Оптимизация гетерологической экспрессии в дрожжах

Оптимизация гетерологической экспрессии в дрожжах-сахаромицетах
в условиях микрогравитации на примере синтеза HBS антигена вируса
гепатита В (Антиген)
Постановщик(-и): Щербаков Г.Я., д.м.н., профессор, Открытое акционерное общество
«Биопрепарат» (ОАО «Биопрепарат»); сопостановщик - ФГУП СПбНИИ вакцин и сывороток
ФМБА.
Экспедиции 13, 14, 15, 16, 17, 18 завершён
Область исследования Биологические объекты
Целью эксперимента является сравнительное изучение специфики гетерологической
экспрессии гена HbsAg вируса гепатита B в дрожжах S.cerevisiae в условиях
микрогравитации и земного притяжения и установление приемов оптимизации синтеза с
целью получения высококачественных штаммов дрожжей - продуцентов Hbs-антигена.
Hbs-антиген является основой для создания эффективной вакцины против гепатита В,
разработка средств профилактики которого в настоящее время является актуальной
задачей. Объектом исследования КЭ "Антиген" служили дрожжи-сахаромицеты,
рекомбинантные продуценты поверхностного антигена вируса гепатита B, испытавшие
влияние факторов космического полёта. В процессе работы проводились исследования
по культивированию дрожжей-сахаромицетов до и после экспонирования в условиях
микрогравитации на МКС, выделению и определению активности HBs-антигена, оценке
его митотической стабильности, определению уровня гетерогенности популяций.
Использовались микробиологические и биохимические методы. На РС МКС отправлялись
от 1 до 4-х пеналов с биообразцами и задавалась различная температурно-временная
циклограмма экспозиции. Биологический материал, используемый в космическом
эксперименте «Антиген» для изучения гетерологической экспрессии в дрожжахсахаромицетах в условиях микрогравитации на примере синтеза HBs-антигена вируса
гепатита B, представляет собой культуры производственных штаммов Saccharomyces
cerevisiae D24, S. cerevisiae D25, S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27 – продуцентов
поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg). Для космического эксперимента
клетки штаммов представлены в трёх вариантах: лиофильно высушенные, посеянные на
плотную среду YEPD и внесённые в жидкую среду YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Питательная среда для выращивания культур дрожжей). Экспериментальные лётные
серии представляют собой стерильно запаянные ампулы, содержащие 1 мл
лиофилизированной суспензии в среде YEPD с глицерином в соотношении 1 : 1.
КЭ «Антиген» проводился с использованием аппаратуры «Биоэкология». Укладка
«Биоэкология» включает в себя 4 пенала, предназначенных для транспортировки,
экспонирования и хранения биообъектов. Каждый из четырех пеналов «Биоэкология»
представляется собой контейнер, размещенный в чехле (Рисунок 1). В каждом пенале
размещается по двенадцать пробирок, в каждой пробирке - по 1 ампуле для лиофильно
высушенных материалов; 4 тубы, в каждой тубе – по 1 пробирке для биообъектов на
питательной среде; регистратор температуры (Рисунок 2).
1
Рисунок 1 - Пенал «Биоэкология».
Рисунок 2 - Регистратор температуры.
Использование результатов эксперимента на Земле
Космические эксперименты по использованным схемам расширяют представления о
функционировании микроорганизмов в частности и живой природы вообще. Кроме того,
использованные схемы экспериментов не требуют больших материальных затрат,
достаточно просты в исполнении и зависят только от правильного соблюдения сроков и
температурных режимов на борту. Изучение специфики и факторов стабильности
экспрессии гена Hbs-антигена вируса гепатита В в дрожжевых клетках является
актуальным для оптимизации крупномасштабного производства дрожжевой
рекомбинантной вакцины против гепатита В. По результатам КЭ "Антиген", в процессе
проведения которого получены высокоэффективные штаммы-продуценты, разработаны
технико-экономическое обоснование организации производства новой вакцины против
2
гепатита В на основе штаммов с улучшенными свойствами, предложения для поиска
инвесторов. На основании полученных данных разработаны технико-экономические
документы по разработке и созданию новой вакцины против гепатита В.
