22 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1) Ганковская О.А. Экспрессия Toll-подобных рецепторов у беременных женщин больных генитальным герпесом / Романовская В.В., Сомова О.Ю.* // Тезисы докладов Международной конференции «Генетика в России и в мире». – Москва 2006. - С.43. 2) Карташов Д.Д. Экспрессия генов -дефенсина 1 и -дефенсина 1 у беременных женщин с урогенитальной инфекцией / Кузнецов П.А. Сомова О.Ю.*, Ганковская О.А., Ганковская Л.В. // Сборник тезисов 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». – 2007. С.250. 3) Ганковская О.А. Анализ уровней экспрессии генов TLR9-сигнального пути при герпесвирусной инфекции во время беременности / Сомова О.Ю.*, Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф. // Российский иммунологический журнал. – 2008. - т.2(11). - №2-3. - С.286. 4) Сомова О.Ю.* Изучение экспрессии генов сигнального пути Toll-подобного рецептора 9 при герпесвирусной инфекции // Вестник РГМУ. Материалы III Международной Пироговской студенческой научной конференции. - 2008. - С.335. 5) Ганковская О.А. Исследование экспрессии генов TLR9, NF-kB, ФНОα в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной инфекцией / Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Сомова О.Ю.*, Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. – 2. – С.61-65. 6) Ганковская О.А. Toll-подобные рецепторы, распознающие лиганды вируса герпеса / Ганковская Л.В., Сомова О.Ю.*, Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. – 2. – С.108-111. 7) Сомова О.Ю.* Изучение экспрессии генов TLR9-опосредованного сигнального пути в клетках слизистой цервикального канала при герпесвирусной инфекции / Ганковская О.А. // Сборник тезисов 14-й Международной Пущинской школыконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». – 2010. - С.312. 8) Сомова О.Ю.* Динамика экспрессии молекул TLR9-опосредованного сигнального пути эпителиальными клетками цервикального канала под действием вируса простого герпеса 2 типа in vitro / Ганковская О.А., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Зверев В.В. // Российский иммунологический журнал. – 2011. - т.5(14). - №2. С.129-134. * - Сомова О.Ю. = Григорьева О.Ю.