Использование результатов эксперимента для освоения космоса
Полученные результаты показывают возможность адекватного существования
микроорганизмов на борту космических кораблей в составе «биотехнологических
фабрик», которые в будущем будут сопровождать межпланетные длительные полёты.
Космические эксперименты продемонстрировали, что отбор культур микроорганизмов с
нужными свойствами можно вести и на Земле, и в космосе.
Результаты
Проведенный анализ полученных в результате космического эксперимента данных
подтвердил возможность применения новых способов селекции суперпродуцентов HBsантигена вируса гепатита B. На основе полученных данных можно сделать следующие
выводы: стабильность антигенных характеристик HBs-антигена не зависит от времени
хранения на Земле и в условиях полета и определяется главным образом свойствами
штамма и условиями постановки опытов.
Рисунок 3 - Укладка «Биоэкология» эксперимента «Антиген» на борту РС МКС.
Итогом многолетних исследований могут служить следующие выводы.
1. Нахождение на борту космического корабля дрожжей сахаромицетов в жидкой среде и
на поверхности плотного агара не является оптимальным. Тем не менее, лётные образцы
штаммов Saccharomyces cerevisiae могут быть взяты для дальнейшего анализа. Лиофильно
высушенные штаммы проявляют стабильность и устойчивость к стрессовым воздействиям
космического полета по этому признаку сохранения жизнеспособности.
2. Морфология клеток зависит от жизнеспособности жидких культур, а
регидратированные культуры лётных и наземных образцов на уровне светового
микроскопа явных отличий не имеют.
3. Уровень накопления биомассы разными штаммами S. cerevisiae при росте в жидкой
среде после пребывания в условиях космического полёта в лиофильно высушенном
3
состоянии снижается на 1–3 порядка в зависимости от штамма и, главным образом,
сроков полёта.
4. Стабильность антигенных характеристик HBs-антигена не зависит от времени хранения
на Земле и в условиях полета и определяется главным образом свойствами штамма. В
некоторых случаях длительное, более 6 месяцев, пребывание в условиях космического
полёта снижает антигенные характеристики штаммов S. cerevisiae.
5. Полученные в земных условиях данные по оптимизации параметров культивирования
некоторых штаммов-продуцентов сохраняют свою актуальность и для летных серий
штаммов: в модифицированной среде HPi' уменьшается максимальный урожай клеток
при сохранении значений титра антигена, что облегчает процесс очистки антигена.
6. При длительных полётах более 6 месяцев снижается митотическая стабильность
экспрессирующего вектора по признаку сохранения LEU+-фенотипа штаммов S. cerevisiae.
В то же время сохраняется тенденция более высокого уровня стабильности в случае
штаммов S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27.
7. По уровню синтеза вирусного антигена выявлены три фенотипические группы: со
среднестатистическими показателями экспрессии, с превышением уровня экспрессии на 2
титра и с уменьшением уровня экспрессии на 2 титра. С этими клонами ведется
дальнейшая селекционная работа и отбор перспективных вариантов.
8. В результате полученных экспериментальных данных по лиофильно высушенной
биомассе из ампулы, экспонировавшейся на МКС в течение 10 месяцев, после
предварительного пребывания в Космосе 1 недели, были отобраны клоны, показавшие
повышенную активность HBs-антигена вируса гепатита В. Из этих клонов была
приготовлена экспериментальная серия вакцины гепатита В, соответствующая всем
показателям качества и обладающая высокой активностью.
9. В процессе наземной селекции космических мутантов планируется стабилизировать
свойства продуцентов HBs-антигена, провести депонирование этих клонов в музее
производственных штаммов и на их основе отработать промышленную технологию
производства вакцины против гепатита В для нужд здравоохранения.
Публикации
Список публикаций в процессе редактирования.
4